Expression der pronozizeptiven Vanilloidrezeptoren TRPV1 und TRPV2 und des antinozizeptiven Cannabinoidrezeptors CB1 in Spinalganglienneuronen der Ratte

Nozizeptive Spinalganglienneurone detektieren mit einer Vielzahl liganden- und spannungsgesteuerter Ionenkanäle noxische Reize, d.h. Reize, die eine Gewebeschädigung bewirken können, wandeln sie in Aktionspotenzialentladungen um und leiten sie über das Rückenmark zum Gehirn weiter, wo eine Schmerzempfindung ausgelöst wird. Die pronozizeptiven transienten Rezeptor-Potenzial-Kanäle der Vanilloidrezeptorfamilie, TRPV1 und TRPV2, sind die klassischen Transduktionsmoleküle für noxische Hitzereize in den Spinalganglien und werden von Reiztemperaturen über 43°C bzw. 52°C aktiviert. Daneben finden sich auch antinozizeptive Membranproteine, wie z.B. der metabotrope Cannabinoidrezeptor CB1. Er koppelt an spannungsgesteuerte Kaliumkanäle, die neben Natrium- und Kalziumkanälen ebenfalls an der neuronalen Erregbarkeit beteiligt sind. Von den spannungsgesteuerten Kaliumkanälen könnte der Kv1.4, der einen schnell inaktivierenden A-Strom vermittelt, an antinozizeptiven Signalwegen beteiligt sein. Um die molekulare Physiologie der Regulation von Nozizeption und Antinozizeption zu charakterisieren, wurde die Expression bzw. Ko-Expression dieser Membranproteine auf der einen als auch die funktionelle Charakterisierung von TRPV1 auf der anderen Seite im Soma der Spinalganglienneurone und im heterologen Expressionssystem untersucht. TRPV1 wurde in je einem Drittel und TRPV2 in je einem Zehntel aller Spinalganglienneurone nachgewiesen. Das Expressionsmuster veränderte sich nicht zwischen verschiedenen Präparationsmethoden, die zur Aufarbeitung der Zellen für unterschiedliche experimentelle Ansätze notwendig sind. Somit können die aus Expressionsanalysen und funktionellen Untersuchungen gewonnenen Ergebnisse miteinander verglichen werden. Obwohl TRPV1 und TRPV2 in unterschiedlich großen Zellen exprimiert werden, überlappen dennoch ihre Größenverteilungen. Durch Ko-Expressionsanalysen konnten hier erstmalig TRPV1-TRPV2-ko-exprimierende Neurone detektiert werden. Mit dem neu entwickelten N-terminalen Antikörper gegen TRPV1 (3C11) konnte gezeigt werden, dass für TRPV1 verschiedene Splice-Varianten existieren. Neben den bereits bekannten Splice-Varianten wurde hier die neue Variante Vr.3’sv isoliert. Diese besitzt zwischen Exon 15 und 16 eine Insertion aus 104 Basen und exprimiert daher einen veränderten C-Terminus. Trotz dieser Veränderung bildeten sich im heterologen Expressionssystem funktionelle Kanäle aus, die im Gegensatz zu den anderen Varianten immer noch durch Capsaicin aktivierbar waren. Vr.3’sv könnte als Homo- oder Heterotetramer die Eigenschaften TRPV1-positiver Neurone beeinflussen. Bei der Bestimmung der Häufigkeit von TRPV1 in einem Gewebe ist somit die Wahl des Antikörpers von entscheidender Bedeutung. Für TRPV2 dagegen gibt es hier keine Hinweise auf Splice-Varianten. TRPV1 wird durch das Vanilloid Capsaicin aktiviert, wobei diese Substanz neurotoxisch ist und eine Degeneration von Neuronen und epidermalen Nervenfasern bewirkt. Hier wurde nun gezeigt, dass unabhängig von den Splice-Varianten nicht alle TRPV1-positiven Neurone bei langer Inkubationszeit absterben. Funktionelle Untersuchungen belegten, dass auch Capsaicin-sensitive Zellen unter dem Einfluss des Agonisten überleben können. Dieser Schutzmechanismus wird möglicherweise von den verschiedenen Splice-Varianten vermittelt. Ko-Expressionsanalysen zeigten, dass der spannungsgesteuerte Kaliumkanal Kv1.4 in nahezu allen TRPV1- aber nicht TRPV2-positiven Neuronen exprimiert wird. Desweiteren ko-exprimierten nahezu alle TRPV1-positiven Neurone auch den Cannabinoidrezeptor CB1. Diese fast vollständige Ko-Lokalisation von CB1 und Kv1.4 in nozizeptiven Spinalganglienneuronen spricht für eine funktionell synergistische Aktivität. Der Kaliumkanal kann unter der regulativen Kontrolle von CB1 als Vermittler von A-Typ-Kaliumströmen an der Kontrolle der repetitiven Entladungen in der Peripherie und der Transmitterausschüttung zentral beteiligt sein. Es ergeben sich daraus Ansatzpunkte für die Entwicklung neuer Medikamente. Mit Kv1.4-Aktivatoren und/oder peripher wirkenden Cannabinoiden könnten die Nebenwirkungen der Cannabinoide im zentralen Nervensystem umgangen werden.

