The oxygen sensors FNR from Escherichia coli and NreABC from Staphylococcus carnosus

Im Laufe der Evolution entwickelte sich eine Reihe von Sauerstoff-Sensorsystemen in Bakterien, um die Genexpression der Sauerstoffverfügbarkeit anzupassen. Der Sauerstoffsensor FNR aus Escherichia coli bindet unter anaeroben Bedingungen ein [4Fe4S]2+ Zentrum. Unter Sauerstoffeinfluß zerfällt aktives [4Fe4S]2+FNR zu inaktivem [2Fe2S]2+FNR und weiter zu ebenfalls inaktivem apoFNR. In der vorliegenden Arbeit wurde der Zustand von FNR in vivo in aeroben und anaeroben Zellen von Escherichia coli aufgeklärt. Durch Alkylierung der Cysteine in FNR und anschließender Analyse im Massenspektrometer konnte gezeigt werden, das FNR in aeroben Zellen hauptsächlich in der apo-Form vorliegt. Nach ca. 6 Minuten war in lebenden E. coli Zellen die Umwandlung von [4Fe4S]2+ FNR zu apoFNR abgeschlossen.rnrnIn dem gram positiven Bakterium Staphylococcus carnosus aktiviert das NreBC System unter anaeroben Wachstumsbedingungen die Gene der Nitratatmung. NreB ist eine cytoplasmatische Sensorhistidinkinase, die ein sauerstofflabiles [4Fe4S]2+ Zentrum über eine PAS-Domäne bindet. Das [4Fe4S]2+ Zentrum wird von vier Cysteinen gebunden. Der Responsregulator NreC steuert nach Aktivierung durch NreB die Transkription der Zielgene. In der vorliegenden Arbeit wurde NreB mit Hilfe von Cysteinmarkierungen in vivo charakterisiert. Durch die Änderung der Cystein-Zugänglichkeit für Thiolreagenzien nach Sauerstoffzugabe konnte eine Halbwertszeit von ca. 3 Minuten für das [4Fe4S]2+ Zentrum in vivo bestimmt werden. In anaeroben Bakterien stellt [4Fe4S]2+NreB die Hauptform von NreB dar, während in aeroben Bakterien hauptsächlich apoNreB vorkommt. Dieses Ergebnis konnte durch Massenspektroskopie bestätigt werden. Weiterhin konnte gezeigt werden das NreA mit NreB und NreC wechselwirkt und Bestandteil des NreABC Drei-Komponentensystems ist. rn

Elektrochemisch gesteuerte zeitaufgelöste Infrarotspektroskopie an Redox-Membranproteinen in einer biomimetischen Membran-Architektur

Das Protein Cytochrom c Oxidase (CcO) ist ein Enzym der mitochondrialen Atmungskette. Als letzter Komplex (Komplex IV) einer Elektronentransportkette katalysiert sie die Reduktion von molekularem Sauerstoff zu Wasser. Hierbei werden Elektronen von Cytochrom c (Cc) in das Enzym geleitet. Die durch den Redoxprozess freiwerdende freie Enthalpie wird dazu genutzt, einen Protonengradienten über die innere Mitochondrien-Membran aufzubauen. Die zurückwandernden Protonen treiben in der ATP-Synthase die Produktion von Adenosintriphosphat (ATP) an, dem universellen Energieträger in lebenden Organismen. Gegenstand dieser Dissertation sind zeitaufgelöste ATR-FTIR-Messungen des direkten Elektronentransfers in die CcO. Das Protein wird hierzu orientiert auf einer Goldelektrode immobilisiert und in eine künstliche Membran rekonstituiert (Protein-tethered Bilayer Lipid Membrane, ptBLM). Das ptBLM-System wird hinsichtlich einer möglichst hohen Protein-Aktivität optimiert. Elektronen werden durch elektrochemische Anregung von der Elektrode in die CcO injiziert. Die Goldoberfläche wird auf die reflektierende Oberfläche eines Silizium-ATR-Kristalls aufgebracht. Durch die Präparation einer rauen Oberfläche (RMS-Rauigkeit ca. 5 nm) wird eine Verstärkung der IR-Absorption erreicht. Die mit den Ladungstransferprozessen einhergehenden Konformationsänderungen der die Redoxzentren umgebenden Gruppen (CONH-Gerüst und Aminosäure-Seitenketten) können durch Infrarot-Spektroskopie nachgewiesen werden. Phasensensitive Detektion (PSD) wird zur Rauschminderung eingesetzt, um Geschwindigkeitskonstanten für die Redox-Übergänge zu bestimmen. Im Bereich der Amid-I-Bande werden etliche Peaks identifiziert, die sich mit dem Redoxzustand des Proteins ändern. Für das CuA-Zentrum, welches als erstes der vier Redoxzentren der CcO reduziert wird, wird die schnellste Geschwindigkeitskonstante ks=4870/s ermittelt. Für das Häm a3-Zentrum wird eine Geschwindigkeitskonstante von ks=13,8/s ermittelt. Die Ergebnisse sind konsistent zu elektrochemischen und Raman-Spektroskopie-Experimenten, welche ebenfalls in unserer Gruppe durchgeführt wurden. Weitere Themen dieser Dissertation sind der Nachweis der Anwendbarkeit des ptBLM-Systems für andere Membranproteine (Beispiel: bakterielles photosynthetisches Reaktionszentrum) und der Einsatz des ATR-FTIR-Setups für verschiedene künstliche Membransysteme (Aktivitätsnachweis des OR5-Geruchsrezeptors in einer peptidgestützten Membran, Eigenschaften eines Oligoethylenglycol-Spacers).

