Biologisch aktive Sekundärmetabolite aus Pflanzen und Pilzen : Phenanthro-Alkaloide ; phytotoxische Dioxolanone

Als Phenanthro-Alkaloide wird eine kleine Gruppe von pentacyclischen, auf dem Phenanthren-Strukturmotiv basierenden Indolizidinen sowie Chinolizidinen bezeichnet. Von Letztgenannten sind bisher fünf, von den homologen Phenanthroindolizidinen mehr als sechzig natürliche Vertreter gefunden worden. Das wohl bekannteste Alkaloid in dieser Gruppe ist das Indolizidin-Alkaloid Tylophorin, das beispielsweise aus Tylophora indica (Apocynaceae, "Hundsgiftgewächse") gewonnen werden kann. Tylophorin und verwandte Derivate besitzen potente biologische und physiologische Wirkungen. So entfalten sie sowohl antiinflammatorische als auch antineoplastische Effekte (wirksam auch bei MDR-Tumorzelllinien, MDR = "multi drug resistant").rnrnDas Ziel der vorliegenden Arbeit war es, neue Methoden zur Herstellung von Phenanthro-Alkaloiden und deren Derivaten zu entwickeln. Ausgehend von (S)-Prolin konnten sowohl (S)-(+)-Tylophorin (>99% ee) als auch ein bisher noch nicht beschriebenes Derivat, das sich durch eine deutlich geringere Lichtempfindlichkeit im Vergleich zu Tylophorin aus¬zeichnet, in 33%-iger Gesamtausbeute über neun lineare Stufen, hergestellt werden. Die Synthese von (R)-(-)-Tylophorin gelang in analoger Weise aus (R)-Prolin in 21%-iger Ausbeute (93% ee). Der Einsatz von Schutzgruppen war nicht notwendig.rnDer Schlüsselschritt ist in beiden Fällen eine Cyclisierung an eine C=N-Doppelbindung über freie Radikale, die bei der Synthese des neuen Derivats hochstereoselektiv zur Bildung des (13aS,14S) Diastereomers führt. Die Synthese von 7-Methoxycryptopleurin gelang durch eine ähnliche Synthesestrategie. rnrnZur Herstellung von Cryptopleurin ist zunächst ein neuer Syntheseweg für 9-(Hydroxymethyl)-2,3,6-trimethoxyphenanthren entwickelt worden. Dieser führt über den Aufbau eines Biphenylsystems durch palladiumkatalysierte Kreuzkupplung, eine anschließende COREY-FUCHS-Transformation und als Schlüsselschritt über eine Gold-NHC-Komplex katalysierte 6-endo-dig-Cyclisierung zum entsprechenden Phenanthren. Diese Ringschlussreaktion verläuft in gewünschter Weise regioselektiv unter Bildung des 2,3,6-trimethoxysubstituierten Phenanthrens. Die Bil¬dung des regioisomeren 2,3,8-Trimethoxyphenanthrens wird nicht beobachtet. Der Alkohol wird dann in fünf linearen Stufen (34%) in das Xanthogenat überführt, aus dem sich durch eine zweistufige Reaktionssequenz, bestehend aus einer Radikal¬cyclisierung nach ZARD und einer Reduktion mit LiAlH4 das extrem lichtempfindliche und hochtoxische Alkaloid (R)-(-)-Cryptopleurin gewinnen ließ (50%).rnNachdem beide Enantiomere und das Racemat von Tylophorin synthetisiert worden waren und zum Vergleich bereit standen, wurde Tylophorin aus Tylophora indica extrahiert. rnDie Motivation rührte unter anderem daher, dass in der bisherigen Literatur Unstimmigkeiten über das in der Natur vorkommende Enantiomer des Tylophorins herrschten. Vor Beginn dieser Arbeit ging man davon aus, dass in T. indica nur (R)-(-)-Tylophorin vorkommt und für die Diskrepanzen zwischen den berichteten Drehwerten von, aus Pflanzenmaterial isolierten und des synthetisierten Naturstoffs, dessen Zersetzung vor oder während der Messung verantwortlich ist. Dieser Effekt kann zwar auch beobachtet werden, jedoch trägt er nur in geringem Maße zur Erniederigung des Drehwertes bei. Schließlich sind Proben von synthetisiertem Tylophorin in gleichem Maße von der schnell eintretenden Oxidation des Alkaloids betroffen. Aus dem Rohextrakt ist Tylophorin durch RP-HPLC isoliert worden. Anschließend wurde die Probe mittels chiraler HPLC/MS analysiert. Durch den Vergleich mit den bereit stehenden synthetischen Proben von (R)- und (S)-Tylophorin konnte in dieser Arbeit erstmals experimentell belegt werden, dass es sich bei (−)-Tylophorin aus T. indica um ein scalemisches Gemisch im Verhältnis von 56:44 (R:S) handelt.rnrnDas Ziel dieses Teilprojektes war die Entwicklung einer Synthese für den bisher noch nicht synthetisch hergestellten phytotoxischen Sekundärmetabolit (+)-Phenguignardiasäure. Isoliert wurde diese Verbindung aus Guignardia bidwellii, dem Erreger der Schwarzfäule der Weinrebe. Die absolute Konfiguration des quartären Stereozentrums war zu Beginn dieser Arbeit nicht bekannt. Ausgehend von (R)-Phenylmilchsäure und 3-Phenylprop-2-in-1-ol gelang die Synthese beider Enantiomere des Dioxolanons in acht linearen Stufen. Sie liefert den experimentellen Beweis (ECD, Polarimetrie) für die (S)-Konfiguration von natürlicher (+)-Phenguignardiasäure.rnrn

