RNA-Strukturen im Hepatitis-C-Virus und ihre Bedeutung für Translation und Replikation

Das Hepatitis C Virus (HCV) ist ein umhülltes Virus aus der Familie der Flaviviridae. Es besitzt ein Plusstrang-RNA Genom von ca. 9600 Nukleotiden Länge, das nur ein kodierendes Leseraster besitzt. Das Genom wird am 5’ und 3’ Ende von nicht-translatierten Sequenzen (NTRs) flankiert, welche für die Translation und vermutlich auch Replikation von Bedeutung sind. Die 5’ NTR besitzt eine interne Ribosomeneintrittsstelle (IRES), die eine cap-unabhängige Translation des ca. 3000 Aminosäure langen viralen Polyproteins erlaubt. Dieses wird ko- und posttranslational von zellulären und viralen Proteasen in 10 funktionelle Komponenten gespalten. Inwieweit die 5’ NTR auch für die Replikation der HCV RNA benötigt wird, war zu Beginn der Arbeit nicht bekannt. Die 3’ NTR besitzt eine dreigeteilte Struktur, bestehend aus einer variablen Region, dem polyU/UC-Bereich und der sogenannten X-Sequenz, eine hochkonservierte 98 Nukleotide lange Region, die vermutlich für die RNA-Replikation und möglicherweise auch für die Translation benötigt wird. Die genuae Rolle der 3’ NTR für diese beiden Prozesse war zu Beginn der Arbeit jedoch nicht bekannt. Ziel der Dissertation war deshalb eine detaillierte genetische Untersuchung der NTRs hinsichtlich ihrer Bedeutung für die RNA-Translation und -Replikation. In die Analyse mit einbezogen wurden auch RNA-Strukturen innerhalb der kodierenden Region, die zwischen verschiedenen HCV-Genotypen hoch konserviert sind und die mit verschiedenen computer-basierten Modellen vorhergesagt wurden. Zur Kartierung der für RNA-Replikation benötigten Minimallänge der 5’ NTR wurde eine Reihe von Chimären hergestellt, in denen unterschiedlich lange Bereiche der HCV 5’ NTR 3’ terminal mit der IRES des Poliovirus fusioniert wurden. Mit diesem Ansatz konnten wir zeigen, dass die ersten 120 Nukleotide der HCV 5’ NTR als Minimaldomäne für Replikation ausreichen. Weiterhin ergab sich eine klare Korrelation zwischen der Länge der HCV 5’ NTR und der Replikationseffizienz. Mit steigender Länge der 5’ NTR nahm auch die Replikationseffizienz zu, die dann maximal war, wenn das vollständige 5’ Element mit der Poliovirus-IRES fusioniert wurde. Die hier gefundene Kopplung von Translation und Replikation in der HCV 5’ NTR könnte auf einen Mechanismus zur Regulation beider Funktionen hindeuten. Es konnte allerdings noch nicht geklärt werden, welche Bereiche innerhalb der Grenzen des IRES-Elements genau für die RNA-Replikation benötigt werden. Untersuchungen im Bereich der 3’ NTR ergaben, dass die variable Region für die Replikation entbehrlich, die X-Sequenz jedoch essentiell ist. Der polyU/UC-Bereich musste eine Länge von mindestens 11-30 Uridinen besitzen, wobei maximale Replikation ab einer Länge von 30-50 Uridinen beobachtet wurde. Die Addition von heterologen Sequenzen an das 3’ Ende der HCV-RNA führte zu einer starken Reduktion der Replikation. In den hier durchgeführten Untersuchungen zeigte keines der Elemente in der 3’ NTR einen signifikanten Einfluss auf die Translation. Ein weiteres cis aktives RNA-Element wurde im 3’ kodierenden Bereich für das NS5B Protein beschrieben. Wir fanden, dass Veränderungen dieser Struktur durch stille Punktmutationen die Replikation hemmten, welche durch die Insertion einer intakten Version dieses RNA-Elements in die variable Region der 3’ NTR wieder hergestellt werden konnte. Dieser Versuchsansatz erlaubte die genaue Untersuchung der für die Replikation kritischen Strukturelemente. Dadurch konnte gezeigt werden, dass die Struktur und die Primärsequenz der Loopbereiche essentiell sind. Darüber hinaus wurde eine Sequenzkomplementarität zwischen dem Element in der NS5B-kodierenden Region und einem RNA-Bereich in der X-Sequenz der 3’ NTR gefunden, die eine sog. „kissing loop“ Interaktion eingehen kann. Mit Hilfe von gezielten Mutationen konnten wir zeigen, dass diese RNA:RNA Interaktion zumindest transient stattfindet und für die Replikation des HCV essentiell ist.

