Analyse der Einweisungsdiagnose in einer universitären Schmerzambulanz unter dem besonderen Aspekt des Anteils therapiebedürftiger psychischer Störungen bei Patienten mit Rückenschmerzen, Morbus Sudeck, Phantomschmerzen sowie

Es wurde eine retrograde Analyse von Patientenakten der Schmerzambulanzder Klinik für Anästhesiologie der Universitätsklinik Mainz durchgeführt, indie alle Patienten mit bestimmten Einschlußkriterien derBehandlungsjahrgänge1996 und 1997 aufgenommen wurden.Dies waren die vier Diagnosegruppen multilokuläre Schmerzen,Rückenschmerzen, Phantomschmerz und Morbus Sudeck (SRD). Das Ziel dervorliegenden Arbeit war die Frage nach der Häufigkeit von Psychotherapie alsergänzende Therapieempfehlung seitens der Schmerzambulanz herauszuarbeiten.Psychotherapie (ambulant, stationär, Bestandteil vonRehabilitationsaufenthalten) in vielgestaltiger Weise wurde häufigerempfohlen, 1. je länger die Schmerzerkrankung bestand,2. je jünger die Patienten waren,3. je länger sie arbeitsunfähig waren,4. wenn belastende biographische Ereignisse festgestellt werden konnten5. je höher das Chronifizierungsstadium nach Gerbershagen war. Im Einzelnenspielten die zeitlichen Aspekte der Erkrankung, Lokalisationseinflüsse sowieAspekte vorheriger Behandlungen und schmerzbedingter Krankenhausaufenthalteeine besondere Rolle.6. wenn Patienten nicht berentet waren.

Der Einfluss der Zellalterung auf die pathobiochemischen Prozesse von Morbus Alzheimer und weiteren neurodegenerativen Erkrankungen

Die am häufigsten auftretende altersassoziierte neurodegenerative Krankheit ist die Alzheimer Demenz. Ein mit entscheidender Schritt bei der Entstehung der Alzheimer Erkrankung ist wahrscheinlich die Produktion des Aβ-Peptids durch proteolytische Spaltung das Amyloid-Vorläuferproteins APP. In der vorliegenden Arbeit wurde die altersabhängige Prozessierung des Amyloid-Vorläuferproteins (APP) in Fibroblasten von Hautbiopsien von Familiärer Alzheimer-, Trisomie21 und Niemann-Pick Typ C-Krankheit untersucht. Die in dieser Arbeit verwendeten Fibroblasten wurden bis zum Erreichen des zellulären Wachstumsstopps (replikative Seneszenz) seriell passagiert und die Untersuchungen erfolgten an Zellen aufsteigender PDL. Dabei zeigte sich, dass, unabhängig von dem durch die Krankheit vorliegenden genetischen biochemischen Hintergrund, die APP-Prozessierung im Laufe der Zellalterung progressiv verringert wird. Die altersabhängig ansteigenden Cholesterinspiegel führten zu einer Reduktion der APP-Reifung und infolge dessen nahmen sowohl die intrazellulären APP-Spaltfragmente (C99, C83 und AICD) als auch die extrazellulären APP-Fragmente (sAPPα, sAPP) ab. Ebenso konnte gezeigt werden, dass die γ-Sekretase-Aktivität abnimmt. Dies war verbunden mit einem Rückgang der Proteinspiegel von Nicastrin und Presenilin, beides Komponenten des γ-Sekretase-Komplexes. Obwohl die Proteinexpression der α-Sekretase ADAM10 altersassoziiert konstant blieb, nahm die α-Sekretase-Aktivität mit steigendem Lebensalter ab. Erste Untersuchungen zeigten, dass die NAD+-abhängige Histon-Deacetylase SIRT1 eine wichtige Rolle im Bezug auf die α-Sekretase-Aktivität spielen könnte. Im Gegensatz zu den Abnahmen der α- und γ-Sekretase-Aktivitäten konnte eine erhöhte Aktivität der β-Sekretase in seneszenten Zellen beobachtet werden. Die mRNA-Menge und Proteinspiegel der ß-Sekretase BACE1 blieben dabei unverändert. Des Weiteren zeigte sich eine Zunahme der β-Sekretase-Aktivität bei Behandlung von jungen Zellen mit konditioniertem Medium seneszenter Zellen. Da sensezente Zellen einem Proliferationsstopp in der G1-Phase unterliegen, wurde der Einfluss des Zellzyklus-Inhibitors Aphidicolin auf die β-Sekretase untersucht. Hier wurde sowohl in IMR90 Fibroblasten als auch in Neuroblastoma-Zellen N2a eine Zunahme der β-Sekretase-Aktivität nach Zugabe der Inhibitoren beobachtet. Auch kommt es im Zuge der Alterung zu einer verstärkten Expression inflammatorischer Zytokine, die mit der Entstehung von Aβ-Peptiden in Verbindung gebracht werden. Deshalb wurde der Einfluss von Zytokinen auf die β-Sekretase-Aktivität untersucht. Die Zugabe von Interferon-γ und Interleukin 6 führte bei jungen IMR90-Zellen zu einem Anstieg der β-Sekretase-Aktivität, während bei alten Zellen keine Änderung zu verzeichnen war.