Synthese und radioaktive Markierung potentieller PET- bzw. SPECT-Liganden zur Quantifizierung und Visualisierung der pankreatischen beta-Zell-Masse

Abstract Due to the ongoing efforts in transplanting b-cell mass there is also a great medical interest in specific b-cell imaging agents to quantify the acceptance of transplanted islets in humans in vivo. Additionally, in the context of type 1 diabetes mellitus the chronic and progressive loss of b-cells caused by autoimmune destruction has led to concerted efforts to prevent further loss of b-cells by autoantigen-specific immunotherapy of pre-diabetic patients. nateglinide and glibenclamide are SUR1 ligands used to stimulate insulin secretion in type 2 diabetic patients. They bind to a class of molecules known as the ATP-sensitive potassium channels, located on the insulin producing b-cells of the islets of Langerhans and are therefore excellent candidates as b-cell specific tracers. To obtain a precursor for a direct labelling of nateglinide with [18F]fluoride, the aromatic system of the phenylalanine structure element was derivatised to obtain a phenolic OH-group in 4-position which is capable of further derivatisation. The formed phenylether N-(trans-4-isopropylcyclohexanecarbonyl)-O-(2-hydroxyethyl)-D-tyrosin benzylester was tried to be tosylated according to several literature procedures but none of them was applicable. The catalytic influence of ytterbium(III)triflate in the reaction of toluenesulfonic acid anhydride and the alcohol was investigated. It was found that Yb(III) facilitates the tosylation of the alcohol under non-basic conditions and was extended to the tosylation of a great variety of different alcohols to prove its applicability in general. The radioactive labelling of N-(trans-4-isopropyl-cyclohexanecarbonyl)-O-(2-[18F]fluoroethyl)-D-tyrosine with [18F]F-/ Kryptofix® 222/ K2CO3-system was achieved in radiochemical yields (RCY) of 10 % after deprotection with Pd/ C and H2. In addition to the direct labelling approach, a labelling procedure applying 2[18F]fluoroethyltosylate and N-(trans-4-isopropyl-cyclohexanecarbonyl)-D-tyrosin was performed in 40 % RCY. Unfortunately the determination of the KD value of N-(trans-4-isopropylcyclohexanecarbonyl)-O-(2-fluoroethyl)-D-tyrosine revealed a significant decrease in affinity compared to original nateglinide. The in vivo evaluation of some 18F-labelled glibenclamide derivatives in humans and animals revealed that longer measuring times are warranted because a high liver uptake spoiles the data acquisition and the activity washout proceeds very slowly. Therefore glibenclamide was labelled with a radioisotope with a longer half life such as 99mTc (t1/2 = 6 h) to lengthen the possible time frame for image acquisition. The synthesis of a 99mTc labelled hydrophilic glibenclamide derivative was performed. It is hoped that gliben-clamide is internalised into the b-cell and there binds to the 95 % of intracellular SUR-1 receptors with eventual metablolisation and thus trapping in the cell. The KD-value of the corresponding Re-compound was determined to be 0.5 nM and the insulin secretion properties were similar to those of original glibenclamide. The labelling precursor N-{4-[N,N-bis-(carboxy-methyl)-aminoethyl)-5-chlorobenzene-carboxamido]-ethyl}-benzene-sulfonyl-N'-cyclohexyl urea tris sodium salt was reacted with [99mTc(I)(OH2)3(CO)3] Cl to yield the final N-{4-[99mTc(I)-tricarbonyl-N,N-bis-(carboxymethyl)-aminoethyl)-5-chloro-benzene-carboxamidoethyl]-benzene-sulfonyl}-N'-cyclo-hexyl-urea sodium salt in 70% RCY.

Sensibilisierung hitzeevozierter Ionenströme an nozizeptiven Spinalganglienneuronen der Ratte