Cytotoxicity and P-glycoprotein inhibition by cardiotonic steroids

Herzwirksame Glykoside sind in der Natur sowohl im Tier- als auch im Pflanzenreich zu finden und werden regelmäßig zur Therpaie von Herzinsuffizienz eingesetzt. In letzter Zeit belegten viele Studien, dass herzwirksame Glykoside vielversprechende Substanzen für die Behandlung von Krebs darstellen. Ihr Wirkmechanismus basiert auf der Hemmung der Na+/K+-ATPase. Die Na+/K+-ATPase spielt neuerdings eine wichtige Rolle in der Krebsbiologie, da sie viele relevante Signalwege beeinflusst. Multiresistenzen gegen Arzneimittel sind oftmals verantwortlich für das Scheitern einer Chemotherapie. Bei multi-drug-resistenten Tumoren erfolgt ein Transport der Chemotherapeutika aus der Krebszelle hinaus durch das Membranprotein P-Glykoprotein. In der vorliegenden Arbeit wurde die Zytotoxizität von 66 herzwirksamen Glykosiden und ihren Derivaten in sensitiven und resistenten Leukämie-Zellen getestet. Die Ergebnisse zeigen, dass diese Naturstoffe die Zell-Linien in verschiedenen molaren Bereichen abtöten. Allerdings waren die Resistenz-Indizes niedrig (d. h. die IC50 Werte waren in beiden Zell-Linien ähnlich). Die untersuchten 66 Substanzen besitzen eine große Vielfalt an chemischen Substituenten. Die Wirkung dieser Substituenten auf die Zytotoxizität wurde daher durch Struktur-Aktivitäts-Beziehung (SAR) erforscht. Des Weiteren wiesen quantitative Struktur-Aktivitäts-Beziehung (QSAR) und molekulares Docking darauf hin, dass die Na+/K+-ATPase in sensitiven und resistenten Zellen unterschiedlich stark exprimiert wird. Eine Herunterregulation der Na+/K+-ATPase in multi-drug-resistenten Zellen wurde durch Western Blot bestätigt und die Wirkung dieser auf relevante Signalwege durch Next-Generation-Sequenzierung weiter verfolgt. Dadurch konnte eine Verbindung zwischen der Überexpression von P-Glykoprotein und der Herunterregulation der Na+/K+-ATPase hergestellt werden. Der zweite Aspekt der Arbeit war die Hemmung von P-Glykoprotein durch herzwirksame Glykoside, welche durch Hochdurchsatz-Durchflusszytometrie getestet wurde. Sechs wirksame Glykoside konnten den P-Glykoprotein-vermittelten Transport von Doxorubicin inhibieren. Zudem konnte die Zytotoxität von Doxorubicin in multi-drug-resistenten Zellen teilweise wieder zurück erlangt werden. Unabhängig von herzwirksamen Glykosiden war die Bewertung der Anwendung von molekularem Docking in der P-Glykoprotein Forschung ein weiterer Aspekt der Arbeit. Es ließ sich schlussfolgern, dass molekulares Docking fähig ist, zwischen den verschiedenen Molekülen zu unterscheiden, die mit P-Glykoprotein interagieren. Die Anwendbarkeit von molekularem Docking in Bezug auf die Bestimmung der Bindestelle einer Substanz wurde ebenfalls untersucht.

