Untersuchung der physiologischen Rolle des Wilms-Tumorgens 1 (WT1) im Rahmen der Generierung muriner in-vivo-Modelle für die Wilms-Tumorerkrankung

Der Wilms-Tumor ist eine embryonale Tumorerkrankung der Niere, als deren Ursprung Nierenvorläuferzellen des metanephrischen Mesenchyms gelten, deren Differenzierung während der frühen Nephrogenese ausbleibt und aus denen nachfolgend durch eine maligne Transformation Wilms-Tumore entstehen. Zwei Gene, die an der Wilms-Tumorgenese beteiligt zu sein scheinen, sind WT1 (Wilms-Tumorgen 1) und CTNNB1 (Catenin, cadherin-associated protein, beta 1). Während WT1 u.a. die Differenzierung des metanephrischen Mesenchyms steuert, begünstigen aktivierende Mutationen von CTNNB1 und eine dadurch bedingte Akkumulation seines Proteins β-Catenin die Tumorgenese vieler Organe. So verwundert es nicht, dass eine alleinige heterozygote Keimbahnmutation von WT1, die einen dominant-negativen Effekt auf funktionsfähiges WT1 ausübt, häufig zur Entstehung von Wilms-Tumoren in Patienten mit Denys-Drash-Syndrom (DDS) führt, sowie in etwa 15 % aller sporadischen Wilms-Tumore WT1 und CTNNB1 mutiert sind.rnDer Mechanismus der Entstehung von Wilms-Tumoren ist weitgehend unbekannt, was u.a. daran liegt, dass homozygote Wt1-Mutationen in der Maus embryonal (~ Tag 13,5 d.p.c.) letal sind. In der vorliegenden Arbeit sollten daher mit Hilfe einer Wt1 k.o.-Effektormaus (WE2) vier murine konditional reversible Wilms-Tumor-Modelle auf Basis des Tet off-Systems hergestellt werden. Dadurch lag in den zu generierenden Tieren Wt1 durch die Integration des WE2-Transgens zwar nur heterozygot mutiert vor, doch durch den endogenen Wt1-Promotor des Transgens sollte es zur zeitlichen und räumlichen Wt1-analogen Expression eines tetrazyklinabhängigen Transaktivators (tTA) kommen, der ohne die Gabe von Doxycyclin Tet-regulierbare Transgene in Wt1-exprimierenden Zellen aktivieren kann, die einen positiven Einfluss auf die Wilms-Tumorgenese haben könnten. So sollte durch das WE2 DDS-Modell ein DDS simuliert werden und es in Tieren der Modelle WE2 TC bCat∆Ex3, WE2 LC bCat∆Ex3 und WE2 Wnt1 zur Akkumulation von β-Catenin in Wt1-exprimierenden Nierenvorläuferzellen kommen, so dass deren Differenzierung ausbleibt und es durch eine maligne Transformation zur Entstehung eines Wilms-Tumors kommt.rnrnMit Hilfe von histologischen Analysen an entsprechenden Responder-Linien konnte zunächst gezeigt werden, dass die embryonale und adulte Expressionsdomäne des WE2-Effektors mit der von endogenen Wt1 übereinstimmt. Gleichzeitig wurden aber auch neue Expressionsorte von Wt1 nachgewiesen. So konnte die Expression des WE2-Effektors z.B. im Endothel der dorsalen Aorta detektiert werden, der als Entstehungsort von hämatopoetischen Stammzellen gilt. Anschließende hier vorgestellte Experimente zeigten, dass Wt1 direkt an diesem Prozess beteiligt ist und belegten eine noch nicht beschriebene Funktion von Wt1 in der frühen Hämatopoese.rnEs war jedoch mit keinem System möglich, eine Wilms-Tumorerkrankung zu simulieren. Während Tiere des WE2 DDS-Modells trotz nachweisbarer Induktion keinen Phänotyp aufwiesen, war wohl in den anderen Modellen eine konstitutive β-Catenin-Aktivierung in der Frühschwangerschaft nicht mit dem embryonalen Überleben vereinbar. Dabei schienen alle tripeltransgenen bzw. doppeltransgenen Embryonen, in denen durch einen frühen Doxycyclinentzug die Entstehung von Wilms-Tumoren möglich gewesen wäre, intrauterin zu sterben. Wurde dagegen Doxycyclin erst in der dritten Lebenswoche entzogen, so entwickelten die Tiere durch eine Wt1-vermittelte β-Catenin-Aktivierung Granulosazelltumore, polyzystische Nieren und Veränderungen der Hoden. Da alle diese organischen Veränderungen während der prä- bis frühen postnatalen Phase induziert wurden, schien die Doxycyclinmenge nicht auszureichen, um eine β-Catenin-Aktivierung zu verhindern. Es hätte also auch zur Entstehung von Wilms-Tumoren kommen können, so dass diese Ergebnisse darauf hinweisen, dass eine β-Catenin-Aktivierung wahrscheinlich nicht der physiologisch entscheidende Schritt bei der Entstehung eines Wilms-Tumors ist.rnrnDie Charakterisierung der WE2-Effektormaus und die Herstellung und Analysen der Systeme geben damit Einblick in die WT1- bzw. WT1/CTNNB1-assoziierte Wilms-Tumorgenese und ermöglichen die weitere Erforschung von Granulosazelltumoren, polyzystsischen Nieren, Veränderungen von Hoden und der Rolle von WT1 in der frühen Hämatopoese.rn

