Synaptic connectivity in micropatterned networks of neuronal cells

The presented thesis describes the formation of functional neuronal networks on an underlying micropattern. Small circuits of interconnected neurons defined by the geometry of the patterned substrate could be observed and were utilised as a model system of reduced complexity for the behaviour of neuronal network formation and activity. The first set of experiments was conducted to investigate aspects of the substrate preparation. Micropatterned substrates were created by microcontact printing of physiological proteins onto polystyrene culture dishes. The substrates displayed a high contrast between the repellant background and the cell attracting pattern, such that neurons seeded onto these surfaces aligned with the stamped structure. Both the patterning process and the cell culture were optimised, yielding highly compliant low-density networks of living neuronal cells. In the second step, cellular physiology of the cells grown on these substrates was investigated by patch-clamp measurements and compared to cells cultivated under control conditions. It could be shown that the growth on a patterned substrate did not result in an impairment of cellular integrity nor that it had an impact on synapse formation or synaptic efficacy. Due to the extremely low-density cell culture that was applied, cellular connectivity through chemical synapses could be observed at the single cell level. Having established that single cells were not negatively affected by the growth on patterned substrates, aspects of network formation were investigated. The formation of physical contact between two cells was analysed through microinjection studies and related to the rate at which functional synaptic contacts formed between two neighbouring cells. Surprisingly, the rate of synapse formation between physically contacting cells was shown to be unaltered in spite of the drastic reduction of potential interaction partners on the micropattern. Additional features of network formation were investigated and found consistent with results reported by other groups: A different rate of synapse formation by excitatory and inhibitory neurons could be reproduced as well as a different rate of frequency-dependent depression at excitatory and inhibitory synapses. Furthermore, regarding simple feedback loops, a significant enrichment of reciprocal connectivity between mixed pairs of excitatory and inhibitory neurons relative to uniform pairs could be demonstrated. This phenomenon has also been described by others in unpatterned cultures [Muller, 1997] and may therefore be a feature underlying neuronal network formation in general. Based on these findings, it can be assumed that inherent features of neuronal behaviour and cellular recognition mechanisms were found in the cultured networks and appear to be undisturbed by patterned growth. At the same time, it was possible to reduce the complexity of the forming networks dramatically in a cell culture on a patterned surface. Thus, features of network architecture and synaptic connectivity could be investigated on the single cell level under highly defined conditions.

Sustained-release formulations for compounds underlying intestinal drug efflux

ZusammenfassungDie Sekretion von Arzneistoffen aus Darmzellen zurück ins Darmlumen, die durch intestinale Transporter wie P-Glykoprotein (P-GP) vermittelt wird, stellt eine bekannte Quelle für unvollständige und variable Bioverfügbarkeiten und für Interaktionen mit anderen Arzneimitteln und Nahrungsbestandteilen dar. Dennoch liegen bisher keine Veröffentlichungen vor, die sich mit daraus resultierenden Konsequenzen für die Entwicklung neuer peroraler Darreichungsformen befassen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, deutlich zu machen, dass dem Auftreten von intestinalen Sekretionsphänomenen bei der Entwicklung von Retardarzneimitteln Rechnung getragen werden muss.Dazu wurden effektive Permeabilitäten für den Modellarzneistoff Talinolol in unterschiedlichen Darmabschnitten anhand eines Rattendarmperfusionsmodells bestimmt.Des weiteren wurde eine Retardformulierung für den Modellarzneistoff Talinolol entwickelt. Dabei wurde gezeigt, dass die Verwendung unterschiedlicher Puffer als Wirkstofffreisetzungmedien zur Ausbildung unterschiedlicher Talinolol-Kristallstrukturen führt.Die neu entwickelten Retardmatrixtabletten wurden mit Hilfe des Pharmakokinetik-Computersoftwareprogrammes Gastro Plus® evaluiert. Das Zusammenspiel von verlangsamter Wirkstofffreigabe aus der Arzneiform und intestinaler Sekretion führte zu einer deutlich verringerten Bioverfügbarkeit der Modellsubstanz Talinolol aus der Retardformulierung im Vergleich zu schnellfreisetzenden Arzneiformen.Daher sollte der Einfluß intestinaler sekretorischer Transporter wie P-GP bei der Entwicklung von Retardarzneiformen unbedingt berücksichtigt werden.

