Die Prozessierung des humanen Amyloid-Vorläuferproteins im Verlauf der replikativen Seneszenz

Die Alterung stellt den größten Risikofaktor für die Entwicklung der Alzheimer Krankheit dar, wobei die biochemische Basis dieser Korrelation bisher nicht bekannt ist. Ein möglicherweise zentraler Mechanismus der Alzheimer Pathologie wird durch die Prozessierung von APP repräsentiert, die in der Synthese von Aβ resultiert. Der Einfluss zellulärer Alterung auf die Biochemie der APP-Prozessierung ist bislang weitestgehend ungeklärt. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass die Prozessierung von endogenem APP im Verlauf der Zellalterung humaner Fibroblasten progressiv verringert wird. Die Bildung der intrazellulären APP-Spaltfragmente (C99, C83 und AICD) nahm mit zunehmender Lebensspanne ab und war gleichfalls mit einer reduzierten Synthese von extrazellulären APP-Fragmenten (sAPP, sAPPα) verbunden. Weiterhin wurde nachgewiesen, dass die Reifung von APP in seneszenten Zellen selektiv reduziert war, und dass dies durch altersabhängig erhöhte zelluläre Cholesterolspiegel vermittelt wurde. Von den APP-prozessierenden Sekretasen waren die Proteinspiegel von Presenilin-1 und Nicastrin, beides Komponenten der γ-Sekretase, im Verlauf der Zellalterung graduell verringert. Dies hatte einen progressiven Rückgang der enzymatischen Aktivität der γ-Sekretase zur Folge, wodurch die Prozessierung von APP unmittelbar reduziert wurde. Die Proteinspiegel von ADAM10, einer α-Sekretase, sowie der β-Sekretase, BACE, wiesen keine Altersregulation auf, aber interessanterweise wurde eine erhöhte enzymatische Aktivität der β-Sekretase in seneszenten Zellen nachgewiesen. Die γ-Sekretase sowie BACE sind in Lipid Rafts lokalisiert, geordneten Membransubdomänen, die hohe Cholesterol- und Caveolin-1-Spiegel aufweisen. Obwohl das Gesamtniveau dieser strukturellen Komponenten von Lipid Rafts in seneszenten Zellen erhöht war, war die Assoziation beider Moleküle mit Lipid Rafts reduziert und sie akkumulierten in speziellen Organellen, die höchstwahrscheinlich Lipidkörper darstellen. Somit wurde gezeigt, dass Lipid Rafts im Zuge der Zellalterung disintegrieren beziehungsweise in ihrem Gesamtspiegel reduziert waren. Diese altersabhängige Membranmodifikation war mit einer veränderten Verteilung von Presenilin-1 und BACE zwischen der Lipid Raft und der Nicht Raft Fraktion der Membran verbunden, die möglicherweise das Potential dieser Enzyme zur Prozessierung von APP reduzierte. In einem zweiten Teil der Arbeit wurden transgene C. elegans konstruiert, die humanes APP exprimieren, das C-terminal an GFP gekoppelt war. Diese Würmer wiesen eine reduzierte Fertilität, Eilegedefekte und eine verzögerte post-embryonale Entwicklung auf, die möglicherweise auf eine Transgen-vermittelte Neurodegeneration zurückgeführt werden können. Durch erste Untersuchungen der Prozessierung des Transgens konnten Spaltfragmente nachgewiesen werden, die potentiell auf eine spezifische Spaltung von APP durch die endogenen Sekretasen schließen lassen. Somit werden die Prozessierung sowie die Reifung von APP durch die altersabhängige Modifikationen zellulärer Biochemie nachhaltig beeinflusst. Zukünftige Studien sollen zeigen, ob sich diese zellulären Zusammenhänge in den Gesamtorganismus C. elegans übertragen lassen. Des Weiteren sollen die altersabhängigen zellulären Veränderungen, insbesondere des Cholesterol-Metabolismus und der Sekretaseaktivitäten, weitergehend analysiert werden, um zusätzliche Erkenntnisse über altersassoziierte Regulationen möglicher therapeutischer Ziele der Alzheimer Erkrankung zu gewinnen.