Die freien Endigungen von Spinalganglienneuronen sind für die Detektion schmerzhafter Reize verantwortlich. Dabei rufen thermische, chemische oder mechanische Reize Ionenströme über die Membran und dadurch Membranpotentialänderungen hervor. Diese noxisch induzierten Ströme sind in großem Ausmaß durch chemische Substanzen und andere Reize modulierbar. Der Ionenkanal TRPV1 ist für die Detektion zahlreicher chemischer Reize und zumindest eines Teils der noxischen Hitzereize verantwortlich. Im Rahmen dieser Arbeit wurden einige der Mechanismen geklärt, die zur schnellen Sensibilisierung hitzeevozierter Ionenströme führen. Hierfür wurden akut dissoziierte Spinalganglienneurone der Ratte als Modell ihrer peripheren Endigung verwendet und mittels Ganzzellableitung in der patch-clamp-Technik untersucht. Die Verwendung von Trypsin während der Präparation von Spinalganglienneuronen hat keinen funktionellen Einfluss auf hitze- oder capsaicininduzierte Ströme, verbessert aber die Untersuchungsbedingungen für das patch-clamp-Verfahren. Bei 144 akut dissoziierten Spinalganglienneuronen wurden die Stromantworten auf drei im Abstand von 40 s durch Überspülen mit 45,3 bis 46,3°C heißer Extrazellularlösung applizierte einsekündige Hitzereize gemessen. Dabei ließen sich repetitiv reproduzierbare hitzeinduzierte Einwärtsströme von etwa 160 pA erzielen; es konnte keine Tachyphylaxie und nahezu keine Inaktivierung beobachtet werden. Direkt vor dem zweiten Hitzereiz wurden die Neurone für zwei Sekunden mit Extrazellularlösung überspült, die Kontrolllösung, 0,5 μM Capsaicin, 10 μM Natriumnitroprussid oder 10 μM YC-1 enthielt. Es fand sich kein Hinweis, dass Stickstoffmonoxid oder die Guanylatzyklase einen signifikanten Beitrag zur Sensibilisierung von hitzeinduzierten Strömen in Spinalganglienneuronen leisten, wobei ein durch den Versuchsaufbau bedingtes Auswaschen zytosolischer Faktoren, die für den Signalweg notwendig sind, nicht ausgeschlossen werden kann. Bei einer Konzentration von 0,5 μM löst Capsaicin für zwei Sekunden einen sehr kleinen Einwärtsstrom von etwa 33 pA aus und führt innerhalb von zwei Sekunden zu einer schnell reversiblen Sensibilisierung von hitzeinduzierten Einwärtsströmen in Spinalganglienneuronen (p<0,01). Das Ausmaß der Sensibilisierung ist proportional zur Größe des capsaicininduzierten Stromes (r=−0,7, p<0,001). Konstant halten der intrazellulären Calciumkonzentration mittels des Calciumchelators BAPTA verhindert die capsaicininduzierte Sensibilisierung hitzeinduzierter Ströme an Spinalganglienneuronen. Demzufolge beruht die capsaicininduzierte Sensibilisierung trotz der schnellen Kinetik nicht auf einer synergistischen Wirkung der beiden Agonisten Capsaicin und Hitze auf ihren gemeinsamen Rezeptor; vielmehr ist sie von einer Erhöhung der intrazellulären freien Calciumkonzentration abhängig. Funktionelle Änderungen der zellulären Funktion werden häufig durch Proteinkinasen vermittelt. Die zur Gruppe der MAP-Kinasen gehörende ERK (extracellular signal related kinase) wird bei Membrandepolarisation und Calciumeinstrom in die Zelle durch MEK (MAPK/extracellular signal related kinase kinase) aktiviert. Blockade der MEK/ERK-Kaskade durch den spezifischen MEK-Hemmstoff U0126 führt ebenfalls zu einer Aufhebung der Sensibilisierung der Hitzeantworten durch Capsaicin. Applikation von Capsaicin führt innerhalb von zwei Sekunden zu einer schnell reversiblen Sensibilisierung hitzeevozierter Ionenströme an nozizeptiven Spinalganglienneuronen. Diese Sensibilisierung wird durch einen Calciumeinstrom in die Zelle und die dadurch eintretende Aktivierung von Proteinkinasen hervorgerufen. Die MEK/ERK-Kaskade ist ein sehr schnell (deutlich unter 2 s) aktivierbares intrazelluläres Signalsystem, welches bei der Regulation der Empfindlichkeit nozizeptiver Spinalganglienneurone eine entscheidende Rolle spielt; die schnelle Kinetik ist dabei nur durch eine membranständige oder zumindest membrannahe Lokalisation dieser Proteinkinasen erklärbar. Durch Applikation zehnsekündiger Hitzereize lässt sich ebenfalls eine Sensibilisierung hitzeevozierter Ionenströme auslösen, die ebenso ausgeprägt ist, wie die Sensibilisierung durch 0,5 μM Capsaicin (p<0,005). Durch das immer größere Verständnis der Funktionsweise des nozizeptiven Systems ergeben sich ständig neue Ansätze für die Entwicklung neuer Analgetika. So könnte durch Modulation spezifischer intrazellulärer Proteinkinasen der Phosphorylierungszustand und damit die Aktivierbarkeit von Ionenkanälen, die der Transduktion noxischer Reize dienen, positiv beeinflusst werden. Neuere, noch spezifischere Inhibitoren der MEK können der Forschung und später auch der Therapie neue Möglichkeiten eröffnen.

