Mechanismen der Caveolin-Genregulation in neuralen Zellsystemen

Caveolae sind vesikuläre Invaginationen der eukaryontischen Zellmembran, die bei einer Vielzahl zellbiologischer Prozesse eine bedeutende Rolle spielen. Die strukturellen und funktionellen Hauptbestandteile der Caveolae sind die Caveolin-Proteine, welche von drei homologen Genen (Caveolin-1,-2,-3) kodiert werden. Die Caveoline stellen die Struktur-Organisatoren der Caveolae dar, und regulieren direkt die Aktivität von zahlreichen Caveolae-assoziierten Rezeptorproteinen und Signalmolekülen. Oftmals werden die pleiotropen Effekte der Caveoline über eine Veränderung der Caveolin-Genexpressionsstärke moduliert. In der vorliegenden Arbeit wurden drei unterschiedliche biologische Steuerfaktoren identifiziert, unter deren Kontrolle die Caveolin-Genexpression in neuralen Zellsystemen steht. Bei diesen Faktoren handelt es sich um das Steroidhormon Oestrogen und seine Rezeptoren, den Wachstumsfaktor TGFa und den sekundären Botenstoff zyklisches AMP (cAMP). Oestrogen wirkt über die Aktivierung von Oestrogen-Rezeptoren (ERs) im zentralen Nervensystem in der Regel als neurotropher Faktor. In der vorliegenden Arbeit konnte erstmalig gezeigt werden, daß in humanen Neuroblastom-Zellen (SK-N-MC) die stabile, rekombinante Expression des ERa-Subtyps zu einer drastischen Reduktion der Caveolin-1/-2-Transkription führt, und daß in der Folge die zelluläre Caveolin-Biosynthese eingestellt wird. Eine Analyse des Caveolin-1-Gens ergab, daß einhergehend mit der Inaktivierung der Caveolin-1-Transkription eine Vielzahl der im Promoter enthaltenen CpG-Dinukleotide methyliert vorliegen. Durch pharmakologische Inhibition der nukleären DNA-Methyltransferasen sowie der Histon-Deacetylasen konnte die Caveolin-1-Transkription teilweise wiederhergestellt werden. Diese Befunde lassen auf die Existenz eines DNA-Methylierungs-abhängigen Stilllegungsmechanismus der Caveolin-Genexpression durch ERa schließen. Dagegen führte die Überexpression des ERb-Subtyps in SK-N-MC-Zellen zu keiner Veränderung der Caveolin-1/-2-Expression. Interessanterweise wurde die supprimierende Wirkung des ERa durch die gleichzeitige Überexpression des ERb vollständig aufgehoben. Der mitogene Wachstumsfaktor TGFa wurde als zweites extrazelluläres Signalmolekül identifiziert, welches eine Reduktion der Caveolin-1/-2-Genexpression bewirkt. In primären kortikalen Astrozyten konnte gezeigt werden, daß TGFa seine supprimierende Wirkung auf die Caveolin-1-Expression partiell über die Aktivierung des PI3-Kinase-abhängigen Signalweges vermittelt. Zudem wurde die supprimierende Wirkung von TGFa durch einen Inhibitior der Histon-Deacetylasen relativiert. Daher scheinen sowohl für den ERa als auch für TGFa epigenetische Prozesse bei der Suppression der Caveolin-1-Genexpression eine entscheidende Rolle zu spielen. Intrazellulär wirkte neben der PI3-Kinase auch der Botenstoff cAMP in kortikalen Astrozyten als Suppressor der Caveolin-Genexpression. Es wäre denkbar, daß die Caveolin-Suppression funktioneller Bestandteil des seit langem etablierten Effekts der cAMP-induzierten Astrozyten-Differenzierung ist. Desweiteren wiesen der cAMP- und TGFa-abhängige Signalweg ein überlappendes, Gehirnregion-spezifisches Regulationsprofil der Caveolin-Expression in Astrozyten auf: während in Kortex und Striatum eine Regulation durch cAMP und TGFa erfolgte, blieb diese in Klein- und Zwischenhirn aus. Somit bewirken drei zentrale regulatorische Faktoren der Proliferation und Differenzierung neuraler Zellen eine Reduktion in der Konzentration der pleiotrop funktionellen Caveoline. Zukünftige Studien müssen zeigen, inwieweit die reduzierte Caveolin-Expression für die morphologischen und biochemischen Primärwirkungen dieser Faktoren während der Entwicklung und im Zuge der Tumorgenese mitverantwortlich ist. Außerdem könnten über die Beobachtungen der zellbiologischen Auswirkungen reduzierter Caveolin-Spiegel neue Erkenntnisse über die Funktion dieser Proteine gewonnen werden.

