Einfluss von Resveratrol auf oxidative DNA-Schäden und Mutagenese in vivo

Oxidative DNA-Basenmodifikationen, wie 7,8-Dihydro-8-oxoguanin (8-oxoG), werden endogen in allen Zellen gebildet. Die beobachtbaren Spiegel ergeben sich aus dem Gleichgewicht zwischen der Bildung durch reaktive Sauerstoffspezies (ROS), sowie der gleichzeitigen Reparatur der DNA-Schäden. Durch ihr hohes mutagenes Potential, tragen oxidative DNA-Basenmodifikationen zur spontanen Mutationsrate bei. Der Ausfall wichtiger DNA-Reparaturmechanismen führt in Ogg1(-/-)Csb(-/-)-Knockout-Mäusen zu einem Anstieg von 8 oxoG und der spontanen Mutationsrate.rnIn dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob die basalen Spiegel an oxidativen Basenmodifikationen und die spontanen Mutationsraten in vivo durch die orale Gabe von Resveratrol moduliert werden können. Resveratrol ist ein Pflanzeninhaltsstoff (u.a. aus Rotwein) mit einer Vielzahl von Wirkungen, der bereits in zahlreichen Studien ein chemopräventives Potential gezeigt hat und antioxidativ wirkt.rnAn verschiedenen Mausgenotypen wurden zum einen eine Kurzzeit-Behandlung (7 Tage mit 100 mg/kg per Gavage) und zum anderen eine Langzeit-Behandlung (3-9 Monate mit 0,04% ad libitum) mit Resveratrol durchgeführt. Die oxidativen DNA Schäden wurden in primären Maushepatozyten mit Hilfe einer modifizierten Alkalischen Elution, mit der bakteriellen Formamidopyrimidin-DNA Glykosylase als Sonde, bestimmt. Zur Analyse der Mutationsrate wurde der BigBlue® Mutationsassay mit anschließender Sequenzierung der Mutationen verwendet.rnDie Ergebnisse zeigen, dass die Kurzzeit- und die Langzeit-Behandlung mit Resveratrol die basalen Spiegel oxidativer DNA-Basenmodifikationen senken. Die Reduktion ist jeweils wesentlich ausgeprägter in den reparaturdefizienten Ogg1(-/-)Csb(-/-)-Mäusen zu erkennen. Auch die spontane Mutationsrate wird durch eine mehrmonatige Behandlung mit Resveratrol um ungefähr 20-30% reduziert.rnAnschließende mechanistische Untersuchungen zeigten, dass dieser Schutz wahrscheinlich auf einer Induktion der antioxidativen Schutzmechanismen begründet ist. So wurde gefunden, dass primäre Hepatozyten aus mit Resveratrol behandelten Mäusen wesentlich besser gegen exogen herbeigeführten oxidativen Stress geschützt sind, als Hepatozyten von unbehandelten Tieren. Ein weiterer Hinweis ist die Hochregulation der mRNA-Spiegel von verschiedenen antioxidativen Schutzenzymen, wie Superoxiddismutase 1 / 2, Hämoxygenase 1, Glutathionperoxidase 1, nach der Gabe von Resveratrol in Mäuselebern. Außerdem sind die oxidativen Markermutationen (GC->TA-Transversionen) stärker von der Reduktion der spontanen Mutationsrate betroffen, als andere Mutationen (z.B. GC->AT-Transitionen).rnDie Ergebnisse zeigen erstmalig, dass spontane Mutationen in vivo durch Fremdstoffe in der Nahrung reduziert werden können. Im Falle von Resveratrol wird diese Reduktion wahrscheinlich durch eine Stimulation der antioxidativen Schutzmechanismen ausgelöst.rn

Strahlungsinduzierte Mukositis als Risiko der Raumfahrt : Modelluntersuchungen an Röntgen- und Schwerionen-bestrahlten organotypischen Mundschleimhaut-Modellen