Neuronal differentiation and epithelial integrity: the role of Drosophila Short stop

The nervous system is the most complex organ in animals and the ordered interconnection of neurons is an essential prerequisite for normal behaviour. Neuronal connectivity requires controlled neuronal growth and differentiation. Neuronal growth essentially depends on the actin and microtubule cytoskeleton, and it has become increasingly clear, that crosslinking of these cytoskeletal fractions is a crucial regulatory process. The Drosophila Spectraplakin family member Short stop (Shot) is such a crosslinker and is crucial for several aspects of neuronal growth. Shot comprises various domains: An actin binding domain, a plakin-like domain, a rod domain, calcium responsive EF-hand motifs, a microtubule binding Gas2 domain, a GSR motif and a C-terminal EB1aff domain. Amongst other phenotypes, shot mutant animals exhibit severely reduced dendrites and neuromuscular junctions, the subcellular compartmentalisation of the transmembrane protein Fasciclin2 is affected, but it is also crucially required in other tissues, for example for the integrity of tendon cells, specialised epidermal cells which anchor muscles to the body wall. Despite these striking phenotypes, Shot function is little understood, and especially we do not understand how it can carry out functions as diverse as those described above. To bridge this gap, I capitalised on the genetic possibilities of the model system Drosophila melanogaster and carried out a structure-function analysis in different neurodevelopmental contexts and in tendon cells. To this end, I used targeted gene expression of existing and newly generated Shot deletion constructs in Drosophila embryos and larvae, analyses of different shot mutant alleles, and transfection of Shot constructs into S2 cells or cultured fibroblasts. My analyses reveal that a part of the Shot C-terminus is not essential in the nervous system but in tendon cells where it stabilises microtubules. The precise molecular mechanism underlying this activity is not yet elucidated but, based on the findings presented here, I have developed three alternative testable hypothesis. Thus, either binding of the microtubule plus-end tracking molecule EB1 through an EB1aff domain, microtubulebundling through a GSR rich motif or a combination of both may explain a context-specific requirement of the Shot C-terminus for tendon cell integrity. Furthermore, I find that the calcium binding EF-hand motif in Shot is exclusively required for a subset of neuronal functions of Shot but not in the epidermal tendon cells. These findings pave the way for complementary studies studying the impact of [Ca2+] on Shot function. Besides these differential requirements of Shot domains I find, that most Shot domains are required in the nervous system and tendon cells alike. Thus the microtubule Gas2 domain shows no context specific requirements and is equally essential in all analysed cellular contexts. Furthermore, I could demonstrate a partial requirement of the large spectrin-repeat rod domain of Shot in neuronal and epidermal contexts. I demonstrate that this domain is partially required in processes involving growth and/or tissue stability but dispensable for cellular processes where no mechanical stress resistance is required. In addition, I demonstrate that the CH1 domain a part of the N-terminal actin binding domain of Shot is only partially required for all analysed contexts. Thus, I conclude that Shot domains are functioning different in various cellular environments. In addition my study lays the base for future projects, such as the elucidation of Shot function in growth cones. Given the high degree of conservation between Shot and its mammalian orthologues MACF1/ACF7 and BPAG1, I believe that the findings presented in this study will contribute to the general understanding of spectraplakins across species borders.

Expressions- und Funktionsanalysen von "Tetraspan Vesicle Membrane Proteins" in Caenorhabditis elegans

Tetraspan vesicle membrane proteins (TVPs) sind ubiquitäre Komponenten von Transportvesikeln. Bei den Säugetieren unterscheidet man drei Familien, die Physine, Gyrine und SCAMPs (secretory carrier-associated membrane proteins). Ihre Funktion ist weitgehend unbekannt, es wird jedoch vermutet, dass sie eine Rolle bei der Vesikelbildung und der Vesikelrezirkulierung spielen. In Caenorhabditis elegans existiert von jeder Familie jeweils nur ein einziges Polypeptid: für die Physine Synaptophysin (SPH-1), für die Gyrine Synaptogyrin (SNG-1) und für die SCAMPs SCAMP (SCM-1). Ziel der Arbeit war es die Verteilung der C. elegans TVPs zu untersuchen und ihre Funktion unter besonderer Berücksichtigung der vesikelvermittelten synaptischen Kopplung zu bestimmen. Wenn die C. elegans TVPs in humanen Epithelzellen synthetisiert werden, lokalisieren sie in zytoplasmatischen Vesikeln. In Kotransfektionsexperimenten wurde gezeigt, dass sie größtenteils in den gleichen Strukturen enthalten sind. In C. elegans synthetisierte TVP-Reporterkonstrukte können in unterschiedlichen Geweben nachgewiesen werden. Dabei ist SNG-1 fast ausschließlich in Neuronen zu finden. SPH-1 und SCM-1 hingegen weisen komplexe und teilweise überlappende Verteilungsmuster auf. Während für SPH-1 eine starke Fluoreszenz im Pharynx, auf der apikalen Seite der Darmzellen oberhalb des sog. terminal webs und in adluminalen Regionen von exkretorischen Geweben gefunden wurde, war SCM-1 stark in der Muskulatur und den Coelomozyten vertreten. Die Expression von SCM-1 in Pharynx und Darm war deutlich schwächer. Die C. elegans TVPs werden früh in der Entwicklung ab der Gastrulation (SPH-1 und SCM-1) bzw. ab der Neurulation im sog. Komma-Stadium (SNG-1) produziert. Um die Funktion der TVPs in C. elegans zu untersuchen, wurden TVP-Mutanten analysiert. Durch Kombination aller drei TVP-Gen-Mutanten wurden TVP-Dreifachmutanten generiert. Diese wiesen keinen offensichtlichen Defekt im Bewegungsmuster auf, entwickelten sich normal und bildeten ein normales Nervensystem aus. Auch auf unterschiedliche chemische und physikalische Reize in sensorischen Tests reagierten die TVP-Dreifachmutanten in gleicher Weise wie Wildtyptiere. Ebenso zeigen die TVP-Dreifachmutanten elektrophysiologisch unter normalen Bedingungen keine anormalen Reaktionsmuster. In ultrastrukturellen Untersuchungen wurde lediglich eine signifikant erhöhte Anzahl Clathrin-ummantelter Vesikel in cholinergen Synapsen gefunden. Erst unter Stressbedingungen, hervorgerufen durch den GABA-Antagonisten Pentylentetrazol (PTZ), wiesen sowohl die TVP-Dreifach- als auch die TVP-Einzelmutanten eine deutlich erhöhte Krampfbereitschaft auf. Zusammengenommen zeigen die Analysen, dass TVPs zwar für grundlegende neuronale Prozesse nicht notwendig sind, dass sie aber auf der anderen Seite vermutlich an alternativen redundanten Wegen der Neurotransmitterfreisetzung beteiligt sind.

