Der Einfluss von Hypothermie oder Dexmedetomidin auf den neuronalen Zelluntergang nach inkompletter zerebraler Hemisphärenischämie und Reperfusion bei der Ratte

Es ist bekannt, dass sowohl Hypothermie (HT) als auch Dexmedetomidin (DEX) das neurologische Endergebnis verbessern können. In dieser Studie wird der Einfluss von HT oder DEX auf den neuronalen Zelluntergang bei 104 Ratten nach inkompletter zerebraler Hemisphärenischämie durch unilaterale Karotis-Okklusion unter hämorrhagischer Hypotension und anschließender Reperfusion untersucht. In beiden Behandlungs-Gruppen zeigt sich gegenüber der Kontroll-Gruppe in der Hämatoxylin-Eosin-Färbung eine tendentielle Reduktion des Ausmaßes der Schädigung und der Anzahl nekrotischer Zellen, in der immunhistologischen Färbung mit Antikörpern gegen aktivierte Caspase-3 eine tendentielle Verringerung apoptotischer Zellen. Diese Arbeit deutet darauf hin, dass sowohl HT als auch DEX den neuronalen Schaden nach zerebraler Ischämie tendentiell zu reduzieren vermögen.

Einfluss moderater intraischämischer Hypothermie auf die Proliferation und Differenzierung neuronaler Stammzellen 28 Tage nach inkompletter Vorderhirnischämie und Reperfusion der adulten Ratte

Hypothermie schützt Neurone vor hypoxischen, ischämischen und traumatischen Schädigungen. Bisher ist jedoch unklar, ob Hypothermie auch endogene Reparaturmechanismen beeinflusst. Die vorliegende Arbeit untersucht daher den Einfluss intraischämischer Hypothermie auf das neuroregenerative Potential des Gehirns nach zerebraler Ischämie.rn50 männliche Sprague-Dawley Ratten wurden hierzu anästhesiert, intubiert und in folgende Versuchsgruppen randomisiert: Normotherme Ischämie (Normo/BACO), intraischämische Hypothermie (Hypo/BACO) sowie korrespondierende scheinoperierte Kontrollgruppen (Normo/Sham und Hypo/Sham). In den Gruppen Normo/Sham und Normo/BACO wurde die perikranielle Temperatur konstant bei 37 °C gehalten während sie in den Gruppen Hypo/Sham und Hypo/BACO für 85 min auf 33 °C gesenkt wurde. Durch bilaterale Okklusion der Aa. carotides communes in Kombination mit hämorrhagischer Hypotension wurde in BACO-Tieren eine 14-minütige inkomplette globale zerebrale Ischämie induziert. Tiere der Kontroll-Gruppen (Sham) blieben ohne Induktion einer Ischämie in Narkose. 15 weitere Tiere durchliefen nicht den operativen Versuchsteil und bildeten die Nativ-Gruppe, die als Referenz für die natürliche Neurogenese diente. Zur in-vivo-Markierung der Stammzellen wurde vom ersten bis siebten postoperativen Tag Bromodeoxyurindine (BrdU) injiziert. Nach 28 Tagen wurden die Gehirne entnommen. Die Analyse des histopathologischen Schadens erfolgte anhand HE-gefärbter Hirnschnitte, die Quantifikation der absoluten Anzahl neu gebildeter Zellen im Gyrus dentatus erfolgte mittels BrdU-Färbung. Anhand einer BrdU/NeuN-Immunfluoreszenz-Doppelfärbung konnte der Anteil neu generierter Neurone bestimmt werden.rnNach zerebraler Ischämie zeigten Tiere mit Normothermie eine Schädigung der CA 1-Region von über 50 % während hypotherme Ischämietiere einen Schaden von weniger als 10 % aufwiesen. Tiere ohne Ischämie (Hypo/Sham, Normo/Sham, Nativ) zeigten keinen histopathologischen Schaden. Die Anzahl neu gebildeter Neurone im Gyrus dentatus lag für normotherme Ischämietiere (Normo/BACO) bei 18819 und für Tiere mit intraischämischer Hypothermie (Hypo/BACO) bei 15175 neuen Neuronen. In den Kontroll-Gruppen wiesen Tiere der Gruppe Normo/Sham 5501, Tiere der Gruppe Hypo/Sham 4600 und Tiere der Nativ-Gruppe 5974 neu generierte Neurone auf.rnDiese Daten bestätigen frühere Studien, die eine Reduktion des neuronalen Schadens durch intraischämische Hypothermie zeigten. Infolge des ischämischen Stimulus kam es im Vergleich zu beiden Kontroll- und der Nativ-Gruppe zu einem signifikanten Anstieg der Anzahl neuer Neurone in beiden Ischämiegruppen unabhängig von der Temperatur. Somit scheint das Ausmaß der histopathologischen Schädigung keinen Einfluss auf die Anzahl neu gebildeter Neurone zu haben. Darüber hinaus beeinflusste die therapeutische Hypothermie auch nicht die natürliche Neurogeneserate. Die erhobenen Daten lassen vermuten, dass Hypothermie keinen Effekt auf die Anzahl und Differenzierung neuronaler Stammzellen aufweist, unabhängig davon, ob eine zerebrale Schädigung vorliegt.