Thermal excitations of optical nanofibers measured with a fiber-integrated Fabry-Pérot cavity

Efficient coupling of light to quantum emitters, such as atoms, molecules or quantum dots, is one of the great challenges in current research. The interaction can be strongly enhanced by coupling the emitter to the eva-nescent field of subwavelength dielectric waveguides that offer strong lateral confinement of the guided light. In this context subwavelength diameter optical nanofibers as part of a tapered optical fiber (TOF) have proven to be powerful tool which also provide an efficient transfer of the light from the interaction region to an optical bus, that is to say, from the nanofiber to an optical fiber. rnAnother approach towards enhancing light–matter interaction is to employ an optical resonator in which the light is circulating and thus passes the emitters many times. Here, both approaches are combined by experi-mentally realizing a microresonator with an integrated nanofiber waist. This is achieved by building a fiber-integrated Fabry-Pérot type resonator from two fiber Bragg grating mirrors with a stop-band near the cesium D2-line wavelength. The characteristics of this resonator fulfill the requirements of nonlinear optics, optical sensing, and cavity quantum electrodynamics in the strong-coupling regime. Together with its advantageous features, such as a constant high coupling strength over a large volume, tunability, high transmission outside the mirror stop band, and a monolithic design, this resonator is a promising tool for experiments with nanofiber-coupled atomic ensembles in the strong-coupling regime. rnThe resonator's high sensitivity to the optical properties of the nanofiber provides a probe for changes of phys-ical parameters that affect the guided optical mode, e.g., the temperature via the thermo-optic effect of silica. Utilizing this detection scheme, the thermalization dynamics due to far-field heat radiation of a nanofiber is studied over a large temperature range. This investigation provides, for the first time, a measurement of the total radiated power of an object with a diameter smaller than all absorption lengths in the thermal spectrum at the level of a single object of deterministic shape and material. The results show excellent agreement with an ab initio thermodynamic model that considers heat radiation as a volumetric effect and that takes the emitter shape and size relative to the emission wavelength into account. Modeling and investigating the thermalization of microscopic objects with arbitrary shape from first principles is of fundamental interest and has important applications, such as heat management in nano-devices or radiative forcing of aerosols in Earth's climate system. rnUsing a similar method, the effect of the TOF's mechanical modes on the polarization and phase of the fiber-guided light is studied. The measurement results show that in typical TOFs these quantities exhibit high-frequency thermal fluctuations. They originate from high-Q torsional oscillations that couple to the nanofiber-guided light via the strain-optic effect. An ab-initio opto-mechanical model of the TOF is developed that provides an accurate quantitative prediction for the mode spectrum and the mechanically induced polarization and phase fluctuations. These high-frequency fluctuations may limit the ultimate ideality of fiber-coupling into photonic structures. Furthermore, first estimations show that they may currently limit the storage time of nanofiber-based atom traps. The model, on the other hand, provides a method to design TOFs with tailored mechanical properties in order to meet experimental requirements. rn

Morbus Hunter : Neutralisationskapazität von Antikörpern unter Enzymersatztherapie und deren klinischen Auswirkungen

Morbus Hunter, eine lysosomale Speicherkrankheit, ist eine seltene, progrediente, x-chromosomal vererbte Stoffwechselkrankheit, die durch ein Defizit an Iduronat-2-sulfatase (IDS) hervorgerufen wird. Als Folge daraus erfolgt kein Abbau von Heparan- und Dermatansulfat und die Glykosaminoglykane reichern sich in de Lysosomen der Zelle an. M. Hunter ist eine Multisystemerkrankung und weist ein breites klinisches Spektrum mit interindividuell unterschiedlichem Krankheitsbeginn, Ausprägungen und Progression der Symptome auf. Seit 2007 besteht die Therapieoption einer Enzymersatztherapie (ERT) mit Elaprase®. Einige Patienten entwickeln Antikörper gegen das substituierte Enzym, welche partiell neutralisierende Eigenschaften besitzen. Ziel dieser Untersuchung war es zu klären, ob die Neutralisationskapazität der gebildeten Antikörper mittels einer Bestimmung im Mischserum festgestellt werden kann und ob persistierende Antikörper mit Neutralisationskapazität zu einer Einschränkung der Wirksamkeit der Enzymersatztherapie führen. Es sollte weiterhin untersucht werden, ob sich mittels Messung der neuronenspezifischen Enolase (NSE) und S-100 Rückschlüsse auf eine neuropathische Beteiligung ziehen lassen, da bis jetzt noch keine klinische oder biochemische Messmethode existiert, die für M. Hunter-Patienten eine verlässliche Vorhersage für eine neuropathische Beteiligung bietet. 30 Patienten wurden in die retrospektive/prospektive Kohortenstudie eingeschlossen. Bei der Bestimmung der IDS-Aktivität im Mischserum mit einem gesunden Menschen zeigten fünf der Patienten (17%) in zwölf Mischseren eine um ≥ 40% reduzierte Aktivität. Zwei (7%) der 30 untersuchten Patienten wurden mit dieser Methode als positiv für persistierende neutralisierende Antikörper identifiziert. Zum gleichen Ergebnis bezüglich der persistierenden neutralisierenden Antikörper führten die Anti-Elaprase®-Immunglobulin-Bestimmungen unter Berücksichtigung des Bestimmungszeitpunkts, die bei Shire Pharmaceuticals durchgeführt wurden. Die Untersuchungsergebnisse lassen den Schluss zu, dass die gebildeten Antikörper auch intraindividuell unterschiedlich sind. Zudem interagieren sie mit den verschiedensten Epitopen des Enzyms der ERT und besitzen nicht alle neutralisierende Eigenschaften. Aufgrund der heterogenen Zusammensetzung folgt die Hemmung der Enzymaktivität vermutlich keiner eindeutigen Kinetik. Anti-Elaprase®-Immunglobulin G spielt für die Neutralisationskapazität jedoch eine wichtige Rolle. Die Auswertung und Beurteilung der Einschränkung der Wirksamkeit der Therapie hervorgerufen durch die Antikörper mit Neutralisationskapazität gestaltete sich kompliziert. Im Ergebnis zeigte sich, dass sich die beiden Patienten mit persistierenden neutralisierenden Antikörpern in der Entwicklung der klinischen Parameter interindividuell stark unterschieden. Um einen Zusammenhang zwischen klinischem Verlauf und Antikörperbildung gegen die ERT zu finden, müssen in einem größeren Patientenkollektiv mehr Patienten mit persistierenden neutralisierenden Antikörpern identifiziert werden und der Einfluss der Antikörper untersucht werden. Die Untersuchung der NSE und S-100 ergab, dass weder die Konzentration der NSE noch der S-100 Rückschlüsse auf die neuropathische Beteiligung des Patienten zulässt.