Genexpressionsanalyse der fötalen Wachstumsfuge des Rindes

Erkrankungen des Skelettapparats wie beispielsweise die Osteoporose oder Arthrose gehören neben den Herz-Kreislauferkrankungen und Tumoren zu den Häufigsten Erkrankungen des Menschen. Ein besseres Verständnis der Bildung und des Erhalts von Knochen- oder Knorpelgewebe ist deshalb von besonderer Bedeutung. Viele bisherige Ansätze zur Identifizierung hierfür relevanter Gene, deren Produkte und Interaktionen beruhen auf der Untersuchung pathologischer Situationen. Daher ist die Funktion vieler Gene nur im Zusammenhang mit Krankheiten beschrieben. Untersuchungen, die die Genaktivität bei der Normalentwicklung von knochen- und knorpelbildenden Geweben zum Ziel haben, sind dagegen weit weniger oft durchgeführt worden. rnEines der entwicklungsphysiologisch interessantesten Gewebe ist die Epiphysenfuge der Röhrenknochen. In dieser sogenannten Wachstumsfuge ist insbesondere beim fötalen Gewebe eine sehr hohe Aktivität derjenigen Gene zu erwarten, die an der Knochen- und Knorpelbildung beteiligt sind. In der vorliegenden Arbeit wurde daher aus der Epiphysenfuge von Kälberknochen RNA isoliert und eine cDNA-Bibliothek konstruiert. Von dieser wurden ca. 4000 Klone im Rahmen eines klassischen EST-Projekts sequenziert. Durch die Analyse konnte ein ungefähr 900 Gene umfassendes Expressionsprofil erstellt werden und viele Transkripte für Komponenten der regulatorischen und strukturbildenden Bestandteile der Knochen- und Knorpelentwicklung identifiziert werden. Neben den typischen Genen für Komponenten der Knochenentwicklung sind auch deutlich Bestandteile für embryonale Entwicklungsprozesse vertreten. Zu ersten gehören in erster Linie die Kollagene, allen voran Kollagen II alpha 1, das mit Abstand höchst exprimierte Gen in der fötalen Wachstumsfuge. Nach den ribosomalen Proteinen stellen die Kollagene mit ca. 10 % aller auswertbaren Sequenzen die zweitgrößte Gengruppe im erstellten Expressionsprofil dar. Proteoglykane und andere niedrig exprimierte regulatorische Elemente, wie Transkriptionsfaktoren, konnten im EST-Projekt aufgrund der geringen Abdeckung nur in sehr geringer Kopienzahl gefunden werden. Allerdings förderte die EST-Analyse mehrere interessante, bisher nicht bekannte Transkripte zutage, die detaillierter untersucht wurden. Dazu gehören Transkripte die, die dem LOC618319 zugeordnet werden konnten. Neben den bisher beschriebenen drei Exonbereichen konnte ein weiteres Exon im 3‘-UTR identifiziert werden. Im abgeleiteten Protein, das mindestens 121 AS lang ist, wurden ein Signalpeptid und eine Transmembrandomäne nachgewiesen. In Verbindung mit einer möglichen Glykosylierung ist das Genprodukt in die Gruppe der Proteoglykane einzuordnen. Leicht abweichend von den typischen Strukturen knochen- und knorpelspezifischer Proteoglykane ist eine mögliche Funktion dieses Genprodukts bei der Interaktion mit Integrinen und der Zell-Zellinteraktion, aber auch bei der Signaltransduktion denkbar. rnDie EST-Sequenzierungen von ca. 4000 cDNA-Klonen können aber in der Regel nur einen Bruchteil der möglichen Transkripte des untersuchten Gewebes abdecken. Mit den neuen Sequenziertechnologien des „Next Generation Sequencing“ bestehen völlig neue Möglichkeiten, komplette Transkriptome mit sehr hoher Abdeckung zu sequenzieren und zu analysieren. Zur Unterstützung der EST-Daten und zur deutlichen Verbreiterung der Datenbasis wurde das Transkriptom der bovinen fötalen Wachstumsfuge sowohl mit Hilfe der Roche-454/FLX- als auch der Illumina-Solexa-Technologie sequenziert. Bei der Auswertung der ca. 40000 454- und 75 Millionen Illumina-Sequenzen wurden Verfahren zur allgemeinen Handhabung, der Qualitätskontrolle, dem „Clustern“, der Annotation und quantitativen Auswertung von großen Mengen an Sequenzdaten etabliert. Beim Vergleich der Hochdurchsatz Blast-Analysen im klassischen „Read-Count“-Ansatz mit dem erstellten EST-Expressionsprofil konnten gute Überstimmungen gezeigt werden. Abweichungen zwischen den einzelnen Methoden konnten nicht in allen Fällen methodisch erklärt werden. In einigen Fällen sind Korrelationen zwischen Transkriptlänge und „Read“-Verteilung zu erkennen. Obwohl schon simple Methoden wie die Normierung auf RPKM („reads per kilo base transkript per million mappable reads“) eine Verbesserung der Interpretation ermöglichen, konnten messtechnisch durch die Art der Sequenzierung bedingte systematische Fehler nicht immer ausgeräumt werden. Besonders wichtig ist daher die geeignete Normalisierung der Daten beim Vergleich verschieden generierter Datensätze. rnDie hier diskutierten Ergebnisse aus den verschiedenen Analysen zeigen die neuen Sequenziertechnologien als gute Ergänzung und potentiellen Ersatz für etablierte Methoden zur Genexpressionsanalyse.rn

