Pathogenetische Bedeutung der Glutathionperoxidase-1 in der arteriellen Gefäßwand

Die antioxidative Aktivität des Enzyms Glutathionperoxidase-1 (GPx-1) schützt vor Atherosklerose und ihren Folgeerkrankungen. In einer Vorstudie konnten wir zeigen, dass der Mangel an GPx-1 die Atheroskleroseentwicklung in Apolipoprotein E defizienten (ApoE-/-) Mäusen beschleunigt und modifiziert. Allerdings sind die Verteilung der GPx-1 in atherosklerotischen Läsionen und die Mechanismen für den erhöhten Makrophagengehalt in der Läsion noch nicht geklärt. Deshalb haben wir (1) die in-situ Expression der GPx-Isoformen in atherosklerotischen Läsionen von GPx-1-/-ApoE-/- und ApoE-/- Mäusen und (2) den Einfluss der GPx-1 Defizienz auf die Schaumzellbildung und Proliferation der Peritonealmakrophagen in ApoE-/- Mäusen untersucht. Die GPx-1-/-ApoE-/- und ApoE-/- Weibchen wurden für 6 und 12 Wochen auf einer atherogenen „Western-type“ Diät gehalten. Die in situ-Hybridisierung zeigte, dass die verschiedenen Isoformen der GPx (GPx-1, GPx-3, GPx-4) vorwiegend in Makrophagen, nicht jedoch in glatten Muskelzellen der atherosklerotischen Läsionen von ApoE-/- Mäusen exprimiert wurden. Für die in vitro Untersuchungen wurden 5 Monate alte, GPx-1 defiziente und Wildtyp-Mäuse, gehalten auf Normaldiät, verwendet. Die Öl-Rot-O Färbung zeigte, dass die GPx-1 Defizienz die OxLDL (oxidiertes LDL) - und E-LDL (enzymatisch modifiziertes LDL) - induzierte Schaumzellbildung förderte. Darüber hinaus war die OxLDL-induzierte Cholesterinakkumulation (zellulärer Cholesterinester/ Cholesterin-Gehalt) in GPx-1 defizienten Makrophagen verstärkt, sodass ein Mangel an GPx-1 die Aufnahme von OxLDL durch Monozyten und damit die Umwandlung in Schaumzellen beschleunigt. Hinsichtlich der Proliferation zeigte sich, dass MCSF (Macrophage Colony-Stimulating Facotr) ein stärkerer Stimulus als OxLDL ist. Ein Mangel an GPx-1 fördert die Proliferation zusätzlich. Daran ist die ERK1/2 (extracellular-signal regulated kinase 1/2) - Kaskade beteiligt, denn es wurde eine schnelle Phosphorylierung der ERK1/2-Kaskade durch MCSF und/oder OxLDL nachgewiesen. Entsprechend reduzieren ERK1/2-Inhibitoren die proliferative Aktivität der Makrophagen. Die Hemmung der p38-MAPK (p38 mitogen-activated protein kinase) führt zur vermehrten Proliferation und bei gleichzeitig verringerter Caspase-3/7 Aktivität der Makrophagen unabhängig von der Expression der GPx-1. Ein Mangel an GPx-1 hat auch keinen Einfluss auf die MCSF-vermittelte Aktivierung der p38-MAPK und JNK (c-Jun N-terminal kinase). Zusammenfassend läßt sich feststellen, dass die GPx-1-Defizienz einen signifikanten Einfluss auf die Schaumzellbildung und Proliferation von Makrophagen hat, was zur Beschleunigung der Atherosklerose und zu vermehrter Zellularität der entstehenden atherosklerotischen Läsionen führt. Die Proliferation wird über den ERK1/2 Signal-transduktionsweg positiv und über den p38-MAPK Weg negativ reguliert, wobei die ERK1/2-Kaskade empfindlich gegenüber oxidativem Stress bei GPx-1-Defizienz ist.