Synthese, n.c.a. 18F-Markierung und Evaluierung von Antagonisten der Strychnin-unempfindlichen-Glycinbindungsstelle auf Basis der 4-Amino-5,7-Dichlor-1,2,3,4-Tetrahydro-Chinolin-2-Carbonsäure

ZUSAMMENFASSUNGDer glutamaterge N-Methyl-D-aspartat-Rezeptor (NMDA) ist ein wichtiger ionotroper Rezeptor, der die exzitatorische synaptische Transmission im zentralen Nervensystem von Säugetieren vermittelt. Der NMDA-Rezeptor nimmt unter den Glutamatrezeptoren dabei eine Sonderstellung ein, da er mit einer Reihe von neurodegenerativen Erkrankungen wie dem Morbus Parkinson, dem Morbus Huntington, dem Morbus Alzheimer, der Schizophrenie und der Epilepsie in Zusammenhang gebracht wird. Daher besteht ein großes Interesse an der Entwicklung geeigneter 18F-markierter NMDA-Rezeptorliganden zur nicht-invasiven Visualisierung des NMDA-Rezeptorkomplexes mittels der Positronenemissionstomographie.Die 19F-Analoga ADTC1, tADTC1 und tADTC3 - 5 und das nicht-fluorierte 12C-Analogon tADTC2 wurden synthetisiert und ihre in-vitro Affinität und Lipophilie bestimmt. Mit Ausnahme von ADTC1 und tADTC5 die mikromolare Affinitäten besitzen, haben die Liganden in [H-3]MDL-105,519 Rezeptorbindungsassays niedrige nanomolare Affinitäten für die Glycinbindungsstelle. Die Lipophilie der Verbindungen wurde mit drei verschiedenen Verfahren untersucht und ergab logD7,4-Werte von ungefähr 1 für cADTC1 und tADTC1 – 4, während tADTC5 mit einem logD7,4 von –1,15 eine sehr niedrige Lipophilie aufwies. Die Radiosynthesen der 18F-Liganden wurden hinsichtlich der Umsetzung der Markierungsvorläufer mit 2-[F-18]Fluorethyltosylat oder [F-18]Fluorid untersucht und optimiert. Die höchsten radiochemischen Ausbeuten von ungefähr 90% wurden, unter Verwendung von NaOH als Hilfsbase, bei der 18F-Fluorethylierung von t[F-18]ADTC4 und t[F-18]ADTC5 mit 2-[F-18]Fluorethyltosylat erzielt.

Proteolyse des Amyloid-Vorläufer-Protein-verwandten APLP2 durch alpha-Sekretasen

Die im Laufe der Evolution konservierte Genfamilie des Amyloid-Vorläufer-Proteins APP beinhaltet sowohl bei der Maus als auch beim Menschen die beiden APP-ähnlichen ProteineAPLP1 und APLP2. Ziel dieser Arbeit war es, die proteolytische Prozessierung des APLP2 zu charakterisieren und die beteiligten Proteasen aufzuzeigen. Ausgehend von Stimulations- und Inhibitionsversuchen wurde die Metzincin-Familie der Metalloproteinasen als APLP2-Proteasen identifiziert. Durch Überexpression von ADAM10 und TACE (ADAM17) konnten zwei wichtige Prozessierungs-Enzyme des APLP2 charakterisiert werden. Damit wurde zum ersten Mal eine α-Sekretase-ähnliche Enzymaktivität analog zu der Spaltung des APP an APLP2 beschrieben. Untersuchungen an ADAM10-transgenen Mäusen bestätigten die proteolytische Prozessierung des APLP2 in vivo. Durch die Untersuchung neuronaler Differenzierung mit Retinsäure und Apoptose in Neuroblastoma-Zellen gelang der Nachweis einer funktionellen Koregulation von APLP2 und seiner Protease ADAM10, die zu einer erhöhten Freisetzung des neurotrophen löslichen APLP2 bei der Differenzierung und zu einer Reduktion bei Apoptose führt. In den Gehirnen von Alzheimer-Patienten gibt es sowohl Hinweise auf einen gestörten Vitamin A Metabolismus als auch auf verstärkte apoptotische Vorgänge, so dass hier erstmalig eine Verknüpfung der APLP2-Proteolyse mit zwei pathogenen Prozessen des Morbus Alzheimergezeigt werden konnten. Eine therapeutische Aktivierung der α-Sekretasen hätte die verstärkte Bildung von neurotrophem APPsα und APLP2s zur Folge. Es bestünde jedoch gleichzeitig die Gefahr von Nebenwirkungen durch die Spaltung weiterer Substrate wie der Notch-Rezeptoren oder des Prionenproteins. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Notch-1 prinzipiell ein Substrat für ADAM10 darstellt, die Auswirkungen in vivo jedoch begrenzt und altersabhängig sind. Für das Prionenprotein ergab sich keine direkte Beeinflussung durch eine Spaltung, sondern vielmehr eine Expressionsminderung durch die Überexpression von ADAM10 in Mäusen. Die Inkubationszeit bei der Prionenerkrankung hängt von der Menge des endogenen zellulären Prionenproteins ab. Daher ergibt sich aus einer Steigerung der α-Sekretase-Aktivität eine potentielle Prävention gegenüber einer Infektion mit der pathogenen Scrapie-Form des Prionenproteins.