Stimulus-induced gamma activity in the electrocorticogram of freely moving telemetric implanted rats: the neuronal signature of novelty detection

During this thesis a new telemetric recording system has been developed allowing ECoG/EEG recordings in freely behaving rodents (Lapray et al., 2008; Lapray et al., in press). This unit has been shown to not generate any discomfort in the implanted animals and to allow recordings in a wide range of environments. In the second part of this work the developed technique has been used to investigate what cortical activity was related to the process of novelty detection in rats’ barrel cortex. We showed that the detection of a novel object is accompanied in the barrel cortex by a transient burst of activity in the γ frequency range (40-47 Hz) around 200 ms after the whiskers contact with the object (Lapray et al., accepted). This activity was associated to a decrease in the lower range of γ frequencies (30-37 Hz). This network activity may represent the optimal oscillatory pattern for the propagation and storage of new information in memory related structures. The frequency as well as the timing of appearance correspond well with other studies concerning novelty detection related burst of activity in other sensory systems (Barcelo et al., 2006; Haenschel et al., 2000; Ranganath & Rainer, 2003). Here, the burst of activity is well suited to induce plastic and long-lasting modifications in neuronal circuits (Harris et al., 2003). The debate is still open whether synchronised activity in the brain is a part of information processing or an epiphenomenon (Shadlen & Movshon, 1999; Singer, 1999). The present work provides further evidence that neuronal network activity in the γ frequency range plays an important role in the neocortical processing of sensory stimuli and in higher cognitive functions.

LPS-induced modifications in spontaneous network activity causes neuronal apoptosis in neonatal cerebral cortex

During the perinatal period the developing brain is most vulnerable to inflammation. Prenatal infection or exposure to inflammatory factors can have a profound impact on fetal neurodevelopment with long-term neurological deficits, such as cognitive impairment, learning deficits, perinatal brain damage and cerebral palsy. Inflammation in the brain is characterized by activation of resident immune cells, especially microglia and astrocytes whose activation is associated with a variety of neurodegenerative disorders like Alzheimer´s disease and Multiple sclerosis. These cell types express, release and respond to pro-inflammatory mediators such as cytokines, which are critically involved in the immune response to infection. It has been demonstrated recently that cytokines also directly influence neuronal function. Glial cells are capable of releaseing the pro-inflammatory cytokines MIP-2, which is involved in cell death, and tumor necrosis factor alpha (TNFalpha), which enhances excitatory synaptic function by increasing the surface expression of AMPA receptors. Thus constitutively released TNFalpha homeostatically regulates the balance between neuronal excitation and inhibition in an activity-dependent manner. Since TNFalpha is also involved in neuronal cell death, the interplay between neuronal activity MIP-2 and TNFalpha may control the process of cell death and cell survival in developing neuronal networks. An increasing body of evidence suggests that neuronal activity is important in the regulation of neuronal survival during early development, e.g. programmed cell death (apoptosis) is augmented when neuronal activity is blocked. In our study we were interested on the impact of inflammation on neuronal activity and cell survival during early cortical development. To address this question, we investigated the impact of inflammation on neuronal activity and cell survival during early cortical development in vivo and in vitro. Inflammation was experimentally induced by application of the endotoxin lipopolysaccharide (LPS), which initiates a rapid and well-characterized immune response. I studied the consequences of inflammation on spontaneous neuronal network activity and cell death by combining electrophysiological recordings with multi-electrode arrays and quantitative analyses of apoptosis. In addition, I used a cytokine array and antibodies directed against specific cytokines allowing the identification of the pro-inflammatory factors, which are critically involved in these processes. In this study I demonstrated a direct link between inflammation-induced modifications in neuronal network activity and the control of cell survival in a developing neuronal network for the first time. Our in vivo and in vitro recordings showed a fast LPS-induced reduction in occurrence of spontaneous oscillatory activity. It is indicated that LPS-induced inflammation causes fast release of proinflammatory factors which modify neuronal network activity. My experiments with specific antibodies demonstrate that TNFalpha and to a lesser extent MIP-2 seem to be the key mediators causing activity-dependent neuronal cell death in developing brain. These data may be of important clinical relevance, since spontaneous synchronized activity is also a hallmark of the developing human brain and inflammation-induced alterations in this early network activity may have a critical impact on the survival of immature neurons.