Aktivitätsabhängige Kontrolle der Apoptose in neonatalen kortikalen Neuronen und Etablierung eines Biosensors zur Echtzeitanalyse der Caspase-3-Aktivierung

Die Apoptose spielt eine entscheidende Rolle während der normalen Entwicklung des zentralen Nervensystems. Elektrische Aktivität und die Versorgung mit trophischen Faktoren sind ausschlaggebend für das Überleben von Neuronen. Um zu untersuchen, welche zellulären Prozesse die aktivitätsabhängige Apoptose in organotypischen Schnittkulturen des neugeborenen Neokortex beeinflussen, wurde in der vorliegenden Arbeit immunzytochemisch das Auftreten aktivierter Caspase-3, nach pharmakologischer Beeinflussung von Ionenkanälen und membranständigen Rezeptoren analysiert. Die Unterdrückung neuronaler Aktivität durch den Natriumionenkanalblocker TTX führte zu einem signifikanten Verlust kortikaler Neuronen. Ein ähnlicher Anstieg der Zahl apoptotischer Neurone konnte durch Applikation von Antagonisten ionotroper Glutamatrezeptoren, GABAA-Rezeptoren oder neuronaler Gap Junctions induziert werden. Jedoch konnte bei einigen Antagonisten die apoptosefördernde Wirkung erst nach längerer Einwirkung beobachtet werden. Im Weiteren wurde eine Methode etabliert, mit deren Hilfe eine Echtzeitanalyse der Apoptose kortikaler Neurone unter dem Entzug trophischer Faktoren in Gegenwart unterschiedlicher extrazellulärer Kaliumkonzentrationen ermöglicht wurde. Dazu wurden dissoziierte kortikale Kulturen mit dem pCaspase3-sensor Vektor transfiziert. Das durch dieses Plasmid codierte fluoreszente Protein wird Caspase-3 abhängig gespalten. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass der Caspase3-sensor spezifisch für die Aktivierung der Caspase-3 ist, und dass die Überlebensfähigkeit der transfizierten Neurone durch das Transfektionsprotokoll nicht beeinflusst wird.

Surface-plasmon optical and electrochemical characterization of biofunctional surface architectures

The development and characterization of biomolecule sensor formats based on the optical technique Surface Plasmon Resonance (SPR) Spectroscopy and electrochemical methods were investigated. The study can be divided into two parts of different scope. In the first part new novel detection schemes for labeled targets were developed on the basis of the investigations in Surface-plamon Field Enhanced Spectroscopy (SPFS). The first one is SPR fluorescence imaging formats, Surface-plamon Field Enhanced Fluorescence Microscopy (SPFM). Patterned self assembled monolayers (SAMs) were prepared and used to direct the spatial distribution of biomolecules immobilized on surfaces. Here the patterned monolayers would serve as molecular templates to secure different biomolecules to known locations on a surface. The binding processed of labeled target biomolecules from solution to sensor surface were visually and kinetically recorded by the fluorescence microscope, in which fluorescence was excited by the evanescent field of propagating plasmon surface polaritons. The second format which also originates from SPFS technique, Surface-plamon Field Enhanced Fluorescence Spectrometry (SPFSm), concerns the coupling of a fluorometry to normal SPR setup. A spectrograph mounted in place of photomultiplier or microscope can provide the information of fluorescence spectrum as well as fluorescence intensity. This study also firstly demonstrated the analytical combination of surface plasmon enhanced fluorescence detection with analyte tagged by semiconducting nano- crystals (QDs). Electrochemically addressable fabrication of DNA biosensor arrays in aqueous environment was also developed. An electrochemical method was introduced for the directed in-situ assembly of various specific oligonucleotide catcher probes onto different sensing elements of a multi-electrode array in the aqueous environment of a flow cell. Surface plasmon microscopy (SPM) is utilized for the on-line recording of the various functionalization steps. Hybridization reactions between targets from solution to the different surface-bound complementary probes are monitored by surface-plasmon field-enhanced fluorescence microscopy (SPFM) using targets that are either labeled with organic dyes or with semiconducting quantum dots for color-multiplexing. This study provides a new approach for the fabrication of (small) DNA arrays and the recording and quantitative evaluation of parallel hybridization reactions. In the second part of this work, the ideas of combining the SP optical and electrochemical characterization were extended to tethered bilayer lipid membrane (tBLM) format. Tethered bilayer lipid membranes provide a versatile model platform for the study of many membrane related processes. The thiolipids were firstly self-assembled on ultraflat gold substrates. Fusion of the monolayers with small unilamellar vesicles (SUVs) formed the distal layer and the membranes thus obtained have the sealing properties comparable to those of natural membranes. The fusion could be monitored optically by SPR as an increase in reflectivity (thickness) upon formation of the outer leaflet of the bilayer. With EIS, a drop in capacitance and a steady increase in resistance could be observed leading to a tightly sealing membrane with low leakage currents. The assembly of tBLMs and the subsequent incorporation of membrane proteins were investigated with respect to their potential use as a biosensing system. In the case of valinomycin the potassium transport mediated by the ion carrier could be shown by a decrease in resistance upon increasing potassium concentration. Potential mediation of membrane pores could be shown for the ion channel forming peptide alamethicin (Alm). It was shown that at high positive dc bias (cis negative) Alm channels stay at relatively low conductance levels and show higher permeability to potassium than to tetramethylammonium. The addition of inhibitor amiloride can partially block the Alm channels and results in increase of membrane resistance. tBLMs are robust and versatile model membrane architectures that can mimic certain properties of biological membranes. tBLMs with incorporated lipopolysaccharide (LPS) and lipid A mimicking bacteria membranes were used to probe the interactions of antibodies against LPS and to investigate the binding and incorporation of the small antimicrobial peptide V4. The influence of membrane composition and charge on the behavior of V4 was also probed. This study displays the possibility of using tBLM platform to record and valuate the efficiency or potency of numerous synthesized antimicrobial peptides as potential drug candidates.