Time-resolved surface enhanced resonance Raman spectro-electrochemistry of heme proteins

The membrane protein Cytochrome c Oxidase (CcO) is one of the most important functional bio-molecules. It appears in almost every eukaryotic cell and many bacteria. Although the different species differ in the number of subunits, the functional differences are merely marginal. CcO is the terminal link in the electron transfer pathway of the mitochondrial respiratory chain. Electrons transferred to the catalytic center of the enzyme conduce to the reduction of molecular oxygen to water. Oxygen reduction is coupled to the pumping of protons into the inter-membrane space and hence generates a difference in electrochemical potential of protons across the inner mitochondrial membrane. This potential difference drives the synthesis of adenosine triphosphate (ATP), which is the universal energy carrier within all biological cells. rnrnThe goal of the present work is to contribute to a better understanding of the functional mechanism of CcO by using time-resolved surface enhanced resonance Raman spectroscopy (TR-SERRS). Despite intensive research effort within the last decades, the functional mechanism of CcO is still subject to controversial discussions. It was the primary goal of this dissertation to initiate electron transfer to the redox centers CuA, heme a, heme a3 and CuB electrochemically and to observe the corresponding redox transitions in-situ with a focus on the two heme structures by using SERRS. A measuring cell was developed, which allowed combination of electrochemical excitation with Raman spectroscopy for the purpose of performing the accordant measurements. Cytochrome c was used as a benchmark system to test the new measuring cell and to prove the feasibility of appropriate Raman measurements. In contrast to CcO the heme protein cc contains only a single heme structure. Nevertheless, characteristic Raman bands of the hemes can be observed for both proteins.rnrnIn order to investigate CcO it was immobilized on top of a silver substrate and embedded into an artificial membrane. The catalytic activity of CcO and therefore the complete functional capability of the enzyme within the biomimetic membrane architecture was verified using cyclic voltammetry. Raman spectroscopy was performed using a special nano-structured silver surface, which was developed within the scope of the present work. This new substrate combined two fundamental properties. It facilitated the formation of a protein tethered bilayer lipid membrane (ptBLM) and it allowed obtaining Raman spectra with sufficient high signal-to-noise ratios.rnSpectro-electrochemical investigations showed that at open circuit potential the enzyme exists in a mixed-valence state, with heme a and and heme a3 in the reduced and oxidized state, respectively. This was considered as an intermediate state between the non-activated and the fully activated state of CcO. Time-resolved SERRS measurements revealed that a hampered electron transfer to the redox center heme a3 characterizes this intermediate state.rn

Direct electron transfer to cytochrome c oxidase investigated by electrochemistry and time-resolved surface-enhanced infrared absorption spectroscopy