Während ausgedehnter Weltraumflüge zum Mond und Mars wäre die Besatzung eines Raumschiffs dicht ionisierender Schwerionenstrahlung, der sogenannten kosmischen Strahlung, ausgesetzt. Da bei vielen Krebspatienten die orale Mukositis als eine gravierende Nebenwirkung bei der herkömmlichen Strahlentherapie auftritt, könnte diese Erkrankung ein medizinisches Problem während ausgedehnter Weltraumflüge darstellen. Allerdings liegen bislang keine Untersuchungen über eine mögliche Mukositis-induzierte Wirkung von Schwerionenstrahlung vor. Um das Risiko strahlungsinduzierter oraler Mukositis durch kosmische Strahlung abzuschätzen, wurden dreidimensionale organotypische Mundschleimhaut-Modelle 12C Schwerionen- bzw. Röntgenstrahlung ausgesetzt und nach definierten Inkubationszeiten kryokonserviert. Aus dem Material wurden Kryoschnitte gefertigt, mit denen anschließend histologische und immunhistologische Fluoreszenzfärbungen zum Nachweis von zum Beispiel Kompaktheitsverlust, Doppelstrangbrüchen der DNA und NF-κB-Aktivierung durchgeführt wurden. Die Ausschüttung von Tumornekrosefaktor α, Interleukin 1β, Interleukin 6 und Interleukin 8 wurde in Probenüberständen mittels ELISA analysiert. Das Hauptaugenmerk dieser Studie lag dabei auf den frühen durch Strahlung verursachten Effekten. rnIm Rahmen dieser Dissertation wurde ein dreidimensionales Mundschleimhaut-Modell etabliert, das verglichen mit humaner Mundschleimhaut viele organotypische Differenzierungsmarker und in vivo-ähnliche Reaktionen auf bestimmte Reize zeigte. Nach einer Bestrahlung mit schweren Kohlenstoffionen bzw. mit Röntgenstrahlung wurden strahlungsinduzierte Effekte auf mehreren Ebenen detektiert. Bereits 1 h nach Bestrahlung konnten dosisabhängig vermehrte Doppelstrangbrüche in der DNA detektiert werden, wobei bei gleicher Dosis Schwerionenstrahlung im Durchschnitt doppelt so viele DSB verursachte wie Röntgenstrahlung. Das Mundschleimhaut-Modell reagierte auf beide Strahlungsarten mit einer Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-κB p50, wobei Röntgenstrahlung diese Aktivierung früher induzierte als Schwerionen. Eine strahlungsinduzierte Aktivierung von NF-κB p65 wurde in den organotypischen Kulturen zu den untersuchten Zeitpunkten nicht beobachtet. Im Vergleich zu nicht bestrahlten Kulturen waren die Konzentrationen von Interleukin 6 und Interleukin 8 unabhängig von der Strahlungsqualität nach Bestrahlung signifikant erhöht. Interleukin-1β dagegen wurde nur nach Röntgenbestrahlung signifikant vermehrt ausgeschüttet. In Schwerionen-bestrahlten Proben wurden zwar tendenziell höhere Konzentrationen beobachtet, statistische Signifikanzen ergaben sich aber nicht. Die Analysen zur TNF-α- und IFN-γ-Ausschüttung in bestrahlten organotypischen Kulturen ergaben innerhalb des gewählten Beobachtungszeitraums von 48 h keine strahlungsinduzierten Effekte. Bei den Untersuchungen der Proliferation in den Zellen der bestrahlten organotypischen Kulturen wurde bereits 24 h nach Röntgenstrahlung und 3 Tage nach Schwerionenstrahlung eine deutliche verminderte Proliferation beobachtet. Des Weiteren zeigte das Mundschleimhaut-Modell unabhängig von Strahlungsqualitäten einen eindeutigen Verlust in der Zellintegrität und daraus resultierenden Kompaktheitsverlust des Gewebes, was in der in vivo-Situation wahrscheinlich einer Gewebedegeneration entspricht. rnNach Bestrahlung mit sowohl Röntgenstrahlung als auch schweren Ionen wurden im gewählten Mukosa-Modell innerhalb von 48 h nach Behandlung strahlungsinduzierte proinflammatorische Marker eindeutig und reproduzierbar detektiert. Dies deutet darauf hin, dass während langer extraterrestrischer Expeditionen das Risiko der oralen Mukositis einkalkuliert und mit den daraus folgenden Konsequenzen gerechnet werden muss.rn

Amphotericin B nano-formulations : development, characterisation and suitability for oral administration

