Vakzinierung gegen die murine kutane Leishmaniose mit TAT-LACK transduzierten dendritischen Zellen

In der murinen kutanen Leishmaniose ist die Ausheilung der Infektion mit dem Auftreten von schützenden CD4+ Th1- sowie CD8+ Tc1-Immunantworten assoziiert. Daher sollte eine wirksame Vakzine beide T-Zell-Populationen induzieren. Im Rahmen dieser Dissertation konnte gezeigt werden, daß mit TAT-LACK Fusionsproteinen effektiv gegen eine progressiv verlaufende Infektion mit Leishmania major in empfindlichen BALB/c sowie resistenten C57BL/6 Mäusen vakziniert werden kann. TAT-LACK konnte hierbei sowohl im DC- als auch im proteinbasierten Ansatz protektive Immunität verleihen. Das TAT-Peptid ist in der Lage, Proteine direkt in das Zytosol von DC zu schleusen und so den für die CD8+ T-Zell-Antworten erforderlichen MHC Klasse I Präsentationsweg einzuschlagen. Stammesspezifische Untersuchungen des inflammatorischen Infiltrates in Läsion und Lymphknoten bestätigten die physiologische Relevanz von DC und CD8+ T-Zellen im Verlauf einer etablierten Leishmania-Infektion in beiden Mausstämmen und rechtfertigten somit den Einsatz einer DC basierten Vakzine, die vermehrt CD8+ T-Zellen induzieren sollte. Tatsächlich konnte mit TAT-LACK transduzierten DC in beiden Mausstämmen effektiv gegen eine progressiv verlaufende Leishmania-Infektion vakziniert werden. Der Vakzinierungserfolg ließ sich anhand verringerter Läsionsvolumina, reduzierter Parasitenlasten und einer Verschiebung des Zytokinprofils in Richtung einer Th1 dominierten Immunantwort bestätigen. In allen Ansätzen war die i.d. Vakzinierung mit TAT-LACK transduzierten DC der Injektion von LACK gepulsten DC überlegen. Experimente mit DC aus IL-12p40 defizienten Mäusen belegten die IL-12 Abhängigkeit der Vakzine. Mit Hilfe von in vitro Restimulierungsexperimenten konnte nachgewiesen werden, daß nach Applikation TAT-LACK transduzierter DC in beiden Mausstämmen vermehrt CD8+ T-Zellen induziert werden. Des weiteren waren TAT-LACK transduzierte DC in Restimulationsexperimenten stärkere Aktivatoren der CD8+ T-Zell-Proliferation als LACK gepulste DC. Depletionsexperimente bestätigten die T-Zell-Abhängigkeit der Vakzine. Weitere in vivo Versuche belegten zudem die protektive Wirkung von TAT-LACK Fusionsproteinen im direkten, proteinbasierten Vakzinierungsansatz. Floreszenzmikroskopische Analysen der Epidermis bestätigten hierbei Aktivierung und Auswanderung von LC nach i.d. TAT-LACK Applikation.

RNA-basierte Impfstoffe zur Induktion optimaler Immunantworten

Antigen-kodierende RNA wird als eine sichere und effiziente Alternative zu traditionellen Impfstoff-Formulierungen, wie Peptid-, Protein-, rekombinanten viralen oder DNA basierten Impfstoffen betrachtet. Der endgültige klinische Nutzen RNA-basierter Impfstoffe wird von der Optimierung verschiedener Parameter abhängig sein, die zur Induktion und effizienten Expansion der humoralen und zellvermittelten Immunantwort beitragen. Vor diesem Hintergrund war die Zielsetzung der vorliegenden Arbeit, die Etablierung pharmakologischer und immunologischer Parameter für die Generierung effektiver Immunantworten durch RNA-Impfstoffe sowie deren Wirksamkeit in vitro und im Mausmodell unter Nutzung von Modellantigenen zu testen. Zur Untersuchung und Optimierung der RNA-Pharmakokinetik, als einem Schlüsselaspekt der klinischen Medikamentenentwicklung, wurde der Einfluss von strukturellen Modifikationen auf die Transkriptstabilität und Translationseffizienz von Reporter-Proteinen in einer zeitabhängigen Kinetik evaluiert. Es wurde gezeigt, dass ein poly(A) Schwanz von 120 Adenosinen, verglichen mit einem kürzeren, ein freies 3´ poly(A) Ende, verglichen mit einem verdeckten und eine doppelte β-globin 3´ UTR, unabhängig voneinander zu einer Erhöhung der IVT-RNA Stabilität und zu einer Verbesserung der Translationseffizienz beitrugen und dadurch insgesamt zu einer erhöhten Proteinexpression führten. Antigen-kodierende IVT-RNA mit diesen molekularen Merkmalen in Kombination führte, im Vergleich zur Standard IVT-RNA, zu einer erhöhten Dichte und Stabilität von Peptid/MHC-Komplexen auf der Zelloberfläche transfizierter DCs und dadurch zu einer verbesserten Stimulation von CD4+ und CD8+ T-Zellen im murinen und humanen System. Mit dem Ziel, die RNA kodierte Antigenform für die Induktion einer verstärkten Antikörperantwort zu modifizieren, wurde im zweiten Teil der Arbeit ein Antigen-IgM Fusionskonstrukt hergestellt und hinsichtlich seiner Eignung als neues Impfstoff-Format untersucht. Die Ausgangshypothese, dass die RNA kodierten Antigen-IgM Fusionsproteine polymerisieren, von transfizierten Zellen sezerniert werden und aufgrund der repetitiven Antigenstruktur im Vergleich mit dem monomeren Antigen zu einer Verstärkung der Antikörperantwort führen, wurde in vitro und in vivo im Mausmodell bestätigt. Die Entwicklung und Evaluierung von Zytokinfusionsproteinen zur selektiven Verstärkung der antigenspezifischen Immunantworten bildeten den dritten Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit. Zur weiteren Verstärkung der Antikörperantwort wurde basierend auf den Resultaten aus dem zweiten Teil ein IL2-IgM Fusionskonstrukt hergestellt. Die Ko-Transfektion von Antigen-IgM und IL2-IgM kodierender IVT-RNA führte zu einer signifikant stärkeren Antikörperantwort als die Ko-Transfektion von Antigen-IgM und IL2. Für die Initiierung einer erfolgreichen anti-Tumor-Immunantwort ist das Priming antigenspezifischer T-Zellen essentiell. Um die Effizienz dieses Prozesses zu steigern, wurde ein bifunktionelles IL2-mCD40L Fusionskonstrukt hergestellt und sein Einfluss auf die Effektorfunktion von DCs in vitro und in vivo untersucht. Es wurde gezeigt, dass ein RNA kodiertes IL2-mCD40L Fusionsprotein als genetisches Adjuvanz zu einer Effizienzsteigerung des Priming zytotoxischer T-Zellen führt. Somit wurden in dieser Arbeit durch die Optimierung der Pharmakokinetik, die Modifikation der Antigenform und die Herstellung und Evaluierung von Zytokinfusionskonstrukten als genetische Adjuvantien, RNA-basierte Impfstoffe für eine optimierte Induktion von antigenspezifischen Immunantworten weiter verbessert.