Misregulation of the tumour suppressor gene CYLD drives hyperactivation of T cells leading to intestinal pathology

The tumour suppressor gene cyld is mutated in familial cylindromatosis, an autosomal-dominant condition that predisposes to multiple skin tumours. The deubiquitinase CYLD acts as a negative regulator of NF-κB signaling. To analyse the function of CYLD in vivo we used the CYLDex7/8 mice, which are characterized by loss of the full-length transcript and overexpression of a short splice variant of CYLD (sCYLD). In CYLDex7/8 mice the overexpression of sCYLD results in splenomegaly and lymphadenopathy. Additionally, the B cell population in spleen and lymph nodes is increased at the expense of T cells. Analysis of CYLDex7/8 T cells showed a significant reduction of CD4 single positive (SP) and CD8 SP T cells in the thymus and in the periphery. By investigating the impact of sCYLD in TCR signaling in thymocytes, we could demonstrate that sCYLD partially inhibited the activation of Zap70 and thereby negatively regulated TCR signaling. In vitro as well as in vivo we could show that CD4+ T cells displayed a hyperactive phenotype, proliferated to a better extent than WT cells and expressed high amounts of inflammatory cytokines such as IL-6 and IL-17A. Western Blots of steady state thymocytes and peripheral CD4+ T cells were performed, showing that the noncanonical pathway was highly upregulated visualized by the expression levels of RelB and p100 leading to a hyperactive phenotype of CD4+ T cells. In order to investigate the contribution of sCYLD in positive and negative selection in the thymus in vivo, the HY-TCR transgene (HYtg) was crossed to CYLDex7/8 mice. The analysis of CYLDex7/8 HYtg males revealed an increase in CD4+CD8+ DP as well as in CD8+ SP thymocytes, suggesting a less pronounced negative selection in CYLD mutant mice compared to HYtg control mice. Interestingly, the impaired negative selection in the thymus was accompanied by a strong colitis phenotype at early ages (4 weeks). Since medullary TECs (mTECs) play an important role in the late stage of T cell development by negatively selecting autoreactive thymocytes, the levels of mTECs in the medullary compartment was investigated. Of note, low numbers of mTECs were observed, combined with decreased expression levels of the mTEC markers UEA-1, keratin-5, claudin-3 and claudin-4. The reduction of mTECs in the medullary compartment could explain the inflammatory phenotype of CD4+ T cells in CYLDex7/8 mice leading to the severe intestinal pathology observed in these mice. Taken together, these results show an important role of sCYLD in T cell development and function as well as in NF-кB signaling of T cells.

Molecular interaction of the human metalloprotease meprin beta with the amyloid precursor protein, ADAM10, and ADAM17 based on proteomics