Cytochrom c Oxidase (CcO), der Komplex IV der Atmungskette, ist eine der Häm-Kupfer enthaltenden Oxidasen und hat eine wichtige Funktion im Zellmetabolismus. Das Enzym enthält vier prosthetische Gruppen und befindet sich in der inneren Membran von Mitochondrien und in der Zellmembran einiger aerober Bakterien. Die CcO katalysiert den Elektronentransfer (ET) von Cytochrom c zu O2, wobei die eigentliche Reaktion am binuklearen Zentrum (CuB-Häm a3) erfolgt. Bei der Reduktion von O2 zu zwei H2O werden vier Protonen verbraucht. Zudem werden vier Protonen über die Membran transportiert, wodurch eine elektrochemische Potentialdifferenz dieser Ionen zwischen Matrix und Intermembranphase entsteht. Trotz ihrer Wichtigkeit sind Membranproteine wie die CcO noch wenig untersucht, weshalb auch der Mechanismus der Atmungskette noch nicht vollständig aufgeklärt ist. Das Ziel dieser Arbeit ist, einen Beitrag zum Verständnis der Funktion der CcO zu leisten. Hierzu wurde die CcO aus Rhodobacter sphaeroides über einen His-Anker, der am C-Terminus der Untereinheit II angebracht wurde, an eine funktionalisierte Metallelektrode in definierter Orientierung gebunden. Der erste Elektronenakzeptor, das CuA, liegt dabei am nächsten zur Metalloberfläche. Dann wurde eine Doppelschicht aus Lipiden insitu zwischen die gebundenen Proteine eingefügt, was zur sog. proteingebundenen Lipid-Doppelschicht Membran (ptBLM) führt. Dabei musste die optimale Oberflächenkonzentration der gebundenen Proteine herausgefunden werden. Elektrochemische Impedanzspektroskopie(EIS), Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie (SPR) und zyklische Voltammetrie (CV) wurden angewandt um die Aktivität der CcO als Funktion der Packungsdichte zu charakterisieren. Der Hauptteil der Arbeit betrifft die Untersuchung des direkten ET zur CcO unter anaeroben Bedingungen. Die Kombination aus zeitaufgelöster oberflächenverstärkter Infrarot-Absorptionsspektroskopie (tr-SEIRAS) und Elektrochemie hat sich dafür als besonders geeignet erwiesen. In einer ersten Studie wurde der ET mit Hilfe von fast scan CV untersucht, wobei CVs von nicht-aktivierter sowie aktivierter CcO mit verschiedenen Vorschubgeschwindigkeiten gemessen wurden. Die aktivierte Form wurde nach dem katalytischen Umsatz des Proteins in Anwesenheit von O2 erhalten. Ein vier-ET-modell wurde entwickelt um die CVs zu analysieren. Die Methode erlaubt zwischen dem Mechanismus des sequentiellen und des unabhängigen ET zu den vier Zentren CuA, Häm a, Häm a3 und CuB zu unterscheiden. Zudem lassen sich die Standardredoxpotentiale und die kinetischen Koeffizienten des ET bestimmen. In einer zweiten Studie wurde tr-SEIRAS im step scan Modus angewandt. Dafür wurden Rechteckpulse an die CcO angelegt und SEIRAS im ART-Modus verwendet um Spektren bei definierten Zeitscheiben aufzunehmen. Aus diesen Spektren wurden einzelne Banden isoliert, die Veränderungen von Vibrationsmoden der Aminosäuren und Peptidgruppen in Abhängigkeit des Redoxzustands der Zentren zeigen. Aufgrund von Zuordnungen aus der Literatur, die durch potentiometrische Titration der CcO ermittelt wurden, konnten die Banden versuchsweise den Redoxzentren zugeordnet werden. Die Bandenflächen gegen die Zeit aufgetragen geben dann die Redox-Kinetik der Zentren wieder und wurden wiederum mit dem vier-ET-Modell ausgewertet. Die Ergebnisse beider Studien erlauben die Schlussfolgerung, dass der ET zur CcO in einer ptBLM mit größter Wahrscheinlichkeit dem sequentiellen Mechanismus folgt, was dem natürlichen ET von Cytochrom c zur CcO entspricht.