Regulation der Phorbolester-induzierten Matrix-Metalloproteinase-9-Expression in humanen Brustkrebszelllinien durch Stickstoffmonoxid

Das Hauptziel dieser Arbeit war die Identifizierung der Regulationsebenen auf denen die TPA-induzierte Matrix-Metalloproteinase-9 (MMP-9) durch das nitrose Gas Stickstoffmonoxid (NO) in MCF-7-Zellen verändert wird. Dabei konnte sowohl mit Hilfe der Zymographie als auch mit einem MMP-9-Aktivitäts-ELISA gezeigt werden, dass die extrazellulären MMP-9-Spiegel durch die Behandlung der Zellen mit NO reduziert werden. Gleichzeitig zeigte sich auch eine durch NO bedingte Abnahme der intrazellulären MMP-9-Spiegel, wie mit Hilfe von Western-Blot-Analyse nachgewiesen werden konnte. Experimente mit dem Proteasominhibitor Lactacystin und dem Proteinsynthesehemmstoff Cycloheximid ließen darüber hinaus eine NO-bedingte Veränderung der MMP-9-Proteinstabilität ausschließen. Im Gegensatz dazu konnte mittels der metabolischen Markierung mit radioaktiv markiertem Methionin und Cystein gezeigt werden, dass die Proteinneusynthese der MMP-9 durch eine Behandlung der Zellen mit NO stark beeinträchtigt wird. In Übereinstimmung mit diesen Daten finden sich reduzierte MMP-9-mRNA-Spiegel auch in der polysomalen Zellfraktion von MCF-7-Zellen. Wie mit Hilfe des Transkriptionshemmstoffes Actinomycin D und durch Reportergenstudien mit hybriden MMP-9-Promotorkonstrukten gezeigt werden konnte, ist die NO-induzierte Reduktion der MMP-9-mRNA-Spiegel nicht auf eine Verringerung der MMP-9-mRNA-Stabilität zurückzuführen. Reportergenstudien mit einem 670bp langen Promotorfragment des 5’flankierenden Bereichs des humanen MMP-9-Gens zeigten jedoch auf, dass der hemmende Effekt des NOs zum Teil auf eine NO-vermittelte Abnahme der TPA-induzierten MMP-9-Promotoraktivität zurückgeführt werden kann. Demzufolge wurde in den nachfolgenden Experimenten nach den für die MMP-9-Expression notwendigen und von NO modulierten Transkriptionsfaktoren in MCF-7-Zellen gesucht. Anhand von Western-Blot-Analysen und Gelshiftanalysen konnte gezeigt werden, dass die Aktivität des Transkriptionsfaktors AP-1 in MCF-7-Zellen durch NO gehemmt wird, während weder die Expressionspiegel noch die Bindungsaffinität der Transkriptionsfaktoren NFκB und Sp1 durch die NO-Behandlung verändert sind. Weiterhin konnte unter Verwendung von pharmakologischen Inhibitoren der MAPK-Signalwege mit Hilfe der Western-Blot-Analyse nachgewiesen werden, dass MAPK-vermittelte Signalwege zwar für die Induktion der MMP-9-Expression essenziell sind, diese jedoch nicht von NO beeinflusst sind. Im Unterschied hierzu konnte mit Hilfe eines PKC-Aktivitätsassays gezeigt werden, dass die Gesamtaktivität von PKCs nach Behandlung von MCF-7-Zellen mit NO signifikant gehemmt ist. Zusammenfassend zeigen diese Untersuchungen, dass die NO-vermittelte Hemmung der TPA-induzierten MMP-9-Expression in MCF-7-Zellen im Wesentlichen auf eine NO-abhängige Reduktion der Protein-Kinase-C-Aktivität und einer daraus resultierenden Aktivitätshemmung des Transkriptionsfaktors AP-1 zurückgeführt werden kann.

Einfluss der Modulation von P-Glykoprotein (P-gp) auf die Verfügbarkeit und Wirksamkeit der pharmakologischen Behandlung psychiatrischer Erkrankungen im Tiermodell