Etablierung transgener BY-2-Zelllinien zur In-vivo-Lokalisierung pflanzlicher Cytoskelettproteine

Bei den Pflanzen sind viele Fragen bezüglich der Organisation und Regulation des bei der Zellteilung und differenzierung wichtigen Auf-, Ab- und Umbaus des Mikrotubuli-Netzwerkes noch immer offen, insbesondere was die Rolle des γ-Tubulins betrifft. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Etablierung von BY-2 Modell-Zelllinien (Nicotiana), die verschiedene mit fluoreszierenden Proteinen (FP) markierte Elemente des Cytoskeletts exprimieren, um eine fluoreszenzmikroskopische Detektion in vivo zu ermöglichen.rnAls Grundlage für alle weiteren Versuche wurde eine zuverlässige Methode zur A. tumefaciens vermittelten stabilen Transfektion von BY-2 Zellen erarbeitet. Für die Expression von FP-markierten Cytoskelettproteinen, wurden entsprechende Fusionskonstrukte kloniert und via A. tumefaciens in BY-2 Zellen transferiert. So gelang zunächst die Herstellung transgener Zelllinien, die GFP-markiertes α- bzw. γ-Tubulin exprimierten. Diese sollten später als Basis für die Untersuchung des dynamischen Mikrotubuli-Netzwerkes bzw. dessen Regulation dienen. In beiden Zelllinien standen die Konstrukte zunächst unter Kontrolle eines doppelten 35S-Promotors, was zu einer starken, konstitutiven Expression der Transgene führte. Fluoreszenzmikroskopisch konnten Strukturen, an deren Aufbau Mikrotubuli beteiligt sind, detektiert werden. Aufgrund einer starken Hintergrundfluoreszenz, vermutlich bedingt durch die konstitutive Überexpression, war die Darstellung feinerer Bereiche, wie sie im Cytoskelett häufig auftreten, jedoch äußerst schwierig. Deshalb wurde eine schwächere bzw. adäquate Expressionsrate angestrebt. rnPhysiologische Expressionsraten sollten vor allem durch den endogenen γ-Tubulin-Promotor ermöglicht werden. Da die entsprechende Sequenz noch unbekannt war, wurde sie zunächst bestimmt und in ein passendes Konstrukt integriert. Fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen der resultierenden Zelllinie ließen auf eine stark reduzierte Expressionsrate schließen. Tatsächlich war die Detektion von Cytoskelettstrukturen, wenn überhaupt, erst bei deutlich längeren Belichtungszeiten möglich. Bedingt durch die langen Belichtungszeiten wurde die Dokumentation durch eine latente pflanzentypische Autofluoreszenz der Zellen erschwert. Auch wenn hier keine detailreicheren Aufnahmen der Cytoskelettstrukturen möglich waren, ist die Zellkultur für weiterführende Untersuchungen, z.B. in Studien bezüglich des zeitlichen Expressionsmusters des γ-Tubulins, potentiell geeignet. Der Einsatz eines sensibleren Mikroskopsystems ist allerdings erforderlich. rnUm klären zu können, inwieweit γ-Tubulin mit den Mikrotubuli co-lokalisiert, wurden Zelllinien benötigt, bei denen die entsprechenden Elemente unterschiedlich markiert waren. Zu diesem Zweck wurde der Einsatz von RFP-markiertem Tubulin getestet. Eine deutliche Überexpression von RFP alleine war möglich. Trotz mehrfacher Wiederholung der Versuche war aber keine Expression von RFP-markiertem α-Tubulin in BY-2 Zellen zur Visualisierung der Mikrotubuli detektierbar. Die DNA-Sequenzen waren im Genom nachweisbar, eine Transkription jedoch nicht. Möglicherweise spielten hier gene silencing Effekte eine Rolle. Das verwendete RFP (TagRFP) und GFP stammten aus unterschiedlichen Organismen, aus einer Seeanemone bzw. einer Qualle. Eine Lösung könnte der Austausch des TagRFP durch ein Quallen-Derivat, das in einer von grün unterscheidbaren Farbe fluoresziert, bringen. Da bereits BY-2 Zelllinien vorliegen, die GFP-markiertes α- bzw. γ-Tubulin exprimieren, sollte es, nach Klonieren eines entsprechenden Konstruktes, zeitnah möglich sein, eine doppelt transfizierte Zelllinie herzustellen.