Substratversorgung von NO-Synthasen

Resultate dieser Arbeit zeigen, dass endotheliale und neuronale NO-Synthasen (eNOS und nNOS) ihr Substrat Arginin nicht ausschließlich aus extrazellulären, sondern auch aus intrazellulären Quellen beziehen. Das Substrat aus den intrazellulären Quellen scheint nicht über Membrantransporter in den Extrazellulärraum gelangen zu können. Dies deutet darauf hin, dass eine enge Assoziation der Arginin-bereitstellenden Enzyme mit eNOS bzw. nNOS vorliegen könnte. Dadurch würde das durch diese Enzyme generierte Arginin direkt an die NOS weitergereicht und nicht über Transporter gegen andere basische Aminosäuren (AS) im Extrazellulärraum ausgetauscht werden. Eine intrazelluläre Substrat-Quelle besteht aus dem so genannten „Recycling“, der Umwandlung des bei der NO-Synthese entstehenden Citrullins in Arginin. Eine Kopplung von Arginin-bereitstellenden „Recycling“-Enzymen mit NOS wird in Endothelzellen und teilweise auch in TGW-nu-I Neuroblastomzellen beobachtet, nicht jedoch in A673 Neuroepitheliomzellen. Die Kopplung scheint daher vom Zelltyp abhängig zu sein. Das zur Arginin-Regeneration benötigte Citrullin kann allen untersuchten Zellen durch den Austausch mit spezifischen neutralen AS, die ausschließlich zum Substratprofil des System N Transporters SN1 passen, entzogen werden. Die Anwesenheit von SN1-Substraten im Extrazellulärraum führt daher indirekt zu einer Depletion der Recycling-Quelle. SN1 mRNA ist in allen untersuchten Zellen nachweisbar. Aus Protein-Abbau stammendes Arginin stellt den zweiten Teil der intrazellulären Arginin-Quelle dar. Dieser ist in allen untersuchten eNOS- oder nNOS exprimierenden Zellen vorhanden. Das Arginin stammt dabei sowohl aus lysosomalem als auch proteasomalen Proteinabbau, wie der Einsatz spezifischer Inhibitoren zeigt. Extrazelluläres Histidin (aber keine andere Aminosäure) kann diese Arginin-Quelle depletieren. Wir vermuten deshalb, dass Histidin über den Peptid-Histidin-Transporter PHT1, der in allen untersuchten Zellen stark exprimiert ist, gegen die durch lysosomalen und proteasomalen Proteinabbau entstehenden Arginin-haltigen Di- und Tripeptide ausgetauscht wird. Der wichtigste endogene NOS-Inhibitor, asymmetrisches Dimethylarginin (ADMA), ein Marker für endotheliale Dysfunktion und Risikofaktor für kardiovaskuläre Erkrankungen, stammt ebenfalls aus Proteinabbau. Die Verfügbarkeit dieser intrazellulären Arginin-Quelle wird deshalb stark vom Methylierungsgrad des Arginins in den abgebauten Proteinen abhängen. Eine lokale ADMA-Anreicherung könnte eine Erklärung für das Arginin-Paradox sein, der unter pathophysiologischen Bedingungen beobachteten Verminderung der endothelialen NO-Synthese bei anscheinend ausreichenden intrazellulären Argininkonzentrationen. Da auch in neurodegenerativen Erkrankungen, wie Morbus Alzheimer, ADMA eine Rolle zu spielen scheint, könnte das Arginin-Paradox auch für die nNOS-vermittelte NO-Synthese von Bedeutung sein. Die Resultate demonstrieren, dass die Substratversorgung der beiden NOS-Isoformen nicht ausschließlich von kationischen Aminosäuretransportern abhängig ist, sondern auch von Transportern für neutrale Aminosäuren und Peptide, und außerdem von Arginin-bereitstellenden Enzymen. Der jeweilige Beitrag der verschiedenen Arginin-Quellen zur Substratversorgung der NOS ist daher abhängig vom Anteil der jeweiligen Aminosäuren und Peptide in der extrazellulären Flüssigkeit.

Synthese, 18 F-Markierung, 11 C-Markierung und Evaluierung Hydantoin-substituierter Indolcarbonsäuren zur Visualisierung des NMDA-Rezeptorstatus mittels der Positronen-Emissions-Tomographie (PET)