P-Glykoprotein (P-gp) ist ein ATP-verbrauchender Transporter, der in Organschranken exprimiert wird, um Fremdstoffe auszuschleusen, darunter auch Psychopharmaka. Im Rahmen dieser Arbeit wurde im Tiermodell der Maus untersucht, welche pharmakokinetischen und pharmakodynamischen Konsequenzen sich bei Verabreichung von Risperidon als P-gp Modellsubstrat ergeben, wenn die Expression von P-gp induziert wird. Als potenzielle Induktoren wurden Dexamethason, Rifampicin, Quercetin, 5-Pregnen-3ß-ol-20-on-16α-Carbonitril (PCN) und Acitretin geprüft. Es konnte gezeigt werden, dass alle Substanzen die Verteilung von Risperidon und seinem aktiven Metaboliten 9-Hydroxyrisperidon beeinflussten. Während sich für Quercetin und Acitretin leichte P-gp inhibitorische Eigenschaften ergaben, die an Hand von erhöhten Konzentrationen von Risperidon und 9-Hydroxyrisperidon gezeigt werden konnten, führten die bekannten P-gp Induktoren Rifampicin, Dexamethason und PCN zu verringerten Konzentrationen im Vergleich zur Kontrollgruppe. Durch Western Blot Untersuchungen wurde bestätigt, dass die Induktoren die P-gp Expression im Hirngewebe tendenziell steigerten. Dies sprach dafür, dass bei Verabreichung einer Komedikation, die P-gp induziert, mit einer veränderten Verteilung von P-gp Substraten zu rechnen ist. Darüber hinaus konnte nachgewiesen werden, dass durch eine Hemmung bzw. Induktion von P-gp nicht nur die Pharmakokinetik, sondern auch die Pharmakodynamik von Risperidon und 9-Hydroxyrisperidon verändert wird. Dies wurde durch verhaltenspharmakologische Untersuchungen gezeigt. Durch Risperidon induzierte motorische Effekte auf dem RotaRod waren nach Induktion von P-gp abgeschwächt. Dies zeigte sich auch für Haloperidol, welches kein Substrat ist. Da P-gp abhängige Effekte in diesem Fall keine bedeutende Rolle spielen, ist davon auszugehen, dass neben der Induktion von P-gp an der Blut-Hirn Schranke auch andere Mechanismen wie z.B. eine Induktion von Enzymen der CYP-Familie an den beobachteten Effekten beteiligt sind. Bei Untersuchungen von kognitiven Leistungen in der Barnes Maze konnte gezeigt werden, dass Haloperidol im Gegensatz zu Risperidon das Lernverhalten negativ beeinflussen kann. Eine P-gp Induktion schien jedoch keinen deutlichen Einfluss auf das Lernverhalten unter Antipsychotika-Gabe zu haben und sprach vielmehr für substanzabhängige Effekte der einzelnen Antipsychotika bzw. P-gp Modulatoren. Zusatzuntersuchungen zur Hirngängigkeit von Acitretin, einem synthetischen Retinoid, welches derzeit als potenzielles Antidementivum geprüft wird, konnten belegen, dass es die Blut-Hirn Schranke überwindet. Bereits 1h nach Injektion war Acitretin in hoher Konzentration im Gehirn nachweisbar. Durch die Analyse zur Verteilung von Acitretin in Hirngewebe und Serum von P-gp Wildtyp und P-gp doppel knockout Mäusen konnte belegt werden, dass Acitretin nicht P-gp abhängig transportiert wird. Die Daten insgesamt betrachtet, lassen den Schluss zu, dass durch Verabreichung von Medikamenten, die P-gp Modulatoren sind, bei Antipsychotika mit pharmakokinetischen Interaktionen zu rechnen ist, welche die Wirksamkeit der Medikamente einschränken können.

Consequences of DNA damage for gene transcription : direct effects of modified nucleobases and the role of base excision repair = Folgen von DNA-Schäden für die Gentranskription