In-vivo-Tumorbiologie mittels 68 Ga-PET: Beurteilung der p-Glykoprotein-Aktivität in Weichgewebe-Tumoren sowie Diagnose und Therapie von Knochenmetastasen

Krebs ist eine der häufigsten Krankheiten und stellt eine der wichtigsten medizinischen Herausforderungen des 21. Jahrhunderts dar. Eine frühzeitige Diagnose ist dabei essentiell für eine individuell angepasste Therapie zur Verbesserung der Lebensqualität und -erwartung der Patienten. Hierbei kommen der 68Ge/68Ga-Generator und das daraus resultierende PET-Nuklid 68Ga immer stärker in den Fokus von Wissenschaft und Medizin. rnrnFür eine erfolgreiche Therapie stellt die Chemoresistenz (Multi-Drug-Resistance) zahlreicher Tumore eine schwerwiegende Komplikation dar. Für das Therapieversagen ist die Aktivierung des Transportproteins p-Glykoprotein (pGP) maßgeblich mit verantwortlich. Mit Hilfe der Schiff’schen Base [68Ga]MFL6.MZ konnte die Aktivitätsänderung von pGP unter verschiedener Beeinflussung erstmals in vivo beobachtet werden. So zeigte sich, dass sich unter azidotischen Bedingungen in Tumoren die Aktivität des pGP erhöht und somit vermehrt auch Zytostatika, die pGP-Substrate sind, aus den Tumoren transportiert werden. Durch Aufklärung der Abhängigkeit der pGP-Aktivität von dessen Signalkaskade konnte gezeigt werden, dass durch eine Blockade der MAP-Kinase p38 eine Erniedrigung der pGP-Aktivität zu verzeichnen ist. Die ebenfalls in der Signalkaskade eingebundene MAP-Kinase ERK1/2 hingegen spielt hier nur eine untergeordnete Rolle.rnrnNeben dem Versagen der Chemotherapie stellt auch die Metastasierung eines Malignoms massive Einschnitte in die Lebensqualität von Erkrankten dar. Befallen die Metastasen das Skelett eines Menschen, wird dies zumeist erst spät registriert. 68Ga-markierte Bisphosphonate bieten nun die Möglichkeit, Patienten quantitativ auf Knochenmetastasen hin untersuchen zu können. So konnten zu Beginn einfache Phosphonate wie EDTMP und DOTP nicht die nötige in vivo Stabilität bzw. hohe radiochemische Ausbeuten liefern und sind damit für die Anwendung am Menschen uninteressant. Jedoch die DOTA-basierten Bisphosphonate allen voran der Ligand BPAMD zeigen ein großes Potential. In vivo-Versuche an Ratten mit Knochenmetastasen zeigten, dass sich [68Ga]BPAMD an den Metastasen anreichert und einen sehr guten Kontrast zum gesunden Knochen darstellt. Der Tracer konnte erstmals am Menschen angewendet werden und zeigte in ausgewählten Regionen eine höhere Anreicherung als eine zuvor durchgeführte PET-Aufnahme mit [18F]Fluorid. Der Ligand BPAMD bietet außerdem den Vorteil, neben 68Ga auch andere dreiwertige Radionuklide wie das therapeutische 177Lu komplexieren zu können. Durch Studien zur Komplexbildung und Stabilität konnte auch [177Lu]BPAMD in der klinischen Anwendung erprobt werden und zeigte eine Anreicherung an den Knochenmetastasen. So ist es nun möglich, Knochenmetastasen mittels 68Ga-PET zu diagnostizieren, eine entsprechende Dosisberechnung anzustellen und anschließend mit dem gleichen Liganden eine Therapie mit [177Lu]BPAMD durchzuführen.

Surface-plasmon optical and electrochemical characterization of biofunctional surface architectures