Die Zinkendopeptidasen Meprin α und β sind Schlüsselkomponenten in patho(physiologischen) Prozessen wie Entzündung, Kollagenassemblierung und Angiogenese. Nach ihrer Entdeckung in murinen Bürstensaummembranen und humanen Darmepithelien, wurden weitere Expressionsorte identifiziert, z.B. Leukozyten, Krebszellen und die humane Haut. Tiermodelle, Zellkulturen und biochemische Analysen weisen auf Funktionen der Meprine in der Epithelialdifferenzierung, Zellmigration, Matrixmodellierung, Angiogenese, Bindegewebsausbildung und immunologische Prozesse hin. Dennoch sind ihre physiologischen Substrate weitgehend noch unbekannt. Massenspektrometrisch basierte Proteomics-Analysen enthüllten eine einzigartige Spaltspezifität für saure Aminosäurereste in der P1´ Position und identifizierten neue biologische Substratkandidaten. Unter den 269 extrazellulären Proteinen, die in einem Substratscreen identifiziert wurden, stellten sich das amyloid precursor protein (APP) and ADAM10 (a disintegrin and metalloprotease 10) als sehr vielversprechende Kandidaten heraus. Mehrere Schnittstellen innerhalb des APP Proteins, hervorgerufen durch verschiedenen Proteasen, haben unterschiedlichen Auswirkungen zur Folge. Die β-Sekretase BACE (β-site APP cleaving enzyme) prozessiert APP an einer Schnittstelle, welche als initialer Schritt in der Entwicklung der Alzheimer Erkrankung gilt. Toxische Aβ (Amyloid β)-Peptide werden in den extrazellulären Raum freigesetzt und aggregieren dort zu senilen Plaques. Membran verankertes Meprin β hat eine β-Sekretase Aktivität, die in einem Zellkultur-basierten System bestätigt werden konnte. Die proteolytische Effizienz von Meprin β wurde in FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)-Analysen bestimmt und war um den Faktor 104 höher als die von BACE1. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass Meprin β die ersten zwei Aminosäuren prozessiert und somit aminoterminal einen Glutamatrest freisetzt, welcher nachfolgend durch die Glutaminylzyklase in ein Pyroglutamat zykliert werden kann. Trunkierte Aβ-Peptide werden nur in Alzheimer Patienten generiert. Aufgrund einer erhöhten Hydrophobie weisen diese Peptide eine höhere Tendenz zur Aggregation auf und somit eine erhöhte Toxizität. Bis heute wurde keine Protease identifiziert, welche diese Schnittstelle prozessiert. Die Bildung der Meprin vermittelten N-terminalen APP Fragmenten wurde in vitro und in vivo detektiert. Diese N-APP Peptide hatten keine cytotoxischen Auswirkungen auf murine und humane Gehirnzellen, obwohl zuvor N-APP als Ligand für den death receptor (DR) 6 identifiziert wurde, der für axonale Degenerationsprozesse verantwortlich ist. rnIm nicht-amyloidogenen Weg prozessiert ADAM10 APP und entlässt die Ektodomäne von der Zellmembran. Wir konnten das ADAM10 Propeptid als Substrat von Meprin β identifizieren und in FRET Analysen, in vitro und in vivo zeigen, dass die Meprin vermittelte Prozessierung zu einer erhöhten ADAM10 Aktivität führt. Darüber hinaus wurde ADAM10 als Sheddase für Meprin β identifiziert. Shedding konnte durch Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) oder durch das Ionophor A23187 hervorgerufen werden, sowie durch ADAM10 Inhibitoren blockiert werden. rnDiese Arbeit konnte somit ein komplexes proteolytisches Netwerk innerhalb der Neurophysiologie aufdecken, welches für die Entwicklung der Alzheimer Demenz wichtig sein kann.rn

Membrane properties and synaptic integration of identified neuronal populations in the developing rodent neocortex

In my PhD work I concentrated on three elementary questions that are essential to understand the interactions between the different neuronal cell populations in the developing neocortex. The questions regarded the identity of Cajal-Retzius (CR) cells, the ubiquitous expression of glycine receptors in all major cell populations of the immature neocortex, and the role of taurine in the modulation of immature neocortical network activity.rnTo unravel whether CR cells of different ontogenetic origin have divergent functions I investigated the electrophysiological properties of YFP+ (derived from the septum and borders of the pallium) and YFP− CR cells (derived from other neocortical origins). This study demonstrated that the passive and active electrophysiological properties as well as features of GABAergic PSCs and glutamatergic currents are similar between both CR cell populations. These findings suggest that CR cells of different origins most probably support similar functions within the neuronal networks of the early postnatal cerebral cortex.rnTo elucidate whether glycine receptors are expressed in all major cell populations of the developing neocortex I analyzed the functional expression of glycine receptors on subplate (SP) cells. Activation of glycine receptors by glycine, -alanine and taurine elicited membrane responses that could be blocked by the selective glycinergic antagonist strychnine. Pharmacological experiments suggest that SP cells express functional heteromeric glycine receptors that do not contain 1 subunits. The activation of glycine receptors by glycine and taurine induced a membrane depolarization, which mediated excitatory effects. Considering the key role of SP cells in immature cortical networks and the development of thalamocortical connections, this glycinergic excitation may influence the properties of early cortical networks and the formation of cortical circuits.rnIn the third part of my project I demonstrated that tonic taurine application induced a massive increase in the frequency of PSCs. Based on their reversal potential and their pharmacological properties these taurine-induced PSCs are exclusively transmitted via GABAA receptors to the pyramidal neurons, while both GABAA and glycine receptors were implicated in the generation of the presynaptic activity. Accordingly, whole-cell and cell-attached recordings from genetically labeled interneurons revealed the expression of glycine and GABAA receptors, which mediated an excitatory action on these cells. These findings suggest that low taurine concentrations can tonically activate exclusively GABAergic networks. The activity level maintained by this GABAergic activity in the immature nervous system may contribute to network properties and can facilitate the activity dependent formation of adequate synaptic projections.rnIn summary, the results of my studies complemented the knowledge about neuronal interactions in the immature neocortex and improve our understanding of cellular processes that guide neuronal development and thus shape the brain.rn