Transformation, Progression und Zellinienspezifität der chronischen myeloischen Leukämie

Die Analyse der CML-Zellinie K562 mittels Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH), Multiplex-FISH (M-FISH) und comparativer genomischer Hybridisierung (CGH) ergab einen hypotriploiden Karyotyp mit 67 Chromosomen und 21 verschiedenen Marker-Chromosomen. Das bei über 90% der CML-Patienten nachgewiesene Ph-Chromosom entsteht durch die reziproke Translokation t(9;22)(q34;q11). Bei 5 - 10% der Patienten resultiert das Ph-Chromosom aus varianten Translokation. Anhand der Untersuchung dreier varianter Translokation mittels Bruchpunkt-übergreifender FISH-Proben für die BCR- und ABL-Gene werden drei verschiedene Mechanismen der Entstehung komplexer Translokationen dargestellt. Das Auftreten sekundärer Aberrationen wurde in 15 CML-Blastenkrisen untersucht. Zudem wurde anhand der CGH-Analyse von CD34-positiven Zellen, Monozyten, Granulozyten und T-Zellen die Zellinienspezifität sekundärer Aberrationen untersucht. In einem Fall wurde eine sekundäre Aberration in allen vier Fraktionen gefunden. In zwei Fällen traten sekundäre Aberrationen in allen untersuchten Fraktionen mit Ausnahme der T-Zellen auf. Aufgrund dieser Ergebnisse lassen sich zwei alternative Modelle der Tumor-Progression der CML ableiten: 1. Sekundäre Mutatonen treten vor der Differenzierung der hämatopoetischen Stammzelle auf. 2. Sekundäre Mutationen treten in einer hämatopoetischen Vorläuferzelle nach der T-Zell-Differenzierung auf.

Processing of O 6 - methylguanine in mammalian cells

DNA methylating compounds are widely used as anti-cancer chemotherapeutics. The pharmaceutical critical DNA lesion induced by these drugs is O6-methylguanine (O6MeG). O6MeG is highly mutagenic and genotoxic, by triggering apoptosis. Despite the potency of O6MeG to induce cell death, the mechanism of O6MeG induced toxicity is still poorly understood. Comparing the response of mouse fibroblasts wild-type (wt) and deficient for ataxia telangiectasia mutant protein (ATM), a kinase responsible for both the recognition and the signalling of DNA double-strand breaks (DSBs), it was shown that ATM deficient cells are more sensitive to the methylating agents N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG), methyl methansulfonate (MMS) and the anti-cancer drug temozolomide, in both colony formation and apoptosis assays. This clearly shows that DSBs are involved in O6MeG toxicity. By inactivating the O6MeG repair enzyme O6-methylguanine-DNA methyltransferase (MGMT) with the specific inhibitor O6-benzylguanine (O6BG), ATM wt and deficient cells became more sensitive to MNNG and MMS. The opposite effect was observed when over-expressing MGMT in ATM -/- cells. The results show that O6MeG is the critical DNA lesion causing death in ATM cells following MNNG treatment, and is partially responsible for the toxicity observed following MMS treatment. Furthermore, by inhibiting the ATM kinase activity with caffeine, it was shown that the resistance of wt cells to MNNG was due to the kinase activity of ATM, as wt cells underwent more apoptosis following methylating agent treatment in the presence of caffeine. Apoptosis and caspase-3 activation were late events, starting 48h after treatment. This lends support to the model where O6MeG lesions are converted into DSBs during replication. As ATM wt and deficient cells showed similar G2/M blockage and Chk1 activation following MNNG and MMS treatment, it was concluded that the protective effect of ATM is not due to cell cycle progression control. The hypersensitivity of ATM deficient cells was accompanied by their inability to activate the anti-apoptotic NFkB pathway. In a second part of this study, it was shown that the inflammatory cytokine IL-1 up-regulates the DNA repair gene apurinic endonuclease 2 (APEX2). Up-regulation of APEX2 occurred by transcriptional regulation as it was abrogated by actinomycin D. APEX2 mRNA accumulation was accompanied by increase in APEX2 protein level. IL-1 induced APEX2 expression as well as transfection of cells with APEX2 cDNA positively correlated with a decrease in apoptosis after treatment with genotoxic agents, particularly affecting cell death after H2O2. This indicates an involvement of APEX2 in the BER pathway in cells responding to IL-1.

Modulation der Strahlen- und Chemosensitivität menschlicher Tumorzellen durch Interferon