Die Bedeutung von molekularem Sauerstoff für die Evolution des genetischen Codes

Die Entstehung und Evolution des genetischen Codes, der die Nukleotidsequenz der mRNA in die Aminosäuresequenz der Proteine übersetzt, zählen zu den größten Rätseln der Biologie. Die ersten Organismen, die vor etwa 3,8 Milliarden Jahren auf der Erde auftraten, nutzten einen ursprünglichen genetischen Code, der vermutlich ausschließlich abiotisch verfügbare Aminosäuren terrestrischer oder extraterrestrischer Herkunft umfasste. Neue Aminosäuren wurden sukzessive biosynthetisiert und selektiv in den Code aufgenommen, welcher in der modernen Form aus bis zu 22 Aminosäuren besteht. Die Ursachen für die Selektion und die Chronologie ihrer Aufnahme sind bis heute unbekannt und sollten im Rahmen der vorliegenden Arbeit erforscht werden. Auf Grundlage quanten-chemischer Berechnungen konnte in dieser Arbeit zunächst ein Zusammenhang zwischen der HOMO-LUMO-Energiedifferenz (H-L-Distanz), die ein inverses quanten-chemisches Korrelat für allgemeine chemische Reaktivität darstellt, und der chronologischen Aufnahme der Aminosäuren in den genetischen Code aufgezeigt werden. Demnach sind ursprüngliche Aminosäuren durch große H-L-Distanzen und neue Aminosäuren durch kleine H-L-Distanzen gekennzeichnet. Bei einer Analyse des Metabolismus von Tyrosin und Tryptophan, bei denen es sich um die beiden jüngsten Standard-Aminosäuren handelt, wurde ihre Bedeutung als Vorläufer von Strukturen ersichtlich, die sich durch eine hohe Redox-Aktivität auszeichnen und deren Synthese gleichzeitig molekularen Sauerstoff erfordert. Aus diesem Grund wurden die Redox-Aktivitäten der 20 Standard-Aminosäuren gegenüber Peroxylradikalen und weiteren Radikalen getestet. Die Untersuchungen ergaben eine Korrelation zwischen evolutionärem Auftreten und chemischer Reaktivität der jeweiligen Aminosäure, die sich insbesondere in der effizienten Reaktion zwischen Tryptophan bzw. Tyrosin und Peroxylradikalen widerspiegelte. Dies indizierte eine potentielle Bedeutung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) bei der Konstituierung des genetischen Codes. Signifikante Mengen an ROS wurden erst zu Beginn der Oxygenierung der Geobiosphäre, die als Great Oxidation Event (GOE) bezeichnet wird und vor circa 2,3 Milliarden Jahren begann, gebildet und müssen zur oxidativen Schädigung vulnerabler, zellulärer Strukturen geführt haben. Aus diesem Grund wurde das antioxidative Potential von Aminosäuren beim Prozess der Lipidperoxidation untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass lipophile Derivate von Tryptophan und Tyrosin befähigt sind, die Peroxidation von Rattenhirnmembranen zu verhindern und humane Fibroblasten vor oxidativem Zelltod zu schützen. Daraus gründete sich das in dieser Arbeit aufgestellte Postulat eines Selektionsvorteils primordialer Organismen während des GOEs, die Tryptophan und Tyrosin als redox-aktive Aminosäuren in Membranproteine einbauen konnten und somit vor Oxidationsprozessen geschützt waren. Demzufolge wurde die biochemische Reaktivität als Selektionsparameter sowie oxidativer Stress als prägender Faktor der Evolution des genetischen Codes identifiziert.

Comparison of model potentials for molecular dynamics simulation of crystalline silica

Simulationen von SiO2 mit dem von van Beest, Kramer und vanSanten (BKS) entwickelten Paarpotenzial erzeugen vielezufriedenstellende Ergebnisse, aber auch charakteristischeSchwachstellen. In dieser Arbeit wird das BKS-Potenzial mitzwei kürzlich vorgeschlagenen Potenzialen verglichen, dieeffektiv Mehrteilchen-Wechselwirkungen beinhalten. Der ersteAnsatz erlaubt dazu fluktuierende Ladungen, der zweiteinduzierbare Polarisierungen auf den Sauerstoffatomen. Die untersuchten Schwachstellen des BKS Potenzialsbeinhalten das Verhältnis der zwei Gitterkonstanten a und cim Quarzübergang, das von BKS falsch beschrieben wird.Cristobalit und Tridymit erscheinen instabil mit BKS.Weiterhin zeigt die BKS-Zustandsdichte charakteristischeAbweichungen von der wahren Zustandsdichte. DerÜbergangsdruck für den Stishovit I-II Übergang wird deutlichüberschätzt. Das Fluktuierende-Ladungs-Modell verbesserteinige der genannten Punkte, reproduziert aber viele andereEigenschaften schlechter als BKS. DasFluktierende-Dipol-Modell dagegen behebt alle genanntenArtefakte. Zusätzlich wird der druckinduzierte Phasenübergang imalpha-Quarz untersucht. Alle Potentiale finden die selbeStruktur für Quarz II. Bei anschliessender Dekompressionerzeugt BKS eine weitere Phase, während die beiden anderenPotentiale wieder zum alpha-Quarz zurückkehren. Weiterhinwerden zwei Methoden entwickelt, um die piezoelektrischenKonstanten bei konstantem Druck zu bestimmen. Die Ergebnissegeben Hinweise auf eine möglicherweisenicht-elektrostatische Natur der Polarisierungen imFluktuierende-Dipole-Modell. Mit dieser Interpretation scheint das Fluktuierende-DipolPotential alle verfügbaren experimentellen Daten am bestenvon allen drei untersuchten Ansätzen zu reproduzieren.