The development and characterization of biomolecule sensor formats based on the optical technique Surface Plasmon Resonance (SPR) Spectroscopy and electrochemical methods were investigated. The study can be divided into two parts of different scope. In the first part new novel detection schemes for labeled targets were developed on the basis of the investigations in Surface-plamon Field Enhanced Spectroscopy (SPFS). The first one is SPR fluorescence imaging formats, Surface-plamon Field Enhanced Fluorescence Microscopy (SPFM). Patterned self assembled monolayers (SAMs) were prepared and used to direct the spatial distribution of biomolecules immobilized on surfaces. Here the patterned monolayers would serve as molecular templates to secure different biomolecules to known locations on a surface. The binding processed of labeled target biomolecules from solution to sensor surface were visually and kinetically recorded by the fluorescence microscope, in which fluorescence was excited by the evanescent field of propagating plasmon surface polaritons. The second format which also originates from SPFS technique, Surface-plamon Field Enhanced Fluorescence Spectrometry (SPFSm), concerns the coupling of a fluorometry to normal SPR setup. A spectrograph mounted in place of photomultiplier or microscope can provide the information of fluorescence spectrum as well as fluorescence intensity. This study also firstly demonstrated the analytical combination of surface plasmon enhanced fluorescence detection with analyte tagged by semiconducting nano- crystals (QDs). Electrochemically addressable fabrication of DNA biosensor arrays in aqueous environment was also developed. An electrochemical method was introduced for the directed in-situ assembly of various specific oligonucleotide catcher probes onto different sensing elements of a multi-electrode array in the aqueous environment of a flow cell. Surface plasmon microscopy (SPM) is utilized for the on-line recording of the various functionalization steps. Hybridization reactions between targets from solution to the different surface-bound complementary probes are monitored by surface-plasmon field-enhanced fluorescence microscopy (SPFM) using targets that are either labeled with organic dyes or with semiconducting quantum dots for color-multiplexing. This study provides a new approach for the fabrication of (small) DNA arrays and the recording and quantitative evaluation of parallel hybridization reactions. In the second part of this work, the ideas of combining the SP optical and electrochemical characterization were extended to tethered bilayer lipid membrane (tBLM) format. Tethered bilayer lipid membranes provide a versatile model platform for the study of many membrane related processes. The thiolipids were firstly self-assembled on ultraflat gold substrates. Fusion of the monolayers with small unilamellar vesicles (SUVs) formed the distal layer and the membranes thus obtained have the sealing properties comparable to those of natural membranes. The fusion could be monitored optically by SPR as an increase in reflectivity (thickness) upon formation of the outer leaflet of the bilayer. With EIS, a drop in capacitance and a steady increase in resistance could be observed leading to a tightly sealing membrane with low leakage currents. The assembly of tBLMs and the subsequent incorporation of membrane proteins were investigated with respect to their potential use as a biosensing system. In the case of valinomycin the potassium transport mediated by the ion carrier could be shown by a decrease in resistance upon increasing potassium concentration. Potential mediation of membrane pores could be shown for the ion channel forming peptide alamethicin (Alm). It was shown that at high positive dc bias (cis negative) Alm channels stay at relatively low conductance levels and show higher permeability to potassium than to tetramethylammonium. The addition of inhibitor amiloride can partially block the Alm channels and results in increase of membrane resistance. tBLMs are robust and versatile model membrane architectures that can mimic certain properties of biological membranes. tBLMs with incorporated lipopolysaccharide (LPS) and lipid A mimicking bacteria membranes were used to probe the interactions of antibodies against LPS and to investigate the binding and incorporation of the small antimicrobial peptide V4. The influence of membrane composition and charge on the behavior of V4 was also probed. This study displays the possibility of using tBLM platform to record and valuate the efficiency or potency of numerous synthesized antimicrobial peptides as potential drug candidates.

Effect of drug physicochemical properties on the release from liposomal systems in vitro and in vivo