The presence of damaged nucleobases in DNA can negatively influence transcription of genes. One of the mechanisms by which DNA damage interferes with reading of genetic information is a direct blockage of the elongating RNA polymerase complexes – an effect well described for bulky adducts induced by several chemical substances and UV-irradiation. However, other mechanisms must exist as well because many of the endogenously occurring non-bulky DNA base modifications have transcription-inhibitory properties in cells, whilstrnnot constituting a roadblock for RNA polymerases under cell free conditions. The inhibition of transcription by non-blocking DNA damage was investigated in this work by employing the reporter gene-based assays. Comparison between various types of DNA damage (UV-induced pyrimidine photoproducts, oxidative purine modifications induced by photosensitisation, defined synthetic modified bases such as 8-oxoguanine and uracil, and sequence-specific single-strand breaks) showed that distinct mechanisms of inhibition of transcription can be engaged, and that DNA repair can influence transcription of the affectedrngenes in several different ways.rnQuantitative expression analyses of reporter genes damaged either by the exposure of cells to UV or delivered into cells by transient transfection supported the earlier evidence that transcription arrest at the damage sites is the major mechanism for the inhibition of transcription by this kind of DNA lesions and that recovery of transcription requires a functional nucleotide excision repair gene Csb (ERCC6) in mouse cells. In contrast, oxidisedrnpurines generated by photosensitisation do not cause transcriptional blockage by a direct mechanism, but rather lead to transcriptional repression of the damaged gene which is associated with altered histone acetylation in the promoter region. The whole chain of events leading to transcriptional silencing in response to DNA damage remains to be uncovered. Yet, the data presented here identify repair-induced single-strand breaks – which arise from excision of damaged bases by the DNA repair glycosylases or endonucleases – as arnputative initiatory factor in this process. Such an indirect mechanism was supported by requirement of the 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) for the inhibition of transcription by synthetic 8-oxodG incorporated into a reporter gene and by the delays observed for the inhibition of transcription caused by structurally unrelated base modifications (8-oxoguanine and uracil). It is thereby hypothesized that excision of the modified bases could be a generalrnmechanism for inhibition of transcription by DNA damage which is processed by the base excision repair (BER) pathway. Further gene expression analyses of plasmids containing single-strand breaks or abasic sites in the transcribed sequences revealed strong transcription inhibitory potentials of these lesions, in agreement with the presumption that BER intermediates are largely responsible for the observed effects. Experiments with synthetic base modifications positioned within the defined DNA sequences showed thatrninhibition of transcription did not require the localisation of the lesion in the transcribed DNA strand; therefore the damage sensing mechanism has to be different from the direct encounters of transcribing RNA polymerase complexes with DNA damage.rnAltogether, this work provides new evidence that processing of various DNA basernmodifications by BER can perturb transcription of damaged genes by triggering a gene silencing mechanism. As gene expression can be influenced even by a single DNA damage event, this mechanism could have relevance for the endogenous DNA damage induced in cells under normal physiological conditions, with a possible link to gene silencing in general.

Improving adoptive T cell therapies of cancer by ectopic expression of miR181a to repress inhibitory phosphatases

Adoptive T cell therapy using antigen-specific T lymphocytes is a powerful immunotherapeutic approach against cancer. Nevertheless, many T cells against tumor-antigens exhibit only weak anti-tumoral response. To overcome this barrier it is necessary to improve the potency and anti-tumoral efficacy of these T cells. Activation and activity of T cells are tightly controlled to inhibit unwanted T cell responses and to reduce the risk of autoimmunity. Both are regulated by extrinsic signals and intrinsic mechanisms which suppress T cell activation. The intrinsic mechanisms include the expression of phosphatases that counteract the activation-inducing kinases. Modifying the expression of these phosphatases allows the targeted modulation of T cell reactivity. MicroRNAs (miRNAs) are regulatory small noncoding RNA molecules that control gene expression by targeting messenger RNAs in a sequence specific manner. Gene-specific silencing plays a key role in diverse biological processes, such as development, differentiation, and functionality. miR181a has been shown to be highly expressed in immature T cells that recognize low-affinity antigens.rnThe present study successfully shows that ectopic expression of miR181a is able to enhance the sensitivity of both murine and human T cells. In CD4+ T helper cells as well as in CD8+ cytotoxic T cells the overexpression of miR181a leads to downregulation of multiple phosphatases involved in the T cell receptor signaling pathway. Overexpression of miR181a in human T cells achieves a co-stimulatory independent activation and has an anti-apoptotic effect on CD4+ T helper cells. Additionally, increasing the amount of miR181a enhances the cytolytic activity of murine CD8+ TCRtg T cells in an antigen-specific manner.rnTo test miR181a overexpressing T cells in vivo, a mouse tumor model using a B cell lymphoma cell line (A20-HA) expressing the Influenza hemagglutinin (Infl.-HA) antigen was established. The expression of model antigens in tumor cell lines enables targeted elimination of tumors using TCRtg T cells. The transfer of miR181a overexpressing Infl.-HA TCRtg CD8+ T cells alone has no positive effect neither on tumor control nor on survival of A20-HA tumor-bearing mice. In contrast, the co-transfer of miR181a overexpressing Infl.-HA TCRtg CD8+ and CD4+ T cells leads to improved tumor control and prolongs survival of A20-HA tumor-bearing mice. This effect is characterized by higher amounts of effector T cells and the expansion of Infl.-HA TCRtg CD8+ T cells.rnAll effects were achieved by changes in expression of several genes including molecules involved in T cell differentiation, activation, and regulation, cytotoxic effector molecules, and receptors important for the homing process of T cells in miR181a overexpressing T cells. The present study demonstrates that miR181a is able to enhance the anti-tumoral response of antigen-specific T cells and is a promising candidate for improving adoptive cell therapy.