Abflusslose Senken – Instrumente in der Landschaftsanalyse und Indikatoren rezenter Krustenbewegungen

Innerhalb des Untersuchungsgebiets Schleswig-Holstein wurden 39.712 topographische Hohlformen detektiert. Genutzt wurden dazu ESRI ArcMap 9.3 und 10.0. Der Datenaufbereitung folgten weitere Kalkulationen in MATLAB R2010b. Jedes Objekt wurde räumlich mit seinen individuellen Eigenschaften verschnitten. Dazu gehörten Fläche, Umfang, Koordinaten (Zentroide), Tiefe und maximale Tiefe der Hohlform und Formfaktoren wie Rundheit, Konvexität und Elongation. Ziel der vorgestellten Methoden war die Beantwortung von drei Fragestellungen: Sind negative Landformen dazu geeignet Landschaftseinheiten und Eisvorstöße zu unterscheiden und zu bestimmen? Existiert eine Kopplung von Depressionen an der rezenten Topographie zu geologischen Tiefenstrukturen? Können Senken unterschiedlicher Entstehung anhand ihrer Formcharakteristik unterteilt werden? Die vorgenommene Klassifikation der großen Landschaftseinheiten basiert auf der Annahme, dass sowohl Jungmoränengebiete, ihre Vorflächen als auch Altmoränengebiete durch charakteristische, abflusslose Hohlformen, wie Toteislöcher, Seen, etc. abgegrenzt werden können. Normalerweise sind solche Depressionen in der Natur eher selten, werden jedoch für ehemalige Glaziallandschaften als typisch erachtet. Ziel war es, die geologischen Haupteinheiten, Eisvorstöße und Moränengebiete der letzten Vereisungen zu differenzieren. Zur Bearbeitung wurde ein Detektionsnetz verwendet, das auf quadratischen Zellen beruht. Die Ergebnisse zeigen, dass durch die alleinige Nutzung von Depressionen zur Klassifizierung von Landschaftseinheiten Gesamtgenauigkeiten von bis zu 71,4% erreicht werden können. Das bedeutet, dass drei von vier Detektionszellen korrekt zugeordnet werden können. Jungmoränen, Altmoränen, periglazialeVorflächen und holozäne Bereiche können mit Hilfe der Hohlformen mit großer Sicherheit voneinander unterschieden und korrekt zugeordnet werden. Dies zeigt, dass für die jeweiligen Einheiten tatsächlich bestimmte Senkenformen typisch sind. Die im ersten Schritt detektierten Senken wurden räumlich mit weiterreichenden geologischen Informationen verschnitten, um zu untersuchen, inwieweit natürliche Depressionen nur glazial entstanden sind oder ob ihre Ausprägung auch mit tiefengeologischen Strukturen in Zusammenhang steht. 25.349 (63,88%) aller Senken sind kleiner als 10.000 m² und liegen in Jungmoränengebieten und können vermutlich auf glaziale und periglaziale Einflüsse zurückgeführt werden. 2.424 Depressionen liegen innerhalb der Gebiete subglazialer Rinnen. 1.529 detektierte Hohlformen liegen innerhalb von Subsidenzgebieten, von denen 1.033 innerhalb der Marschländer im Westen verortet sind. 919 große Strukturen über 1 km Größe entlang der Nordsee sind unter anderem besonders gut mit Kompaktionsbereichen elsterzeitlicher Rinnen zu homologisieren.344 dieser Hohlformen sind zudem mit Tunneltälern im Untergrund assoziiert. Diese Parallelität von Depressionen und den teils über 100 m tiefen Tunneltälern kann auf Sedimentkompaktion zurückgeführt werden. Ein Zusammenhang mit der Zersetzung postglazialen, organischen Materials ist ebenfalls denkbar. Darüber hinaus wurden in einer Distanz von 10 km um die miozän aktiven Flanken des Glückstadt-Grabens negative Landformen detektiert, die Verbindungen zu oberflächennahen Störungsstrukturen zeigen. Dies ist ein Anzeichen für Grabenaktivität während und gegen Ende der Vereisung und während des Holozäns. Viele dieser störungsbezogenen Senken sind auch mit Tunneltälern assoziiert. Entsprechend werden drei zusammenspielende Prozesse identifiziert, die mit der Entstehung der Hohlformen in Verbindung gebracht werden können. Eine mögliche Interpretation ist, dass die östliche Flanke des Glückstadt-Grabens auf die Auflast des elsterzeitlichen Eisschilds reagierte, während sich subglazial zeitgleich Entwässerungsrinnen entlang der Schwächezonen ausbildeten. Diese wurden in den Warmzeiten größtenteils durch Torf und unverfestigte Sedimente verfüllt. Die Gletschervorstöße der späten Weichselzeit aktivierten erneut die Flanken und zusätzlich wurde das Lockermaterial exariert, wodurch große Seen, wie z. B. der Große Plöner See entstanden sind. Insgesamt konnten 29 große Depressionen größer oder gleich 5 km in Schleswig-Holstein identifiziert werden, die zumindest teilweise mit Beckensubsidenz und Aktivität der Grabenflanken verbunden sind, bzw. sogar auf diese zurückgehen.Die letzte Teilstudie befasste sich mit der Differenzierung von Senken nach deren potentieller Genese sowie der Unterscheidung natürlicher von künstlichen Hohlformen. Dazu wurde ein DEM für einen Bereich im Norden Niedersachsens verwendet, das eine Gesamtgröße von 252 km² abdeckt. Die Ergebnisse zeigen, dass glazial entstandene Depressionen gute Rundheitswerte aufweisen und auch Elongation und Exzentrizität eher kompakte Formen anzeigen. Lineare negative Strukturen sind oft Flüsse oder Altarme. Sie können als holozäne Strukturen identifiziert werden. Im Gegensatz zu den potentiell natürlichen Senkenformen sind künstlich geschaffene Depressionen eher eckig oder ungleichmäßig und tendieren meist nicht zu kompakten Formen. Drei Hauptklassen topographischer Depressionen konnten identifiziert und voneinander abgegrenzt werden: Potentiell glaziale Senken (Toteisformen), Flüsse, Seiten- und Altarme sowie künstliche Senken. Die Methode der Senkenklassifikation nach Formparametern ist ein sinnvolles Instrument, um verschiedene Typen unterscheiden zu können und um bei geologischen Fragestellungen künstliche Senken bereits vor der Verarbeitung auszuschließen. Jedoch zeigte sich, dass die Ergebnisse im Wesentlichen von der Auflösung des entsprechenden Höhenmodells abhängen.