Synthese von Sialyl-Lewis X -Glycopeptiden und -Mimetika als Zelladhäsionsinhibitoren für E-Selektin

Die Selektine initiieren im Verlauf von Entzündungsprozessen einen ersten Zellkontakt zwischen Leukozyten und Endothelzellen und ermöglichen so die Auswanderung der Leukozyten aus den Blutgefäßen in das umliegende Gewebe, wo sie ihre immunologische Wirkung entfalten können. Viele Krankheiten gehen allerdings mit einer übermäßigen, durch Selektine vermittelten Zelladhäsion einher. Daher war es das Ziel dieser Arbeit, Selektininhibitoren zu synthetisieren, die pathologische Zelladhäsionsprozesse, wie man sie z.B. bei rheumatoider Arthritis, bei Erkrankungen der Herzkranzgefäße oder im Verlauf von Tumormetastasierungen findet, unterbinden können. Als Leitstruktur für solche Inhibitoren dient das auf den natürlichen Selektinliganden vorkommende Tetrasaccharid Sialyl-Lewis-X. Sialyl-Lewis-X stellt aber nur einen Teil der natürlichen Selektinliganden dar. Es bindet auch nur im millimolaren Bereich an die Selektine. Die komplexen natürlichen Selektinliganden wie z.B. ESL-1 (E-Selektin-Ligand-1), die an verschiedenen Glycosylierungs-stellen des Glycoproteins Sialyl-Lewis-X präsentieren, binden mit deutlich höherer Affinität an die Selektine. Für eine spezifische Rezeptorbindung sind daher außer dem Tetrasaccharid weitere Partialstrukturen verantwortlich, wobei gezeigt werden konnte, dass ein Anknüpfen von Sialyl-Lewis-X-Derivaten an die Partialsequenz 672-681 des ESL-1 eine Affinitätssteigerung hervorruft. Ein weiterer Nachteil des natürlichen Sialyl-Lewis-X-Tetrasaccharids im Hinblick auf seine pharmakologische Verwendung besteht darin, dass sowohl die fucosidische Bindung als auch die glycosidische Verknüpfung zur Neuraminsäure durch Enzyme leicht gespalten werden, wodurch Sialyl-Lewis-X als potenzielles Anti-Adäsionsmolekül an Wert verliert. Um die Kohlenydratliganden vor einem solchen enzymatischen Abbau zu bewahren, wurden in dieser Arbeit neben der im Sialyl-Lewis-X vorliegenden L-Fucose die im Menschen nicht vorkommenden Kohlenhydrate D-Arabinose und L-Galactose sowie neben der Neuraminsäure die (S)-Cyclohexylmilchsäure zur Herstellung der sechs Glycopeptid-Selektinliganden 1-6 mit der Partialsequenz 672-681 des ESL-1 verknüpft. Die Tetrasaccharide und Tetrasaccharid-Mimetika können aus den geschützten Monosacchariden und der geschützten Cyclohexylmilch-säure in parallelen Synthesen im Gramm-Maßstab hergestellt werden. Die automatisierten Glycopeptid-Festphasensynthesen wurden an einem Peptidsynthesizer nach der Fmoc-Strategie unter Verwendung von mit Asparaginsäure vorbeladenen TentaGel®-Harzen durchgeführt. Die Strukturen aller sechs Glycopeptide 1-6 wurden sowohl durch hoch auflösende massenspektrometrische Analysen als auch durch ein- und zweidimensionale NMR-Experimente belegt. Als Ergebnis dieser Arbeit liegen sechs Sialyl-Lewis-X-Glycopeptide und -Mimetika mit der Partialsequenz 672-681 des ESL-1 vor. Diese werden in Kürze auf ihre Wirksamkeit als Zelladhäsions-inhibitoren für E-Selektin getestet. Daraus sollen sich Erkenntnisse über Struktur-Wirkungs-Beziehungen gewinnen lassen, insbesondere was das kooperative Zusammenwirken von Saccharid- und Peptidteilstrukturen in der Erkennung der Liganden durch das E-Selektin anbetrifft.