Liposomes were discovered about 40 years ago by A. Bangham and since then they became very versatile tools in biology, biochemistry and medicine. Liposomes are the smallest artificial vesicles of spherical shape that can be produced from natural untoxic phospholipids and cholesterol. Liposome vesicles can be used as drug carriers and become loaded with a great variety of molecules, such as small drug molecules, proteins, nucleotides and even plasmids. Due to the variability of liposomal compositions they can be used for a large number of applications. In this thesis the β-adrenoceptor antagonists propranolol, metoprolol, atenolol and pindolol, glucose, 18F-Fluorodeoxyglucose (FDG) and Er-DTPA were used for encapsulation in liposomes, characterization and in vitro release studies. Multilamellar vesicles (MLV), large unilamellar vesicles (LUV) and smaller unilamellar vesicles (SUV) were prepared using one of the following lipids: 1,2-Dimyristoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine (DMPC), 1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine (DSPC), Phospholipone 90H (Ph90H) or a mixture of DSPC and DMPC (1:1). The freeze thawing method was used for preparation of liposomes because it has three advantages (1) avoiding the use of chloroform, which is used in other methods and causes toxicity (2) it is a simple method and (3) it gives high entrapping efficiency. The percentage of entrapping efficiencies (EE) was different depending on the type and phase transition temperature (Tc) of the lipid used. The average particle size and particle size distribution of the prepared liposomes were determined using both dynamic light scattering (DLS) and laser diffraction analyzer (LDA). The average particle size of the prepared liposomes differs according to both liposomal type and lipid type. Dispersion and dialysis techniques were used for the study of the in vitro release of β-adrenoceptor antagonists. The in vitro release rate of β-adrenoceptor antagonists was increased from MLV to LUV to SUV. Regarding the lipid type, β-adrenoceptor antagonists exhibited different in vitro release pattern from one lipid to another. Two different concentrations (50 and 100mg/ml) of Ph90H were used for studying the effect of lipid concentration on the in vitro release of β-adrenoceptor antagonists. It was found that liposomes made from 50 mg/ml Ph90H exhibited higher release rates than liposomes made at 100 mg/ml Ph90H. Also glucose was encapsulated in MLV, LUV and SUV using 1,2-Dimyristoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine (DMPC), 1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine (DSPC), Phospholipone 90H (Ph90H), soybean lipid (Syb) or a mixture of DSPC and DMPC (1:1). The average particle size and size distribution were determined using laser diffraction analysis. It was found that both EE and average particle size differ depending on both lipid and liposomal types. The in vitro release of glucose from different types of liposomes was performed using a dispersion method. It was found that the in vitro release of glucose from different liposomes is dependent on the lipid type. 18F-FDG was encapsulated in MLV 1,2-Dimyristoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine (DMPC), 1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine (DSPC), Phospholipone 90H (Ph90H), soybean lipid (Syb) or a mixture of DSPC and DMPC (1:1). FDG-containing LUV and SUV were prepared using Ph90H lipid. The in vitro release of FDG from the different types of lipids was accomplished using a dispersion method. Results similar to that of glucose release were obtained. In vivo imaging of FDG in both uncapsulated FDG and FDG-containing MLV was performed in the brain and the whole body of rats using PET scanner. It was found that the release of FDG from FDG-containing MLV was sustained. In vitro-In vivo correlation was studied using the in vitro release data of FDG from liposomes and in vivo absorption data of FDG from injected liposomes using microPET. Erbium, which is a lanthanide metal, was used as a chelate with DTPA for encapsulation in SUV liposomes for the indirect radiation therapy of cancer. The liposomes were prepared using three different concentrations of soybean lipid (30, 50 and 70 mg/ml). The stability of Er-DTPA SUV liposomes was carried out by storage of the prepared liposomes at three different temperatures (4, 25 and 37 °C). It was found that the release of Er-DTPA complex is temperature dependent, the higher the temperature, the higher the release. There was an inverse relationship between the release of the Er-DTPA complex and the concentration of lipid.

Molecular mechanisms of shikonin and its derivatives in cancer therapy

The identification of molecular processes involved in cancer development and prognosis opened avenues for targeted therapies, which made treatment more tumor-specific and less toxic than conventional therapies. One important example is the epidermal growth factor receptor (EGFR) and EGFR-specific inhibitors (i.e. erlotinib). However, challenges such as drug resistance still remain in targeted therapies. Therefore, novel candidate compounds and new strategies are needed for improvement of therapy efficacy. Shikonin and its derivatives are cytotoxic constituents in traditional Chinese herbal medicine Zicao (Lithospermum erythrorhizin). In this study, we investigated the molecular mechanisms underlying the anti-cancer effects of shikonin and its derivatives in glioblastoma cells and leukemia cells. Most of shikonin derivatives showed strong cytotoxicity towards erlotinib-resistant glioblastoma cells, especially U87MG.ΔEGFR cells which overexpressed a deletion-activated EGFR (ΔEGFR). Moreover, shikonin and some derivatives worked synergistically with erlotinib in killing EGFR-overexpressing cells. Combination treatment with shikonin and erlotinib overcame the drug resistance of these cells to erlotinib. Western blotting analysis revealed that shikonin inhibited ΔEGFR phosphorylation and led to corresponding decreases in phosphorylation of EGFR downstream molecules. By means of Loewe additivity and Bliss independence drug interaction models, we found erlotinb and shikonin or its derivatives corporately suppressed ΔEGFR phosphorylation. We believed this to be a main mechanism responsible for their synergism in U87MG.ΔEGFR cells. In leukemia cells, which did not express EGFR, shikonin and its derivatives exhibited even greater cytotoxicity, suggesting the existence of other mechanisms. Microarray-based gene expression analysis uncovered the transcription factor c-MYC as the commonly deregulated molecule by shikonin and its derivatives. As validated by Western blotting analysis, DNA-binding assays and molecular docking, shikonin and its derivatives bound and inhibited c-MYC. Furthermore, the deregulation of ERK, JNK MAPK and AKT activity was closely associated with the reduction of c-MYC, indicating the involvement of these signaling molecules in shikonin-triggered c-MYC inactivation. In conclusion, the inhibition of EGFR signaling, synergism with erlotinib and targeting of c-MYC illustrate the multi-targeted feature of natural naphthoquinones such as shikonin and derivatives. This may open attractive possibilities for their use in a molecular targeted cancer therapy.