Roman aqueducts and calcareous sinter deposits as a proxy for environmental changes

Die im Süden der Türkei gelegen, antiken Städte Aspendos und Patara, waren in der Römerzeit zwei bedeutende Handelszentren mit hoher Bevölkerungsdichte. Aquädukte versorgten beide Städte mit carbonathaltigem Wasser, wobei sich Kalksinter (Calciumcarbonat) in der Kanalrinne ablagerte. Dabei lagern sich im Wechsel eine hellere und dunklere Kalksinterlage ab, die als Sinterpaar bezeichnet wird. Um die Entstehung dieser Sinterpaare besser zu verstehen, und die beteiligten Prozesse mit saisonalen Veränderungen der Umwelt zu korrelieren, werden in der vorliegenden Arbeit laminierten Sinterablagerungen mit geochemischen und petrographischen Methoden untersucht.rnEntlang der Kanalrinne beider Aquädukte wurden an mehreren Stellen Proben entnommen. Es wurde untersucht in wieweit sich die Sinterstruktur aufgrund von Änderungen in der Neigung des Wasserkanals oder des Kanaltyps ändert. Um die Kristallform und die kristallografische Orientierung der Kristalle innerhalb der verschiedenen Sinterpaare zu untersuchen, wurden die entnommenen laminierten Kalksinterablagerungen mit Hilfe optischer Mikroskopie und EBSD (Electron Backscatter Diffraction) analysiert. Der Electron Probe Micro-Analyzer (EPMA) wurde verwendet, um saisonale Schwankungen der Hauptelementverteilung und den Anteil der stabilen Isotope im Wasser zu bestimmen. Die LA-ICP-MS (Laser Ablation-induktiv gekoppeltem Plasma-Massenspektrometrie) Spurenelementanalyse wurde durchgeführt, um kleinste Schwankungen der Spurenelemente zu finden. Basierend auf diesen Analysen wurde festgestellt, dass laminierten Kalksinterablagerungen laterale Änderungen in der Aquäduktstruktur und -neigung, jahreszeitliche Änderungen der Wasserchemie, der Temperatur sowie der Entgasungsrate während eines Jahres widerspiegeln. Die Kalksinterablagerungen zeigen eine deutliche Laminierung in Form von feinkörnig-porösen und grobkörnig-dichten Schichten, die trockene und nasse Jahreszeiten anzeigen. Feinkörnige Schichten zeigen eine hohe Epifluoreszenz aufgrund reichhaltiger organischer Inhalte, die vermutlich eine Folge der bakteriellen Aktivität während der warmen und trockenen Jahreszeit sind. Stabile Sauerstoff und Kohlenstoff-Isotop-Kurven entsprechen auch den jahreszeitlichen Schwankungen der verschiedenen Schichtenpaare. Vor allem δ 18O spiegelt jährliche Veränderungen in der Temperatur und jahreszeitliche Veränderungen des Abflusses wieder. Das wichtigste Ergebnis ist, dass die Periodizität von δ 18O durch Erwärmen des Wassers im Wasserkanal und nicht durch die Verdunstung oder der Brunnenwasser-Charakteristik verursacht wird. Die Periodizität von δ 13C ist komplexer Natur, vor allem zeigen δ 18O und δ 13C eine Antikorrelation entlang der Lamellenpaare. Dies wird wohl vor allem durch Entgasungsprozesse im Aquädukt verursacht. Die Ergebnisse der Spurenelemente sind meist inkonsistent und zeigen keine signifikanten Veränderungen in den verschiedenen Lamellenpaaren. Die Isotope Mg, Sr und Ba zeigen hingegen bei einigen Proben eine positive Korrelation und erreichen Höchstwerte innerhalb feinkörnig-poröser Schichten. Auch sind die Hauptelementwerte von Fe, K, Si und anderer detritischer Elemente innerhalb der feinkörnige-porösen Schichten maximal. Eine genaue Datierung der Kalksinterablagerungen ist wünschenswert, da der Zeitraum, in dem die Aquädukte aktiv waren, bereits archäologisch auf 200-300 Jahre festgelegt wurde. Paläomagnetische und 14C-Datierung geben keine brauchbare Ergebnisse. Die U/Th Isotopie wird durch eine hohe Anfangskonzentration von Th in den Proben behindert. Trotz dieser Schwierigkeiten war eine U/Th Datierung an einem Testbeispiel des Béziers Aquädukt erfolgreich. Mit Hilfe von analogen Untersuchungen an aktiven Wasserkanälen der heutigen Zeit, werden die Ablagerungsmechanismen und die geochemische Entwicklung der laminierten Sinterschichten besser verstanden. Ein weiteres laufendes Projekt dieser Doktorarbeit ist die Überwachung von Sinterabscheidungen und der saisonale Zusammensetzung des Wassers an einigen heute noch aktiven Aquädukten. Das Ziel ist die Untersuchung der jetzigen Calciumcarbonatabscheidungen in Aquäduktkanälen unter den heutigen Umgebungsbedingungen. Erste Ergebnisse zeigen, dass kleine regelmäßige jahreszeitliche Veränderungen in der Isotopenzusammensetzung des Wassers vorliegen, und dass die beobachtete Periodizität der stabilen Isotope aufgrund von Änderungen im eigentlichen Kanal entstanden ist. Die Untersuchung von Kalksinterablagerungen in römischen Aquädukten liefern vielversprechende Ergebnisse, für die Untersuchung des Paläöklimas, der Archaeoseismologie und anderer Umweltbedingungen in der Römerzeit. Diese Studie beschränkt sich auf zwei Aquädukte. Die Untersuchungen weiterer Aquädukte und einer Überwachung, der noch in Betrieb stehenden Aquädukte werden genauere Ergebnisse liefern.