Synthetische Glycopeptide mit Sulfatyl-Lewis X-Struktur als potenzielle Inhibitoren der Zelladhäsion

Zelladhäsionsprozesse sind von großer Bedeutung für zahlreiche biologische Prozesse, wie etwa die Immunantwort, die Wundheilung und die Embryogenese. Außerdem spielen sie eine entscheidende Rolle im Verlauf inflammatorischer Prozesse. An der Zelladhäsion sind verschiedene Klassen von Adhäsionsmolekülen beteiligt. Die erste leichte „rollende“ Adhäsion von Leukozyten am Ort einer Entzündung wird durch die Selektine vermittelt. Diese binden über die Kohlenhydrat-Strukturen Sialyl-Lewisx und Sialyl-Lewisa über eine calciumabhängige Kohlenhydrat-Protein-Bindung an ihre spezifischen Liganden und vermitteln so den ersten Zellkontakt, bevor andere Adhäsionsmoleküle (Cadherine, Integrine) die feste Adhäsion und den Durchtritt durch das Endothel bewirken. Bei einer pathogenen Überexpression der Selektine kommt es jedoch zu zahlreichen chronischen Erkrankungen wie z. B. rheumatoider Arthritis, Erkrankungen der Herzkranzgefäße oder dem Reperfusions-syndrom. Außerdem wird eine Beteiligung der durch die Selektine vermittelten Zellkontakte bei der Metastasierung von Karzinomzellen angenommen. Ein Ansatzpunkt für die Behandlung der oben genannten Erkrankungen ist die Gabe löslicher kompetitiver Inhibitoren für die Selektine. Ziel der Arbeit war die Modifikation des Sialyl-Lewisx-Leitmotivs zur Steigerung der metabolischen Stabilität und dessen Einbau in die Peptidsequenz aus der für die Bindung verantwortlichen Domäne des endogenen Selektin-Liganden PSGL-1. Dazu wurden mit einer modifizierten Lewisx-Struktur glycosylierte Aminosäurebausteine dargestellt (Abb.1). Die Verwendung von Arabinose und des Sulfatrestes anstelle von Fusose und Sialinsäure sollte außerdem zu einer gesteigerten metabolischen Stabilität des synthetischen Liganden beitragen. Die so erhaltenen Glycosylaminosäuren sollten nun in die Festphasenpeptidsynthese eingesetzt werden. Aufgrund der großen säurelabilität konnte hier nicht auf das Standartverfahren (Wang-Harz, Abspaltung mit TFA) zurückgegriffen werden. Deshalb kam ein neuartiges UV-labiles Ankersystem zum Einsatz. Dazu wurde ein Protokoll für die Synthese und Abspaltung von Peptiden an diesem neuen System entwickelt. Daran gelang die Synthese des nichtglycosylierten Peptidrückgrats sowie eines mit der dem sulfatierten Lewisx-Motiv versehenen Glycopeptids. Ein vierfach sulfatiertes Glycopeptid, welches durch den Einsatz von im Vorfeld chemisch sulfatierer Tyrosin-Bausteinen dargestellt werden sollte, konnte massenspektrometrisch nachgewiesen werden.