Der N-methyl-D-aspartat-Rezeptor (NMDA), als Vertreter ionotroper Glutamat-Rezeptoren, ist essentiell für physiologische Lern- und Gedächtnisvorgänge und eine krankhafte Überaktivierung wird als potentielle Ursache für eine Reihe von akuten und chronischen neurodegenerativen Erkrankungen angesehen. Hierbei sind für die akuten Erkrankungen vor allem der Schlaganfall und für die chronischen Erkrankungen Morbus Parkinson sowie die Alzheimer´sche Demenz zu nennen. Durch seine einzigartige spannungsabhängige Mg2+-Blockade und der Notwendigkeit der gleichzeitigen Anwesenheit der endogenen Liganden Glutamat und Glycin zur Rezeptoraktivierung, stellt dieser Rezeptorkomplex daher ein sehr interessantes molekulares Target dar. NMDA-Rezeptor-Antagonisten der Glycin-Bindungsstelle und der verschiedenen allosterischen Bindungsstellen könnten als Neuroprotektiva bei den verschiedenen Krankheiten eine symptomatische Verbesserung bewirken und zur Therapie eingesetzt werden. Eine visuelle Darstellung des Rezeptors im Rahmen von Vorsorgeuntersuchungen ist jedoch derzeit nicht möglich. Zur Visualisierung dieser Prozesse mittels der Positronen-Emissions-Tomographie (PET) wurden basierend auf einer Hydantoin-substituierten Indol-2-carbonsäure als Leitstruktur, im Rahmen dieser Arbeit Fluorethoxy- und Methoxy-substituierte Derivate dargestellt und in pharmazeutischen und radiopharmazeutischen Studien evaluiert. Dazu wurde die Affinität und Spezifität zum Rezeptor in einem [3H]MDL-105,519 Rezeptorbindungsassay und die Lipophilie als Parameter für die Hirngängigkeit ermittelt. Anhand dieser Resultate wurden geeignete Markierungsvorläufer synthetisiert, welche eine phenolische Hydroxylfunktion besitzen und eine radioaktive Markierung mit den sekundären Markierungsvorläufern 2-[18F]Fluorethyltosylat ([18F]FETos) und [11C]Methyliodid ([11C]CH3I) ermöglichen. Unter Verwendung von 4,6-Dichlor-3-((3-(4-hydroxyphenyl)-2,4-dioxoimidazolidin-1-yl)methyl)-indol-2-carbonsäure wurde in einer Einstufenreaktion mit [18F]FETos die Zielverbindung 4,6-Dichlor-3-((3-(4-(2-[18F]fluorethoxy)phenyl)-2,4-dioxoimidazolidin-1-yl)methyl)-indol-2-carbonsäure in radiochemischen Ausbeuten von 6 % erhalten. Daher wurde eine alternative Markierung des Ethylester-geschützten Derivates 4,6-Dichlor-3-((3-(4-hydroxyphenyl)-2,4-dioxoimidazolidin-1-yl)methyl)-indol-2-carbonsäureethylester in einer Zweistufensynthese mit [18F]FETos und [11C]CH3I untersucht. Unter Verwendung dieser Strategie wurden unter optimierten Bedingungen 4,6-Dichlor-3-((3-4-(2-[18F]fluorethoxy)phenyl)-2,4-dioxoimidazolidin-1-yl)methyl)-indol-2-carbonsäureethylester und 4,6-Dichlor-3-((3-(4-[11C]methoxy-phenyl)-2,4-dioxoimidazolidin-1-yl)-methyl)-indol-2-carbonsäureethylester in radiochemischen Ausbeuten von 27 – 38 % erhalten. Die anschließende Entfernung der Schutzgruppe führte unter Bildung von Neben- und Zersetzungsreaktionen zu 4,6-Dichlor-3-((3-(4-(2-[18F]fluorethoxy)-phenyl)-2,4-dioxoimidazolidin-1-yl)methyl)-indol-2-carbonsäure und 4,6-Dichlor-3-((3-(4-[11C]methoxyphenyl)-2,4-dioxoimidazolidin-1-yl)methyl)-indol-2-carbonsäure in radiochemischen Gesamtausbeuten von 5 – 7 %. Die Überprüfung des biochemischen Konzepts in vivo durch µ-PET-Studien und durch autoradiographische Experimente an Rattenhirnschnitten, deuten auf eine niedrige in vivo-Aktivität hin, welche sich auf eine nicht ausreichende Passage der Blut-Hirn-Schranke zurückführen lässt.

Der Einfluss von Apolipoprotein E auf die zellulären Mechanismen der Alzheimer Erkrankung

Die massive Bildung und Ablagerung von aggregiertem Amyloid Beta-Peptid im Gehirn wird allgemein als zentrales Ereignis im Rahmen des Neurodegenerationsprozesses der Alzheimer Demenz betrachtet. Als einer der ursächlichen Risikofaktoren gilt das Vorliegen des ε4-Allels des Apolipoprotein E. Die Alzheimer´sche Krankheit ist dabei in sehr vielfältige Weise mit Apolipoprotein E verknüpft. ApoE begünstigt isoformenabhängig Aβ-Ablagerungen, ApoE-Fragmente kommen im Gehirn und der Cerebrospinalflüssigkeit von Alzheimer Patienten vor und ApoE ist darüber hinaus als Cholesterintransportprotein über den zellulären Cholesterinstoffwechsel mit der Amyloidbildung verknüpft. Mit Hilfe einer Doppeltransfektion von ApoE und ADAM10 in HEK-Zellen und durch Studien mit Inhibitoren der ADAM-Familie an HepG-2-Zellen wurde in vitro gezeigt, dass ApoE nicht durch α-Sekretasen der ADAM-Familie gespalten wird. Weiterhin konnte bewiesen werden, dass ApoE in Astrogliomazellen keinen Einfluss auf die APP-Prozessierung ausübt. Durch in vitro Modulation des Cholesteringehaltes an Astrogliomazellen mit MβCD und seine Cholesterin-Komplexverbindungen ist gezeigt worden, dass die ApoE-Sekretion durch abnehmenden Cholesteringehalt gesenkt wird. Indem Statine alleine oder in Kombination mit Isoprenylierungssubstraten eingesetzt wurden ist der Beweis erbracht worden, dass Statine in vitro die ApoE-Sekretionsinhibition alleine durch Hemmung der Cholesterinbiosynthese bewirken. Bestätigt wurde dies weiterhin durch Experimente mit Isoprenylierungsinhibitoren. Aus dem Wirkmechanismus von Statinen auf die ApoE-Sekretionssenkung leitet sich womöglich der für bestimmte Statine berichtete neuroprotektive Effekt bei Morbus Alzheimer in retrospektiven Humanstudien ab, der sich durch reine Cholesterinsenkung nicht erklären lässt. Im Zusammenhang mit der Cholesterinhomöostase und dem gesteigerten 24(S)-Hydroxycholesterinspiegel bei Morbus Alzheimer, haben die Ergebnisse gezeigt, dass 24(S)-Hydroxycholesterin [24(S)-OH-chol] zur ApoE-Sekretions- und Expressionssteigerung führt. In dieser Arbeit konnte erstmals der Nachweis erbracht werden, dass der stimulatorische Effekt von 24(S)-OH-Chol durch gleichzeitige Lovastatingabe reduziert werden kann. Dies stellt einen möglichen Ansatz im Kampf gegen die Alzheimer Demenz dar. Weiterführend müssen diese Ergebnisse noch in vivo beispielsweise durch Versuche an ApoE-transgenen Mäusen bestätigt werden. Darüber hinaus könnte nach einer Statintherapie der ApoE-Gehalt in humaner, cerebrospinaler Flüssigkeit ermittelt werden.