Pankreaskarzinome und maligne Melanome weisen eine hohe Resistenz gegenüber Zytostatika und Bestrahlung in der Therapie auf. Die Behandlung eines metastasierenden Pankreaskarzinoms besteht aus einer Kombination aus 5-FU, CDDP und IR. Für die Behandlung des malignen Melanoms ist das methylierende Agenz DTIC das Mittel erster Wahl. Das ebenfalls methylierende Agenz TMZ, welches jedoch in Deutschland noch nicht für die Behandlung von malignen Melanomen zugelassen ist, erlangt immer größere Bedeutung. Die Ansprechrate der Tumore kann durch Kombination mit IFNs erhöht werden. In der vorliegenden Arbeit wurde an Pankreaskarzinom- bzw. Melanomzelllinien untersucht, ob IFNs einen radio- bzw. chemosensibilisierender Effekt ausüben und, wenn ja, welcher Mechanismus hierfür verantwortlich ist. Es wurden zehn Pankreaskarzinom-Zelllinien (Panc-1, Su8686, Capan-1, Capan-2, Bxpc-3, PA-TU 8988T, Aspc-1, HS 766T, Mia-PaCa-2 und PA-TU 8902) untersucht. Diese zeigten eine hohe Variabilität in ihrer intrinsischen Radiosensitivität sowie in ihrer Sensitivität gegenüber IFN-alpha und IFN-beta. IFN-beta erwies sich als toxischer im Vergleich zu IFN-alpha. Die radiosensibilisierende Wirkung der IFNs an Pankreaskarzinom-Zelllinien war moderat, wobei IFN-beta im Vergleich zu IFN-alpha effektiver war. Der radiosensibilisierende Effekt ging mit einer deutlichen Erhöhung der alpha-Komponente, der Überlebenskurven einher und kam durch eine IFN-beta vermittelte Verstärkung der IR-induzierten Apoptoserate zustande. Dies wurde sowohl durch SubG1 als auch durch Annexin V / PI Messungen gezeigt. Einen Einfluss von IFN-beta auf den Zellzyklus und die DSB-Reparatur konnte durch funktionelle Untersuchungen sowie durch PCR bzw. Western-Blot-Analysen als Grund für den sensibilisierdenen Effekt ausgeschlossen werden. Ein sensibilisierender Effekt von IFN-beta auf die durch TMZ-induzierte Zytotoxizität war für die Pankreaskarzinom-Zelllinien weder in MGMT-profizientem noch –depletiertem Zustand zu beobachten. Zur Untersuchung der sensibilisierenden Eigenschaften von IFNs gegenüber TMZ in malignen Melanomzelllinien wurden p53-Wildtyp (D05 und A375) und mutierte Zelllinien (D14 und RPMI 7951) untersucht. Gegenüber alleiniger TMZ-Behandlung reagierten die untersuchten p53-Wildtyp Melanomzelllinien nicht sensitiver auf eine Behandlung mit TMZ als p53-mutierte Zelllinien. Der Nachweis des Spaltprodukts der Caspase-9 lieferte einen Hinweis darauf, dass in den Melanomzelllinien unabhängig vom p53-Status nach alleiniger TMZ-Behandlung der mitochondriale Apoptoseweg aktiviert wird. Durch eine Vorbehandlung der Zellen mit IFN-alpha oder IFN-beta konnte die TMZ-induzierte Apoptoserate in malignen Melanomzellen deutlich gesteigert werden. In p53-Wildtyp Melanomzellen war der chemosensibilisierende Effekt der IFNs besonders ausgeprägt. IFN-beta erwies sich hierbei als effektiver, weshalb es für die folgenden Versuche verwendet wurde. Durch stabile Transfektion der Zelllinie D05 mit MGMT konnte das durch TMZ-induzierte Addukt O6MeG als für den sensibilisieredenen Effekt ausschlaggebende DNA-Schädigung charakterisiert werden. Western-Blot-Analysen und gamma-H2AX-Immunfluoreszenz Untersuchungen konnten einen Einfluss von IFN-beta auf die Prozessierung der Läsion O6MeG sowie einen Einfluss von IFN-beta auf die Induktion und Reparatur von TMZ verursachten DSBs ausschließen. Durch Experimente mit einem Fas-aktivierenden Antikörper und durch eine stabile Transfektion der Zelllinien D05 und A375 mit DN-FADD konnte gezeigt werden, dass p53-Wildtyp Melanomzellen nicht oder nur eingeschränkt in der Lage sind, nach TMZ-Behandlung über den Fas-Rezeptor Signalweg Apoptose zu induzieren. Ausschlaggebend hierfür ist die geringe Pro-Caspase-8 Expression dieser Zelllinien. Eine IFN-beta Vorbehandlung bewirkte eine Reaktivierung des Fas-Rezeptor Signalweges, was mit einer verstärkten Expression der Pro-Caspase-8 einherging. Durch Experimente mit Caspase-8 siRNA konnte diese IFN-beta induzierte Verstärkung der Pro-Caspase-8 Expression als entscheidender Faktor für den sensibilisierenden Effekt ausgemacht werden. Zum ersten Mal konnte damit in dieser Arbeit gezeigt werden, dass p53-Wildtyp Melanomzellen durch eine IFN-beta vermittelte Hochregulation der Pro-Caspase-8 ihre Fähigkeit wiedererlangen, nach TMZ-Behandlung über den Fas-Rezeptor Signalweg Apoptose auszulösen. Diese Arbeiten weisen einen Weg, auf welchem die hohe Resistenz von malignen Melanomzellen, welche zu 80 % das nicht mutierte p53 Gen beherbergen, über eine IFN-beta induzierte Reaktivierung der Fas-Rezeptor vermittelten Apoptosekaskade überwunden werden kann.