Development of models and methods to simulate peptide-assisted nucleation and growth of calcium-minerals

In den vergangenen Jahren wurden einige bislang unbekannte Phänomene experimentell beobachtet, wie etwa die Existenz unterschiedlicher Prä-Nukleations-Strukturen. Diese haben zu einem neuen Verständnis von Prozessen, die auf molekularer Ebene während der Nukleation und dem Wachstum von Kristallen auftreten, beigetragen. Die Auswirkungen solcher Prä-Nukleations-Strukturen auf den Prozess der Biomineralisation sind noch nicht hinreichend verstanden. Die Mechanismen, mittels derer biomolekulare Modifikatoren, wie Peptide, mit Prä-Nukleations-Strukturen interagieren und somit den Nukleationsprozess von Mineralen beeinflussen könnten, sind vielfältig. Molekulare Simulationen sind zur Analyse der Formation von Prä-Nukleations-Strukturen in Anwesenheit von Modifikatoren gut geeignet. Die vorliegende Arbeit beschreibt einen Ansatz zur Analyse der Interaktion von Peptiden mit den in Lösung befindlichen Bestandteilen der entstehenden Kristalle mit Hilfe von Molekular-Dynamik Simulationen.rnUm informative Simulationen zu ermöglichen, wurde in einem ersten Schritt die Qualität bestehender Kraftfelder im Hinblick auf die Beschreibung von mit Calciumionen interagierenden Oligoglutamaten in wässrigen Lösungen untersucht. Es zeigte sich, dass große Unstimmigkeiten zwischen etablierten Kraftfeldern bestehen, und dass keines der untersuchten Kraftfelder eine realistische Beschreibung der Ionen-Paarung dieser komplexen Ionen widerspiegelte. Daher wurde eine Strategie zur Optimierung bestehender biomolekularer Kraftfelder in dieser Hinsicht entwickelt. Relativ geringe Veränderungen der auf die Ionen–Peptid van-der-Waals-Wechselwirkungen bezogenen Parameter reichten aus, um ein verlässliches Modell für das untersuchte System zu erzielen. rnDas umfassende Sampling des Phasenraumes der Systeme stellt aufgrund der zahlreichen Freiheitsgrade und der starken Interaktionen zwischen Calciumionen und Glutamat in Lösung eine besondere Herausforderung dar. Daher wurde die Methode der Biasing Potential Replica Exchange Molekular-Dynamik Simulationen im Hinblick auf das Sampling von Oligoglutamaten justiert und es erfolgte die Simulation von Peptiden verschiedener Kettenlängen in Anwesenheit von Calciumionen. Mit Hilfe der Sketch-Map Analyse konnten im Rahmen der Simulationen zahlreiche stabile Ionen-Peptid-Komplexe identifiziert werden, welche die Formation von Prä-Nukleations-Strukturen beeinflussen könnten. Abhängig von der Kettenlänge des Peptids weisen diese Komplexe charakteristische Abstände zwischen den Calciumionen auf. Diese ähneln einigen Abständen zwischen den Calciumionen in jenen Phasen von Calcium-Oxalat Kristallen, die in Anwesenheit von Oligoglutamaten gewachsen sind. Die Analogie der Abstände zwischen Calciumionen in gelösten Ionen-Peptid-Komplexen und in Calcium-Oxalat Kristallen könnte auf die Bedeutung von Ionen-Peptid-Komplexen im Prozess der Nukleation und des Wachstums von Biomineralen hindeuten und stellt einen möglichen Erklärungsansatz für die Fähigkeit von Oligoglutamaten zur Beeinflussung der Phase des sich formierenden Kristalls dar, die experimentell beobachtet wurde.