Modulation der Genexpression und des neuronalen Zelltods durch das Amyloid-Vorläufer-Protein (APP)

Das Amyloid-Vorläufer-Protein (APP) spielt eine zentrale Rolle in der Entstehung und Entwicklung von Morbus Alzheimer. Hierbei ist die proteolytische Prozessierung von APP von entscheidender Bedeutung. Das Verhältnis von neurotoxischen und neuroprotektiven Spaltprodukten, die über den amyloidogenen und nicht-amyloidogenen Weg der APP-Prozessierung gebildeten werden, ist für das Überleben von Neuronen und deren Resistenz gegen zytotoxische Stress-Stimuli von hoher Relevanz. Störungen der Calcium-Homöostase sind ein bekanntes Phänomen bei Morbus Alzheimer. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle von überexprimiertem APP in der Regulation des neuronalen Zelltods nach Calcium Freisetzung untersucht. Die Calcium Freisetzung aus dem endoplasmatischen Retikulum wurde durch die Inhibition der sarko- und endoplasmatischen Calcium-ATPasen (SERCA) ausgelöst. Dies führt zur Induktion der sogenannten „unfolded protein response“ (UPR) und zu einer Aktivierung von Effektor-Caspasen. Für APP-überexprimierende PC12 Zellen konnte bereits zuvor eine im Vergleich zur Kontrolle nach der durch Calcium Freisetzung-induzierten Apoptose eine erhöhte intrazelluläre Calcium Konzentration nachgewiesen werden. Über die Messung der Aktivierung von Effektor-Caspasen konnte zudem ein gesteigerter Zelltod in den APP-überexprimierenden Zellen gemessen werden. Zudem konnte gezeigt werden, dass der pro-apoptotische Transkriptionsfaktor CHOP, nicht aber die klassischen UPR-Zielgene spezifisch hochreguliert wurden. Die APP-modulierte gesteigerte Induktion von Apoptose nach Calcium Freisezung konnte durch Komplexierung der intrazellulären Calcium Ionen und durch Knockdown von CHOP im Vergleich zur Kontrolle gänzlich unterdrückt werden. Ferner bewirkte die Inhibition der Speicher-aktivierten Calcium-Kanälen (SOCC) eine signifikante Unterdrückung der beobachteten erhöhten intrazellulären Calcium Konzentration und der gesteigerten Apoptose in den APP-überexprimierenden PC12 Zellen. In diesem Teil der Arbeit konnte eindeutig gezeigt werden, dass APP in der Lage ist den durch Calcium-Freisetzung-induzierten Zelltod zu potenzieren. Diese Modulation durch APP verläuft in einer UPR-unabhängigen Reaktion über die Aktivierung von SOCC’s, einer erhöhten Aufnahme von extrazellulärem Calcium und durch erhöhte Induktion des pro-apoptotischen Transkriptionsfaktors CHOP. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die sAPPα-vermittelte Neuroprotektion untersucht. Dabei handelt es sich um die N-terminale Ektodomäne von APP, die über die Aktivität der α-Sekretase prozessiert wird und anschließend extrazellulär abgegeben wird. Ziel dieser Versuchsreihe war die neuroprotektive physiologische Funktion von APP im Hinblick auf den Schutz von neuronalen Zellen vor diversen für Morbus Alzheimer relevanten Stress-Stimuli bzw. Apoptose-Stimuli zu untersuchen. Durch die Analyse der Effektor-Caspasen konnte gezeigt werden, dass sAPPα in der Lage ist PC12 Zellen potent vor oxidativem Stress, DNA-Schäden, Hypoxie, proteasomalem Stress und Calcium-Freisetzung zu schützen. Außerdem konnte gezeigt werden, dass sAPPα in der Lage ist den pro-apoptotischen Stress-induzierten JNK/Akt-Signalweg zu inhibieren. Eine Beteiligung des anti-apoptotischen PI3K/Akt-Signalwegs bei der sAPPα-vermittelten Protektion konnte über die Inhibition der PI3-Kinase ebenfalls demonstriert werden, die eine Aufhebung der sAPPα-vermittelten Neuroprotektion bewirkte. Diese Daten zeigen neue molekulare Mechanismen auf, die dem sAPPα-vermittelten Schutz vor pathophysiologisch relevanten Stress-Stimuli in neuronalen Zellen zugrunde liegen. Im letzten Teil der Arbeit wurden verschieden Gruppen von pharmakologischen Substanzen im Hinblick auf ihre neuroprotektive Wirkung untersucht und mit ihren Effekten auf den APP-Metabolismus korreliert. Die Untersuchungen ergaben, dass Galantamin, ein schwacher Acetycholinesterase Inhibitor und allosterisch potenzierender Ligand von nikotinischen Acetylcholin-Rezeptoren in der Lage war, naive, und mit noch höherer Effizienz APP-überexprimierende Zelllinien vor dem Stress-induzierten Zelltod zu schützen. Zudem bewirkte Galantamin in APP-überexprimierenden HEK293 Zellen eine rasche Erhöhung der sAPPα Sekretion, so dass hier von einer Rezeptor-vermittelten Modulation des APP Metabolismus ausgegangen werden kann. Omega-3 Fettsäuren wirken sich positiv auf die Membranfluidität von Zellen aus und es konnte bereits gezeigt werden, dass die Bildung des toxischen Aβ Peptids hierdurch vermindert wird. In Analogie zu Galantamin schützte die Omega-3 Fettsäure Docosahexaensäure (DHA) neuronale Zellen vor dem Stress-induzierten Zelltod, wobei der Schutz in APP-überexprimierenden Zellen besonders effizient war. Diese Daten legen nahe, dass die Aktivierung des antiamyloidogenen Wegs der APP-Prozessierung ein viel versprechender Ansatz für die Entwicklung neuer Therapien gegen Morbus Alzheimer sein könnte.