Die Interaktion von VHL und PTEN bei der Tumorinitiation und Progression

Das VHL-Syndrom umfasst Erkrankungen, die mit einem Funktionsverlust von VHL einhergehen. Das Tumorspektrum umfasst retinale und zerebrale Hämangioblastome, Nierenzysten und klarzellige Nierenkarzinome, Zysten und Tumore des Pankreas, Phäochromocytome, Adenome der Hoden und Tumore des Mittelohrs. Obwohl aufgrund klinischer Studien bekannt ist, welche VHL-Mutation mit welchen Neoplasien assoziiert werden können, konnte bisher kein VHL-Mausmodell das Krankheitsbild des VHL-Syndroms widerspiegeln. Daher ist vermutlich eine zusätzliche Fehlregulation weiterer Gene nötig ist, um die Tumorgenese in den verschiedenen Geweben zu induzieren. In mehreren klarzelligen Nierenkarzinomen konnte bereits eine PTEN-Defizienz nachgewiesen werden, der Verlust von PTEN wird außerdem auch mit der Tumorgenese von Phäochromocytomen assoziiert. Möglicherweise wirken VHL und PTEN also in der Tumorsuppression in der Niere und der Nebenniere zusammen.rnIm Rahmen dieser Arbeit konnte erstmals eine VHL-vermittelte Stabilisierung der PTEN-Konzentration sowohl in embryonalen als auch in Tumor-Zellen der Niere nachgewiesen werden. Die Analyse des Regulationsmechanismus ergab erstens eine Hypoxie-abhängige Abnahme der Transkription von PTEN. Des Weiteren konnte eine VHL-vermittelte Ubiquitinylierung von NEDD4-1, welches als E3-Ligase von PTEN dessen Degradation und Kerntransport reguliert, ermittelt werden. rnIn Nierenkarzinom-Zellen wurde weiterhin eine VHL- bzw. PTEN-Restitution induziert, um die Auswirkungen der beiden Tumorsuppressoren auf das Zellverhalten in vitro und in vivo zu untersuchen. Sowohl VHL als auch PTEN hatten dieselben Effekte lediglich in unterschiedlicher Intensität auf das Verhalten der Zellen. So konnte VHL- und PTEN-abhängig eine Verstärkung der Adhäsion, eine Inhibierung der Migration und eine Verminderung der Überlebens- und Metastasierungsfähigkeit nachgewiesen werden. Des Weiteren wurden Mausmodelle mit einem ubiquitären, heterozygoten Pten-Verlust generiert, die teilweise eine zusätzliche Haploinsuffizienz von Vhl bzw. eine heterozygote VHL Typ II-Mutation (V2B oder V2C) trugen. Sporadisch entwickelten diese Mäuse Vhl-abhängig Lebertumore und Pten-abhängig Lymphome und Ovarialkarzinome. Einige Mäuse mit einer kombinierten Vhl- und Pten-Defizienz bildeten zusätzlich Nierenzysten aus, die teilweise das gesamte Volumen der Niere einnahmen. Besonders häufig entstanden in Pten-haploinsuffizienten Mäusen Phäochromocytome, die durch eine zusätzliche V2B- oder V2C-Mutation in gleichaltrigen Mäusen deutlich weiterentwickelt waren. Demnach induziert erst der gemeinsame Verlust von Vhl und Pten die Bildung von Nierenzysten und Phäochromocytomen, welche dem Krankheitsbild des VHL-Syndroms zugeordnet werden.rnDie Untersuchungen innerhalb dieser Arbeit zeigen erstmalig die Interaktion und Kooperation von VHL und PTEN in der Tumorsuppression. Die Resultate bieten außerdem die Grundlage für weitere Analysen der Auswirkung der VHL-vermittelten PTEN-Stabilisierung und für detailliertere Untersuchungen der durch die kombinierte Vhl- und Pten-Defizienz induzierten Neoplasien der Niere und der Nebennieren-Tumore in in vivo Mausmodellen.rn

Influence of the chemokine CXCL12 on the progression and the signaling in colorectal cancer