Signalling mechanisms affecting regulated neurotrophin secretion in hippocampal neurons

Die Neurotrophine aus Säugetiere BDNF und NT-3 sind von Neuronen sekretierte Wachstumsfaktoren. Ferner sind Neurotrophine in verschiedene Formen der aktivitätsabhängigen synaptische Plastizität involviert. Obwohl die Ausschüttung von Neurotrophine aus Synapsen beschrieben worden ist, sind die intrazellulären Signalkaskaden, die die synaptische Ausschüttung von Neurotrophine regulieren, bei weitem nicht verstanden. Deswegen ist die Analyse der Sekretion von Neurotrophine auf subzellulärer Ebene erforderlich, um die genaue Rolle von präsynaptische und postsynaptische NT-Sekretion in der synaptischen Plastizität aufzudecken. In der vorliegenden Arbeit wurden die Kulturen von dissoziierten hippocampalen Neuronen aus Ratten mit grün fluoreszierenden Protein-markierten Konstrukten von BDNF und NT-3 transfiziert und Neurotrophine-enthaltenden Vesikeln durch die Colokalisierung mit dem cotransfizierten postsynaptischen Marker PSD-95-DsRed an glutamatergen Synapsen identifiziert. Depolarisationsinduzierte Sekretion von BDNF und NT-3 wurde per Direktaufnahme am Fluoreszenzmikroskop beobachtet. Die unvermittelte postsynaptische Depolarisation mit erhöhtem Kalium, in Gegenwart von Inhibitoren der synaptischen Transmission, erlaubte die Untersuchung der Signalwege, die am postsynaptischen Sekretionsprozess der Neurotrophinvesikel beteiligt sind. Es konnte gezeigt werden, dass die depolarisationsinduzierte postsynaptische Ausschüttung der Neurotrophine durch Calcium-Einstrom ausgelöst wird, entweder über L-Typ-spannungsabhängige Calcium-Kanäle oder über NMDA-Rezeptoren. Eine anschließende Freisetzung von Calcium aus intrazellulären Speichern über Ryanodin-Rezeptoren ist für den Sekretionsprozess erforderlich. Die postsynaptische Neurotrophinausschüttung wird durch KN-62 und KN-93 gehemmt, was auf eine unmittelbare Abhängigkeit von aktiver alpha-Calcium-Calmodulin-abhängige Proteinkinase II (CaMKII) hinweist. Der Inhibitor der cAMP/Proteinkinase A (PKA), Rp-cAMP-S, sowie der NO-Donor, SNP, minderten die Neurotrophinausschüttung. Hingegen blieben die Erhöhung des intrazellulären cAMP und der NO-Synthase-Inhibitor L-NMMA ohne Wirkung. Mit dem Trk-Inhibitor K252a konnte gezeigt werden, dass autokrine Neurotrophin-induzierte Neurotrophinausschüttung nicht an der synaptischen Freisetzung der Neurotrophine beiträgt und, dass BDNF seine eigene postsynaptische Sekretion nicht auslöst. Freisetzungsexperimente mit dem Fluoreszenz-Quencher Bromphenolblau konnten den Nachweis erbringen, dass asynchrone und anhaltende Fusionsporenöffnung von Neurotrophinvesikeln während der Sekretion stattfindet. Wegen der im Vergleich zum komplexen Sekretionsprozess schnellen Fusionsporenöffnung, scheint die Freisetzungsgeschwindigkeit von Neurotrophine durch ihre Diffusion aus dem Vesikel begrenzt. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse eine starke Abhängigkeit der aktivitätsabhängigen postsynaptischen Neurotrophinausschüttung vom Calcium-Einstrom, von der Freisetzung von Calcium aus internen Speichern, von der Aktivierung der CaMKII und einem intakten Funktion der PKA, während der Trk-Signalweg, die Aktivierung von Natrium-Kanäle und NO-Signale nicht erforderlich sind.