Resonance properties of different neuronal populations in the immature mouse neocortex

Subthreshold resonance is a characteristic membrane property of different neuronal classes, is critically involved in the generation of network oscillations, and tunes the integration of synaptic inputs to particular frequency ranges. In order to investigate whether resonance properties of distinct neuronal populations in the immature neocortex contribute to these network oscillations, I performed whole-cell patch-clamp recordings from visually identified neurons in tangential and coronal neocortical slices from postnatal day (P) P0-P7 C57Bl/6 and P6-P13 GAD67-GFP knock-in mice. Subthreshold resonance was analyzed by sinusoidal current injection of varying frequency. All Cajal-Retzius cells showed subthreshold resonance with an average frequency of 2.6 ± 0.1 Hz (n=60), which was massively reduced by ZD7288, a blocker of hyperpolarization-activated cation currents. About 65.6% (n=61) of the supragranular pyramidal neurons showed subthreshold resonance with an average frequency of 1.4 ± 0.1 Hz (n=40). Application of 1 mM Ni2+ suppressed subthreshold resonance, suggesting that low-threshold Ca2+ currents contribute to resonance in these neurons. About 63.6% (n=77) of the layer V pyramidal neurons showed subthreshold resonance with an average frequency of 1.4 ± 0.2 Hz (n=49), which was abolished by ZD7288. Only 44.1% (n=59) of the subplate neurons showed subthreshold resonance with an average frequency of 1.3 ± 0.2 Hz (n=26) and a small resonance strength. Finally, 50% of the investigated GABAergic interneurons showed subthreshold resonance with an average frequency of 2.0 ± 0.2 Hz (n=42). Membrane hyperpolarization to –86 mV attenuated the frequency and strength of subthreshold resonance. Subthreshold resonance was virtually abolished in the presence of 1 mM Ni2+, suggesting that t-type Ca2+ currents are critically involved in the generation of resonance, while ZD7288 had no effect. Application of 0.4 µM TTX suppressed subthreshold resonance at depolarized, but not hyperpolarized membrane potential, suggesting that persistent Na+ current contribute to the amplification of membrane resonance. rnIn summary, these results demonstrate that all investigated neuronal subpopulations reveal resonance behavior, with either hyperpolarization-activated cation or low-threshold Ca2+ currents contributing to the subthreshold resonance. GABAergic interneurons also express subthreshold resonance at low frequencies, with t-type Ca2+ and persistent Na+ currents underlying the generation of membrane resonance. The membrane resonance of immature neurons may contribute to the generation of slow oscillatory activity pattern in the immature neocortex and enhance the temporal precision of synaptic integration in developing cortical neurons.rn