Host race formation in Hyalesthes obsoletus (Signoret 1865)

Die Winden-Glasflügelzikade Hyalesthes obsoletus (Cixiidae, Glasflügelzikaden) nutzte in Deutschland ursprünglich die Ackerwinde Convolvulus arvensis als Wirtspflanze, allerdings nahm in den letzten zwei Dekaden die Abundanz auf der Großen Brennnessel Urtica dioica stark zu, zusammen mit der Inzidenz der Schwarzholzkrankheit Bois noir auf Weinreben. Bois noir wird durch ein Phytoplasma verursacht, das durch H. obsoletus von C. arvensis und U. dioica auf Weinreben übertragen wird. Es stellte sich daher die Frage, ob H. obsoletus Wirtsrassen entwickelt hat, die möglicherweise die Bois noir-Epidemiologie beeinflussen. In der vorliegenden Studie wurden folgende Fragestellungen bearbeitet: rn(1) Gibt es in Deutschland und Europa genetisch unterscheidbare Wirtsrassen von H. obsoletus auf den beiden Wirtspflanzen C. arvensis und U. dioica? Es wurden sieben Mikrosatellitenmarker entwickelt und etabliert, um H. obsoletus Populationen aus Deutschland und Europa genetisch zu analysieren. Es zeigte sich eine deutliche Differenzierung zwischen Populationen von beiden Wirtspflanzen in Deutschland, jedoch nicht in den historischen Ursprungsgebieten der deutschen Populationen, in der Schweiz, Italien oder Slovenien.rn(2) Wo sind die deutschen Wirtsrassen von H. obsoletus entstanden? Eine Einwanderung von südlichen, bereits an U. dioica angepassten Individuen stand einer lokalen Wirtsrassenevolution gegenüber. Die engere genetische Verwandtschaft der deutschen Population auf U. dioica zu denen auf C. arvensis, im Vergleich zu den übrigen Populationen auf U. dioica, impliziert einen lokalen Prozess im nördlichen Verbreitungsgebiet. Eine Immigration südlicher Tiere scheint nicht zur Diversifizierung beigetragen zu haben, führte aber möglicherweise einen U. dioica-spezifischen Phytoplasma-Stamm ein. Durch Wirtsrassenevolution entwickelten sich spezifische, vektorbasierte epidemiologische Kreisläufe der Schwarzholzkrankheit Bois noir. rn(3) Welche Präferenzen zeigen die beiden Wirtsrassen von H. obsoletus für die Wirtspflanzen C. arvensis und U. dioica und unterscheiden sich diese? Die Präferenz von H. obsoletus aus beiden deutschen Wirtsrassen in Bezug auf den Geruch der Wirtspflanzen wurde in einem Y-Olfaktometer untersucht, zusätzlich wurden beide Pflanzen direkt zur Wahl gestellt. Bei beiden Untersuchungen zeigte die Population von C. arvensis eine signifikante Präferenz für ihre native Wirtspflanze. Die Population von U. dioica wies dagegen keine Präferenz für den Geruch einer Wirtspflanze auf, bevorzugte im direkten Test jedoch signifikant ihre native Wirtspflanze. Dies weist darauf hin, dass die Anpassung an den „neuen“ Wirt noch nicht vollständig ist.rn