Evaluation von Effektivität und Sicherheit der niederfrequenten, transkraniellen Ultraschalltherapie beim Schlaganfall

In den westlichen Ländern nimmt die Zahl der Schlaganfall-Patienten stetig zu und zählt mittlerweilernzu einer der häufigsten Todesursachen. Derzeit ist die Rekanalisationstherapie mit demrnFibrinolytikum rt-PA die einzig zugelassene Therapie. Die Rekanalisationsrate ist oftmals inkomplettrnund aufgrund von möglichen Blutungskomplikationen die Therapie nicht bei allen Patientenrnmöglich. Daher ist es wichtig, Alternativtherapieansätze (z.B. Ultraschallthrombolyse) zurnentwickeln. Blutgerinnsel können mit Hilfe von Ultraschall in Schwingung gebracht und sornlysiert oder die Wirkung von rt-PA verstärkt werden. Die vorliegende Arbeit hatte die Evaluationrnvon Bioeffekten von 60 kHz Ultraschall an gesundem und ischämischem Hirngewebe zum Ziel.rnNeben tierexperimentellen Methoden kamen auch molekular-biologische Techniken zur Anwendung.rnDie erste Studie beschäftigte sich mit der Wirkung von 60 kHz (Intensität: 0,2 W/cm2 undrnDuty Cycle 50%) auf ischämisches Hirngewebe (permanent ischämisch und nach Reperfusion).rnLediglich nach Reperfusion und Ultraschallbehandlung war das Läsionsvolumen signifikantrnerhöht, so dass von einer besonderen Vulnerabilität des Hirngewebes nach Reperfusionrnauszugehen ist (Penumbraschädigung). In der neurologischen Beurteilung der Tiere zeigte sichrnbei allen Tieren mit permanenter Okklusion und etwa einem Drittel der Tiere nach Reperfusionrnund Ultraschallbehandlung eine Hörminderung. In der anschließenden Studie wurde diernUltraschallintensität erniedrigt und der Duty Cycle variiert. In einer publizierten in vitro Studiernkonnte die zunehmende Lyserate mit steigendem Duty Cycle nachgewiesen werden. DiernAuswertung ergab eine Abhängigkeit des Läsionsvolumens von der Länge des Duty Cycles. Derrndritte Teil der Arbeit befasst sich mit der Wirkung von Ultraschall auf die Genexpression. Hierzurnwurden gesunde Ratten mit Ultraschall verschiedener Frequenzen (60 kHz, 488 kHz und 3 MHz)rntranskraniell behandelt und 4 h bzw. 24 h nach der Behandlung getötet. Proben von ischämischenrnTieren dienten als positive Kontrollen. Aufgrund von Literaturrecherchen wurden mehrerernKandidatengene ermittelt. Die Messung der Ischämieproben ergab eine weitgehende Übereinstimmungrnmit der Literatur. Die Messungen an den mit 60 kHz behandelten Proben ergabenrnkaum Anzeichen für eine differenzielle Genregulation. Die Frequenz von 488 kHz zeigte diernmeisten Regulationen, gefolgt von der Behandlung mit 3 MHz. Dieses Ergebnis lässt vermuten,rndass es sich bei den detektierten Veränderungen um protektive Mechanismen handelt, da diesernFrequenzen bislang im Tierversuch als nebenwirkungsarm beschrieben wurden. Die Auswertungrnvon 60 kHz-Proben mit Affymetrix Arrays ergab lediglich einige wenige differentiell regulierternGene. Die Array-Experimente konnten nicht durch qPCR-Messungen bestätigt werden.