Structural and functional analysis of the hepatitis C virus non-structural protein 5A

Das Hepatitis C Virus (HCV) ist ein umhülltes RNA Virus aus der Familie der Flaviviridae. Sein Genom kodiert für ein ca. 3000 Aminosäuren langes Polyprotein, welches co- und posttranslational in seine funktionellen Einheiten gespalten wird. Eines dieser viralen Proteine ist NS5A. Es handelt sich hierbei um ein stark phosphoryliertes Protein, das eine amphipatische α-Helix im Amino-Terminus trägt, welche für die Membran-Assoziation von NS5A verantwortlich ist. Welche Rolle die Phosphorylierung für die Funktion des Proteins spielt, bzw. welche Funktion NS5A überhaupt ausübt, ist zur Zeit noch unklar. Beobachtungen lassen Vermutungen über eine Funktion von NS5A bei der Resistenz infizierter Zellen gegenüber Interferon-alpha zu. Weiterhin wird vermutet, das NS5A als Komponente des membranständigen HCV Replikasekomplexes an der RNA Replikation beteiligt ist. Das Ziel dieser Doktorarbeit war es, die Funktion von NS5A für die RNA Replikation zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurde eine Serie von Phosphorylierungsstellen-Mutanten generiert, die auf Ihre Replikationsfähigkeit und den Phosphorylierungsstatus hin untersucht wurden. Wir fanden, dass bestimmte Serin-Substitutionen im Zentrum von NS5A zu einer gesteigerten RNA Replikation führten, bei gleichzeitig reduzierter NS5A Hyperphosphorylierung. Weiterhin studierten wir den Einfluß von Mutationen in der Amino-terminalen amphipatischen α-Helix von NS5A auf die RNA-Replikation, sowie Phosphorylierung und subzelluläre Lokalisation des Proteins. Wir fanden, dass geringfügige strukturelle Veränderungen der amphipatischen Helix zu einer veränderten subzellulären Lokalisation von NS5A führten, was mit einer reduzierten oder komplett inhibierten RNA Replikation einherging. Zudem interferierten die strukturellen Veränderungen mit der Hyperphosphorylierung des Proteins, was den Schluß nahe legt, dass die amphipatische Helix eine wichtige strukturelle Komponente des Proteins darstellt, die für die korrekte Faltung und Phosphorylierung des Proteins essentiell ist. Als weitere Aspekte wurden die Trans-Komplementationsfähigkeit der verschiedenen viralen Komponenten des HCV Replikasekomplexes untersucht, sowie zelluläre Interaktionspartner von NS5A identifiziert. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse dieser Doktorarbeit, dass NS5A eine wichtige Rolle bei der RNA-Replikation spielt. Diese Funktion wird wahrscheinlich über den Phosphorylierungszustand des Proteins reguliert.