Aktivierung der alpha-Sekretase ADAM10 als neuer therapeutischer Ansatz zur Behandlung der Alzheimer-Erkrankung

Die Stimulation der APP-prozessierenden α-Sekretase ADAM10 eröffnet eine vielversprechende Möglichkeit zur medizinischen Behandlung der Alzheimer-Krankheit. In dieser Arbeit wurden drei unterschiedliche Strategien zur therapeutischen Aktivierung von ADAM10 verfolgt: Die Aktivierung des G-Protein-gekoppelten Rezeptors PAC1 durch PACAP, die Gentherapie mit ADAM10-cDNA und die ADAM10-Promotorstimulation durch Retinoid-Rezeptor-Aktivierung. PACAP-38 stimuliert die α-Sekretase-vermittelte APPsα-Sekretion in humanen Neuroblastomzellen. Durch Aktivierung des PAC-1-Rezeptors via intranasal verabreichtem PACAP-38, konnte eine erhöhte α-sekretorische APP-Prozessierung bzw. verminderte Ablagerung von amyloiden Plaques in Mäusen gezeigt werden. Weiterhin sollte durch Immunoliposomen-basierte Transfektion die humane ADAM10-cDNA in den Neuronen der Maus überexprimiert werden. Hiefür wurde die DNA in Liposomen eingeschlossen, welche an ihrer Oberfläche mit anti-Transferrin-Antikörpern zur Überwindung der Blut-Hirn-Schranke gekoppelt waren. Für die Herstellung des DNA-Transportsystems wurden die Einzelschritte wie DNA-Einschluss mit einem Reportergen-Vektor, Konjugation mit verschiedenen Antikörpern und Größe der Liposomen erprobt und optimiert. Es konnte allerdings weder in vitro noch in vivo eine Immunoliposomen-vermittelte Transfektion nachgewiesen werden. In dieser Arbeit wurde zudem die Retinoid-basierte Expressionssteigerung von ADAM10 untersucht. Dafür wurden die beiden potentiellen Retinoid-Rezeptor-Bindestellen auf dem ADAM10-Promotor durch Verwendung selektiver nukleärer Rezeptor-Agonisten charakterisiert. Hierbei konnte erstmals gezeigt werden, dass der ADAM10-Promotor durch ein Dimer der nukleären Rezeptoren RAR und RXR aktiviert wird, wodurch eine erhöhte α-sekretorischen APP-Prozessierung in Neuroblastoma-Zellen resultiert. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die RAR/RXR-Heterodimeraktivierung sowohl auf dem humanen wie auf dem murinen ADAM10-Promotor identisch ist, so dass am Mausmodell entwickelte Retinoid-basierte Therapien auf den Menschen übertragbar sind. Für das Modell einer solchen Therapie wurde Acitretin verwendet, welches für die medizinische Behandlung humaner Hautkrankheiten seit Jahrzehnten eingesetzt wird. In dieser Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass Acitretin in humanen und murinen Neuroblastoma-Zellen die Menge an ADAM10 erhöht, wodurch die α-sekretorische APP-Prozessierung gesteigert wird. Zudem wurden Mäuse mit Acitretin oral, subcutan und intranasal behandelt, wobei jedoch weder eine Veränderung in der APP-Prozessierung noch der Blut-Hirn-Transport von Acitretin eindeutig belegt werden konnten. Dennoch erschließt die α-Sekretase-erhöhende Eigenschaft von Acitretin einen neuen Therapieansatz, zur Behandlung von Demenzformen vom Typ des Morbus Alzheimer.

On the development of novel cocaine-analogues for in vivo imaging of the dopamine transporter status

The present thesis is concerned with the development of novel cocaine-derived dopamine transporter ligands for the non-invasive exploration of the striatal and extra-striatal dopamine transporter (DAT) in living systems. The presynaptic dopamine transporter acquires an important function within the mediation of dopaminergic signal transduction. Its availability can serve as a measure for the overall integrity of the dopaminergic system. The DAT is upregulated in early Parkinson’s disease (PD), resulting in an increased availability of DAT-binding sites in the striatal DAT domains. Thereby, DAT imaging has become an important routine diagnostic tool for the early diagnosis of PD in patients, as well as for the differentiation of PD from symptomatically similar medical conditions. Furthermore, the dopaminergic system is involved in a variety of psychiatric diseases. In this regard, DAT-selective imaging agents may provide detailed insights into the scientific understanding of the biochemical background of both, the progress as well as the origins of the symptoms. DAT-imaging may also contribute to the determination of the dopaminergic therapeutic response for a given medication and thereby contribute to more convenient conditions for the patient. From an imaging point of view, the former demands a high availability of the radioactive probe to facilitate broad application of the modality, whereas the latter profits from short-lived probes, suitable for multi-injection studies. Therefore, labelling with longer-lived 18F-fluoride and in particular the generator nuclide 68Ga is worthwhile for clinical routine imaging. In contrast, the introduction of a 11C-label is a prerequisite for detailed scientific studies of neuronal interactions. The development of suitable DAT-ligands for medical imaging has often been complicated by the mixed binding profile of many compounds that that interact with the DAT. Other drawbacks have included high non-specific binding, extensive metabolism and slow accumulation in the DAT-rich brain areas. However, some recent examples have partially overcome the mentioned complications. Based on the structural speciality of these leads, novel ligand structures were designed and successfully synthesised in the present work. A structure activity relationship (SAR) study was conducted wherein the new structural modifications were examined for their influence on DAT-affinity and selectivity. Two of the compounds showed improvements in in vitro affinity for the DAT as well as selectivity versus the serotonin transporter (SERT) and norepinephrine transporter (NET). The main effort was focussed on the high-affinity candidate PR04.MZ, which was subsequently labelled with 18F and 11C in high yield. An initial pharmacological characterisation of PR04.MZ in rodents revealed highly specific binding to the target brain structures. As a result of low non-specific binding, the DAT-rich striatal area was clearly visualised by autoradiography and µPET. Furthermore, the radioactivity uptake into the DAT-rich brain regions was rapid and indicated fast binding equilibrium. No radioactive metabolite was found in the rat brain. [18F]PR04.MZ and [11C]PR04.MZ were compared in the primate brain and the plasma metabolism was studied. It was found that the ligands specifically visualise the DAT in high and low density in the primate brain. The activity uptake was rapid and quantitative evaluation by Logan graphical analysis and simplified reference tissue model was possible after a scanning time of 30 min. These results further reflect the good characteristics of PR04.MZ as a selective ligand of the neuronal DAT. To pursue 68Ga-labelling of the DAT, initial synthetic studies were performed as part of the present thesis. Thereby, a concept for the convenient preparation of novel bifunctional chelators (BFCs) was developed. Furthermore, the suitability of novel 1,4,7-triazacyclononane based N3S3-type BFCs for biomolecule-chelator conjugates of sufficient lipophilicity for the penetration of the blood-brain-barrier was elucidated.