Synthese und präklinische Evaluation von neuen antioxidativen Substanzen zur Neuroprotektion

Oxidativer Stress ist seit über 25 Jahren als ein Charakteristikum vieler pathologischer Prozesse bekannt. Helmut Sies beschrieb bereits in den 1980er Jahren oxidativen Stress als Störung in der prooxidativ – antioxidativen Balance zugunsten der prooxidativen Seite, wodurch es potentiell zu Schäden in verschiedenen Geweben kommt. Oxidativer Stress tritt sowohl bei neurodegenerativen Erkrankungen wie Morbus Alzheimer, Morbus Parkinson und zerebraler Ischämie, bei peripheren Erkrankungen wie Arteriosklerose, als auch beim Alterungsprozess per se auf und wird als Ursache oder zumindest als ein krankheitsfördernder Faktor diskutiert. Die in in vitro-Experimenten als vielversprechend antioxidativ getesteten Substanzen (meist phenolhaltig) ergaben in mehreren klinischen Studien keinen signifikanten Vorteil. Um die Ursachen dieser Ergebnisse näher zu analysieren, wurde in der vorliegenden Arbeit auf Basis des cytoprotektiven Phenothiazins, einem aromatischen trizyklischen Amin, der Einfluss von verschiedenen Substituenten im Hinblick auf Lipophilie, Radikalstabilisierung und Löslichkeit des Moleküls chemisch vorhergesagt. Anhand dieser in silicio Struktur-Wirkungs-Beziehung wurden anschließend neue Modellsubstanzen synthetisiert, welche sich systematisch in den drei zuvor genannten Parametern unterschieden. Dies wurde durch Substitution von unterschiedlich langen Fettsäureketten, von löslichkeitsbeeinflussenden funktionellen Gruppen, oder durch Anellierung zusätzlicher aromatischer Ringe erreicht. In den folgenden Versuchen zu antioxidativer Kapazität, zellulärem Überleben, Lipidperoxidation und Proteinoxidation zeigte sich, dass mit gesteigerter Stabilität der korrespondierenden Radikale und mit wachsender Lipophilie die antioxidativ cytoprotektive Aktivität der neuen Derivate bis zu einer gewissen Grenze (logP ≈ 7) signifikant zunahm; über diesen Wert hinaus sank die Effektivität wieder ab. Benzanellierte Phenothiazine entwickelten mit EC50-Werten von ungefähr 8-10 nM die höchste mittlere effektive Wirkkonzentration in oxidativ geschädigten, klonalen hippocampalen Neuronen (HT-22 Zellen). Dies entspricht einer etwa 20-fachen Verbesserung gegenüber α-Tocopherol, welches bisher als bestes natürliches lipophiles Antioxidans angesehen wurde. Im Vergleich zu Phenothiazin erreichen die neuen Antioxidantien immerhin eine höhere Effektivität um den Faktor 4. Folglich sind es sowohl Aspekte der Löslichkeit und der Distribution, welche die Potenz der gegenwärtigen Antioxidantien limitieren als auch Aspekte der Radikalstabilisierung, die Einfluss auf die primäre Wirksamkeit nehmen. Dieses Wissen sollte beim zukünftigen Design neuer, antioxidativ potenter Moleküle im Hinblick auf ihren langfristigen Einsatz bei neurodegenerativen Erkrankungen von Nutzen sein.