Behavioural analysis of mouse mutants with altered neuronal and glial genes

Im ersten Teil dieser Doktorarbeit beabsichtigte meine Arbeit, die funktionelle Beteiligung des CB1 Rezeptors, einer Hauptkomponente des neuronalen Endocannabinoid-Systems (ECS), an der Ausbildung von verschiedenen Verhaltensphänotypen mit Hilfe von konditionalen Mausmutanten, denen der CB1 Rezeptor auf verschiedenen neuronalen Unterpopulationen fehlt, aufzuschlüsseln und zu untersuchen. Verschiedene Verhaltensmodelle wurden hierzu getestet. Dabei lag der Fokus dieser Arbeit auf der CB1f/f;D1-Cre Mauslinie, welche der CB1 Rezeptor auf den D1 Rezeptor exprimierenden Neuronen des Striatums fehlt. Ich konnte zeigen, dass der Verlust des CB1 Rezeptors auf diesen Neuronen keinen Einfluss auf basale neurologische Funktionen, Gewicht, Bewegung, Exploration, Sozialverhalten, Angst und Stressbewältigung der Tiere hat, jedoch eine Beteiligung an der Entwicklung von Suchtverhalten gegeben ist. Bei Betrachtung des Kokain-induzierten Suchtverhaltens zeigten die konditionalen Mausmutanten eine reduzierte Suchtanfälligkeit sowohl im Vergleich zu Tieren mit einem totalen CB1 Rezeptor Verlust in allen Körperzellen, als auch zu genetisch unveränderten Kontrollmäusen beider Linien.rnDes Weiteren zeigen die Ergebnisse dieser Studie eine große, aber gegensätzliche Beteiligung des ECS bei der Regulation von Exploration in Abhängigkeit des Verlustes des CB1 Rezeptors auf GABAergen Neuronen des Vorderhirns und kortikalen glutamatergen Neuronen, jedoch nicht auf striatalen Neuronen alleine. Zusätzlich war ich in der Lage, die Wichtigkeit des genetischen Hintergrunds von Mauslinien nicht nur auf die Ausbildung von spezifischen Verhaltensphänotypen, sondern auch auf die Genexpression zu zeigen.rnIn dem zweiten Teil dieser Arbeit, in dem ich mich auf die Funktion von Gliazellen konzentrierte, wurden ebenfalls Mausmutanten in verschiedenen Verhaltensmodellen getestet. Ein genetisches Auslöschen des NG2 Glykoproteins in Gliazellen sorgt in den Knock-out Mäusen für ein schlechteres Hörvermögen und ein reduziertes Depressionsverhalten im Vergleich zu ihren Wildtyp-Kontrollmäusen. Interessanterweise zeigten diese Tiere auch eine reduzierte Empfänglichkeit bei chemisch induzierten epileptischen Krämpfen, was eine Rolle des NG2 Glykoproteins bei der Kontrolle der glutamatergen Homöostase vorschlägt, die wahrscheinlich durch Strukturänderungen der Neuron-Glia-Synapse verursacht wird. rn

Targeting neuronal populations by AAV-mediated gene transfer for studying the endocannabinoid system

The cannabinoid type 1 (CB1) receptor is involved in a plethora of physiological functions and heterogeneously expressed on different neuronal populations. Several conditional loss-of-function studies revealed distinct effects of CB1 receptor signaling on glutamatergic and GABAergic neurons, respectively. To gain a comprehensive picture of CB1 receptor-mediated effects, the present study aimed at developing a gain-of-function approach, which complements conditional loss-of-function studies. Therefore, adeno-associated virus (AAV)-mediated gene delivery and Cre-mediated recombination were combined to recreate an innovative method, which ensures region- and cell type-specific transgene expression in the brain. This method was used to overexpress the CB1 receptor in glutamatergic pyramidal neurons of the mouse hippocampus. Enhanced CB1 receptor activity at glutamatergic terminals caused impairment in hippocampus-dependent memory performance. On the other hand, elevated CB1 receptor levels provoked an increased protection against kainic acid-induced seizures and against excitotoxic neuronal cell death. This finding indicates the protective role of CB1 receptor on hippocampal glutamatergic terminals as a molecular stout guard in controlling excessive neuronal network activity. Hence, CB1 receptor on glutamatergic hippocampal neurons may represent a target for novel agents to restrain excitotoxic events and to treat neurodegenerative diseases. Endocannabinoid synthesizing and degrading enzymes tightly regulate endocannabinoid signaling, and thus, represent a promising therapeutic target. To further elucidate the precise function of the 2-AG degrading enzyme monoacylglycerol lipase (MAGL), MAGL was overexpressed specifically in hippocampal pyramidal neurons. This genetic modification resulted in highly increased MAGL activity accompanied by a 50 % decrease in 2-AG levels without affecting the content of arachidonic acid and anandamide. Elevated MAGL protein levels at glutamatergic terminals eliminated depolarization-induced suppression of excitation (DSE), while depolarization-induced suppression of inhibition (DSI) was unchanged. This result indicates that the on-demand availability of the endocannabinoid 2-AG is crucial for short-term plasticity at glutamatergic synapses in the hippocampus. Mice overexpressing MAGL exhibited elevated corticosterone levels under basal conditions and an increase in anxiety-like behavior, but surprisingly, showed no changes in aversive memory formation and in seizure susceptibility. This finding suggests that 2 AG-mediated hippocampal DSE is essential for adapting to aversive situations, but is not required to form aversive memory and to protect against kainic acid-induced seizures. Thus, specific inhibition of MAGL expressed in hippocampal pyramidal neurons may represent a potential treatment strategy for anxiety and stress disorders. Finally, the method of AAV-mediated cell type-specific transgene expression was advanced to allow drug-inducible and reversible transgene expression. Therefore, elements of the tetracycline-controlled gene expression system were incorporated in our “conditional” AAV vector. This approach showed that transgene expression is switched on after drug application and that background activity in the uninduced state was only detectable in scattered cells of the hippocampus. Thus, this AAV vector will proof useful for future research applications and gene therapy approaches.