Synthese, Tritierung, 99m Tc-Markierung und Evaluierung von Benzamid-Derivaten zur Visualisierung der D 2, D 3-Rezeptoren

Die Diagnose und Therapie von neurodegenerativen Krankheiten, wie beispielsweise Morbus Parkinson besitzt in der heutigen Gesellschaft eine immer größere Bedeutung. Über moderne, bild¬gebende nuklear¬medizinische Verfahren wie SPECT und PET ist es mit geeigneten Radioliganden möglich, Morbus Parkinson vor dem Auftreten von Symptomen zu diagnostizieren. Ein wichtiger Ansatzpunkt zur Diagnose von Morbus Parkinson ist die Visualisierung der postsynaptischen Dopamin-Rezeptoren über radioaktiv (11C, 18F, 123I) markierte Benz¬amid-Derivate. Auf Grundlage der (S)-Pyrolidin-2,3-dimethoxy-Benzamid-Struktur des 18F-Liganden Fallypride wurden verschiedene 99mTc-markierte Benzamid-Derivate als potentielle Radio¬liganden zur Parkinson-Diagnostik entwickelt. Um das Potential von Metall-konjugierten Benzamiden abschätzen zu können, wurden zunächst einfache Vergleichssubstanzen entwickelt. Diese sollten die Einführung eines Chelators simulieren und wurden hierfür hinsichtlich ihrer in vitro-Bindungsaffinitäten zu den Dopamin-, Serotonin- und adrenergen Rezeptoren evaluiert. Die zunächst entwickelten Derivate mit unterschiedlichen Kettenlängen zur Kopplung des Chelators zeigten für die Propylkette Affinitäten im nanomolaren Bereich. Im Anschluss sollten basierend auf diesen Ergebnissen vier verschiedene Chelatoren (Carbony-Cyclopentadienyl, Amido-Cyclopentadienyl, 2-Pyridyl-Imin und N2S2) über eine Propylkette an die 5-Position der Benzamidgrundstruktur gekoppelt werden. Die geplante Synthese des Carbonyl-Cyclopentadienyl-Derivates gelang jedoch nicht. Für die weiteren Chelatoren (Amido-Cyclopentadieny, 2-Pyridyl-Imin und N2S2) konnten die jeweiligen Markierungs¬vorläufer und Rhenium-Komplexe dargestellt werden, die ebenfalls hinsichtlich ihrer Bindungs¬affinitäten evaluiert wurden. Die erzielten Affinitäten zeigten, dass eine Über¬tragung der Affinitäten der einfachen Vergleichssubstanzen auf die komplexeren Metall-Benzamide nicht möglich war. Insbesondere der N2S2-Rhenium-Komplex besitzt nur noch geringe Affinität (490 - 900 nM) zu den D2- und D3-Rezeptoren. Die mittel-affinen 2-Pyridyl-Imin- und Amdio¬cyclopentadien-Komplexe wurden mit 99mTc markiert und die Markierungsausbeute hinsichtlich Reaktionstemperatur, Markierungs-vorläuferkonzentration und Heizmethoden optimiert. Dabei konnte der Imin-Komplex quantitativ mittels fac-[99mTc(CO)3(H2O)3]+ in 30 Minuten bei 45°C markiert werden. Der Amido-Cyclopentadien-Komplex konnte über die Umsetzung des Ferrocen-Markierungsvorläufer mit Mn(CO)5Br und [99mTcO4]- in Ausbeuten von bis zu 60 % markiert werden. Im Anschluss an die Markierungen wurden die 99mTc-Komplexe über HPLC isoliert und in in vitro-Auto¬radiographien von Rattenhirnschnitten weiter evaluiert. Die erhaltenen Ergebnisse bestätigten die für die Rhenium-Komplexe erzielten Affinitäten und zeigten keine spezifische Anreicherung in bestimmten Hirnarealen. Aus diesen Ergebnissen kann ge¬schlossen werden, dass die dargestellten 99mTc-Benzamide aufgrund mangelnder Affinitäten und einer hohen unspezifischen Bindung keine geeigneten Liganden zur Darstellung der D2- und D3- Rezeptoren sind. Um die dargestellten 99mTc-Benzamide mit [18F]Fallypride vergleichen zu können, wurde zusätzlich [3H]Fallypride dargestellt. Hierfür wurde zunächst der Nor-Markierungsvor¬läufer synthetisiert und die Markierungsausbeute optimiert. Die finale Umsetzung mit [3H]Methylnosylat ergab nach HPLC-Aufreinigung 15 mCi [3H]Fallypride mit einer radio¬chemischen Reinheit von >99,5 %. Erste Autoradiographien zeigten eine hohe Anreicherung des Liganden im Striatum, verbunden mit einer sehr niedrigen unspezifischen Bindung.