Das Chemokin CXCL12 (auch bekannt als SDF-1) ist ein kleines Protein (8-14) KDa, das in sechs Isoformen exprimiert wird (SDF-1α, SDF-1β, SDF-1γ, SDF- 1δ, SDF-1ε und SDF-1θ) von einem einzigen Gen, dass die Leukozyten-Wanderung regelt und variabel in einer Reihe von normalen und Krebsgeweben exprimiert wird.rnCXCL12 spielt verschiedene Rollen in der Tumorpathogenese. Es wurde nachgewiesen, dass CXCL12 das Tumorwachstum und die Malignität fördert, die Tumorangiogenese stärkt, sich an der Metastasierung beteiligt und zu immunsuppressiven Netzwerken innerhalb des Tumormikromilieus beiträgt. Daher liegt es nahe, dass der CXCL12/CXCR4-Signalweg ein wichtiges Ziel ist für die Entwicklung von neuartigen Krebstherapien.rnUm Licht auf die Rolle der Chemokin CXCL12 Splicevarianten in der Entwicklung von Krebs zu werfen und die mögliche physiologische Relevanz und ihre möglichen funktionellen Unterschiede bei Darmkrebs zu verstehen, haben wir alle CXCL12 Splicevarianten (alpha, beta, gamma, delta, epsilon und theta) in die kolorektalen Zelllinie SW480 und die Melanomzellinie D05 transfiziert und exprimiert.rnrnDiese Arbeit wurde erstellt, um die folgenden Ziele zu erreichen. Untersuchung der Rolle von CXCL12 Splicevarianten bei der Vermittlung von Tumorprogression, Adhäsion, Migration, Invasion und Metastasierung von Darmkrebs. Untersuchung, ob die CXCL12 Variantenwege ein wichtiges Ziel für die Entwicklung von Krebstherapien darstellen.rn• Um eine in vivo Mausmodell zu entwickeln, um die Rolle der CXCL12 Varianten im Rahmen des Tumorwachstums zu verstehen.rnrnUnsere Ergebnisse zeigen, dass:Der CXCL12 G801A Polymorphismus ist ein Low-Penetranz Risikofaktor für die Entwicklung von Darmkrebs. Der CXCL12-Gen-Polymorphismus rs1801157 ist mit dem T-Status (Tumor-node-Metastasen) assoziiert. Es gab keine Beziehung zwischen CXCL12-Gen-Polymorphismus rs1801157 und Fernmetastisen oder LN metastasen. Alle sechs CXCL12 Splicevarianten werden im Darmkrebs und in gesunder Kolon mucosa exprimiert. Die höchste Expression wird bei SDF-1alpha, dann SDF-1 beta gefunden. Alle sechs CXCL12 Varianten zeigen erhöhte Tumorzellproliferation in vitro. SDF-1beta, gefolgt von SDF-1alpha zeigte die größte Aktivität im Proliferationsassay.rn• Alle sechs CXCL12 Varianten induzieren die Tumorzelladhäsion.SDF-1beta dann SDF-1alpha zeigte die größte Aktivität im Rahmen des Adhäsionsassay. Alle sechs CXCL12 Varianten erhöhten die Zellmigration und Invasion von Tumorzellen in vitro. SDF-1theta und SDF-1epsilon 1theta zeigten die größte Aktivität, während die schwächste Aktivität mit SDF-1alpha und SDF-1beta beobachtet wurde. Alle sechs CXCL12 Varianten aktivieren Akt und (MAPK) Mitogen- acktivatedierte Protein kinase Wege und damit die Regulierung viele essentieller Prozesse in Tumorzellen, wie Proliferation, Migration, Invasion und Adhäsion. Es ist interessant festzustellen, dass AMD3100 die CXCL12 Splicevarianten inhibriert, die AKT-MEK-1/2-Phosphorylierung induzieren.rnDer Inhibitor AMD3100 unterdrückt stark die CXCL12 Varianten -delta, -epsilon und theta-und unterdrückt schwach CXCL12-gamma. während es keine signifikante Wirkung auf CXCL12-alpha und beta hatte. Es hat möglicherweise Auswirkungen auf mehrere große Signalwage in Bezug auf Proliferation, Migration und Invasions.rn• Es ist wichtig anzumerken, dass die Hemmung von CXCL12-Varianten durch AMD3100 einen der möglichen Ansaätze in der Krebstherapie darstellen kann.Wir schlagen vor, dass weitere Studien erwogen werden, die wir brauchen, um die biologische Aktivität dieser neuen CXCL12 Varianten bei verschiedenen Arten von Krebs klar zu verstehen.