FaSSIF-C, a Cholesterol containing biorelevant intestinal model medium for development and test of oral drug formulations

Biorelevante Medien sind entwickelt worden, um die Bedingungen im Magen-Darm-Trakt vor und nach der Mahlzeit zu imitieren. Mit FaSSIF und FeSSIF wurden Medien eingeführt, die nicht nur die pH- und Puffer-Kapazität des Dünndarms widerspiegeln, sondern auch Lipid und physiologische Tensid-Arten enthalten. Diese Medien (FaSSIF-V2 und FaSSlFmod6.5) wurden für Bioverfügbarkeitstudien in der Medikamentenentwicklung im Laufe der Jahre kontinuierlich weiterentwickelt. Dennoch sind die auf dem Markt verfügbaren Medien immer noch nicht in der Lage, die realen physiologischen Bedingungen zu simulieren. In der jetzigen Zusammensetzung sind nicht alle Kompetenten enthalten, welche natürlicher Weise im Duodenum vorkommen. Darüber hinaus wird nur eine 1:5 Verdünnung von FeSSIF zu FaSSIF angenommen, die individuelle Wasserzufuhr bei Medikamentengabe wird hierdurch jedoch nur eingeschränkt simuliert, obwohl diese von Patient zu Patient schwanken kann. rnZiel dieser Dissertation war die Verbesserung der Vorhersage der Auflösung und Absorption lipophiler Arzneistoffe durch Simulation der Bedingungen im zweiten Teil des Zwölffingerdarms mit neuen biorelevanten Medien, sowie unter Einwirkung zusätzlicher Detergention als Wirkstoffträger. rnUm den Effekt der Verdünnungsrate und Zeit im Dünndarm zu untersuchen, wurde die Entwicklung der Nanopartikel in der Magen-Darm-Flüssigkeit FaSSIFmod6.5 zu verschiedenen Zeitpunkten und Wassergehalten untersucht. Dafür wurden kinetische Studien an verschieden konzentrierten Modellmedien nach Verdünnungssprung untersucht. Das Modell entspricht der Vermischung der Gallenflüssigkeit mit dem Darminhalt bei variablem Volumen. Die Ergebnisse zeigen, dass Art und Größe der Nanopartikel stark von Verdünnung und Einirkungszeit abhängen. rnrnDie menschliche Darmflüssigkeit enthält Cholesterin, welches in allen früheren Modellmedien fehlt. Daher wurden biokompatible und physiologische Modellflüssigkeiten, FaSSIF-C, entwickelt. Der Cholesteringehalt von FaSSIF - 7C entspricht der Gallenflüssigkeit einer gesunden Frau, FaSSIF - 10C der einer gesunden männlichen Person und FaSSIF - 13C der in einigen Krankheitszuständen. Die intestinale Teilchen-Struktur-Untersuchung mit dynamische Lichtstreuung (DLS) und Neutronen-Kleinwinkelstreuung (SANS) ergab, dass die Korngröße von Vesikeln mit zunehmender Cholesterin-Konzentration abnahm. Zu hohe Cholesterin-Konzentration bewirkte zusätzlich sehr große Partikel, welche vermutlich aus Cholesterin-reichen “Disks“ bestehen. Die Löslichkeiten einiger BCS Klasse II Wirkstoffe (Fenofibrat, Griseofulvin, Carbamazepin, Danazol) in diesen neuen Medien zeigten, dass die Löslichkeit in unterschiedlicher Weise mit der Cholesteringehalt zusammen hing und dieser Effekt selektiv für die Droge war. rnDarüber hinaus wurde die Wirkung von einigen Tensiden auf die kolloidale Struktur und Löslichkeit von Fenofibrat in FaSSIFmod6.5 und FaSSIF -7C untersucht. Struktur und Löslichkeit waren Tensid- und Konzentrations-abhängig. Im Falle von FaSSIFmod6.5 zeigten die Ergebnisse eine dreifache Verzweigung der Lösungswege. Im Bereich mittlerer Tensidkonzentration wurde eine Löslichkeitslücke der Droge zwischen der Zerstörung der Galle-Liposomen und der Bildung von Tensid-reichen Mizellen beobachtet. In FaSSIF - 7C, zerstörten Tenside in höherer Konzentration die Liposomenstruktur trotz der allgemeinen Stabilisierung der Membranen durch Cholesterin. rnDie in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse ergeben, dass die Anwesenheit von Cholesterin als eine fehlende Komponente der menschlichen Darmflüssigkeit in biorelevanten Medien wichtig ist und dazu beitragen kann, das in vivo Verhalten schwerlöslicher Arzneistoffe im Körper besser vorhersagen zu können. Der Verdünnungsgrad hat einen Einfluss auf die Nanopartikel-Struktur und Tenside beeinflussen die Löslichkeit von Medikamenten in biorelevanten Medien: Dieser Effekt ist sowohl von der Konzentration das Tensids abhängig, als auch dessen Typ.rnrn