In der Form von Nanokapseln (AmB-HST), Nanoemulsion beziehungsweise multilamellaren Vesikeln (MLV) wurden drei Amphotericin-B-Formulierungen für die orale Applikation entwickelt, charakterisiert und verglichen. Die neuartige homogene Nanokapsel-Formulierung des hydrophoben Polyen-Antimykotikums Amphotericin B wurde in Analogie zu einem für Simvastatin und andere Arzneistoffe etablierten Prozess aus der Reinsubstanz, Lezithin und Gelatine mit Hilfe des HST-Verfahrens hergestellt. Photometrische Untersuchungen zeigten, dass das Endprodukt aus Monomeren aufgebaut ist. Mittels Mikroskopie ließen sich die Aggregate vor der Umhüllung mit Lezithin und Gelatine im Ausgangsmaterial als individuelle kugelförmige Arzneistoffpartikel darstellen. Strukturuntersuchungen mit dynamischer licht streuung (DLS) zeigten eine enge Größenverteilung der verkapselten Partikel von ca. 1 µm. Die Struktur der Hülle der HST-Partikel wurde erstmalig mit Neutronenstreuung unter Verwendung der Deuterium-basierten Lösungsmittel kontrastmethode aufgeklärt. Durch die teilweise Kontrastmaskierung des Partikelkerns bei der Neutronenstreuung konnte die Lezithin-Gelatine-Hülle als eine dünne, 5,64 ± 0.18 nm dicke Schicht aufgelöst werden, welche der biologischen Lipidmembran ähnlich, im Vergleich aber geringfügig größer ist. Dieses Resultat eröffnet Wege für die Optimierung der Formulierung von pharmazeutischen Nanopartikeln, z.B. durch Oberflächenmodifizierungen. Weitere Untersuchungen mittels Kleinwinkelneutronenstreuung unter Verwendung der D-Kontrastvariation deuten darauf hin, dass die Komponenten der Nanokapseln nicht den gleichen Masseschwerpunkt haben, sondern asymmetrisch aufgebaut sind und dass die stärker streuenden Domänen weiter außen liegen. Die Partikel sind im Vergleich zu Liposomen dichter. In-Vitro Freisetzungsstudien belegen das Solubilisierungsvermögen des HST-Systems, wonach die Freisetzung des Arzneistoffes aus der Formulierung zu allen gemessenen Zeitpunkten höher als diejenige der Reinsubstanz war. rnDie Nanoemulsion-Formulierung von Amphotericin B wurde mit einem Öl und Tensid system, jedoch mit unterschiedlichen Co-Solvenzien, erfolgreich entwickelt. Gemäß der Bestimmung der Löslichkeit in verschiedenen Hilfsstoffen erwies sich der Arzneistoff Amphotericin B als nicht-lipophil, gleichzeitig aber auch als nicht-hydrophil. Die zur Ermittlung der für die Emulsionsbildung notwendigen Hilfstoffkonzentrationen erstellten ternären Diagramme veranschaulichten, dass hohe Öl- und Tensidgehalte zu keiner Emulsionsbildung führten. Dementsprechend betrug der höchste Ölgehalt 10%. Die Tröpfchengröße wuchs mit zunehmender Tensidkonzentration, wobei die Co-Solventmenge der Propylenglykol-haltigen Nanoemulsion indirekt verringert wurde. Für die Transcutol®P-haltige Nanoemulsion hingegen wurde das Gegenteil beobachtet, nämlich eine Abnahme der Tröpfchengröße bei steigenden Tensidkonzentrationen. Durch den Einschluss des Arzneistoffes wurde nicht die Viskosität der Formulierung, sondern die Tröpfchengröße beeinflusst. Der Wirkstoffeinschluss führte zu höheren Tröpfchengrößen. Mit zunehmender Propylenglykolkonzentration wurde der Wirkstoffgehalt erhöht, mit zunehmender Transcutol®P-Konzentration dagegen vermindert. UV/VIS-spektroskopische Analysen deuten darauf hin, dass in beiden Formulierungen Amphotericin B als Monomer vorliegt. Allerdings erwiesen sich die Formulierungen Caco-2-Zellen und humanen roten Blutkörperchen gegenüber als toxisch. Da die Kontrollproben eine höhere Toxizität als die wirkstoffhaltigen Formulierungen zeigten, ist die Toxizität nicht nur auf Amphotericin, sondern auch auf die Hilfsstoffe zurückzuführen. Die solubilisierte Wirkstoffmenge ist in beiden Formulierungen nicht ausreichend im Hinblick auf die eingesetzte Menge an Hilfsstoff nach WHO-Kriterien. Gemäß diesen Untersuchungen erscheinen die Emulsions-Formulierungen für die orale Gabe nicht geeignet. Dennoch sind Tierstudien notwendig, um den Effekt bei Tieren sowie die systemisch verfügbare Wirkstoffmenge zu ermitteln. Dies wird bestandskräftige Schlussfolgerungen bezüglich der Formulierung und Aussagen über mögliche Perspektiven erlauben. Nichtsdestotrotz sind die Präkonzentrate sehr stabil und können bei Raumtemperatur gelagert werden.rnDie multilamellar-vesikulären Formulierungen von Amphotericin B mit ungesättigten und gesättigten neutralen Phospholipiden und Cholesterin wurden erfolgreich entwickelt und enthielten nicht nur Vesikel, sondern auch zusätzliche Strukturen bei zunehmender Cholesterinkonzentration. Mittels Partikelgrößenanalyse wurden bei den Formulierungen mit gesättigten Lipiden Mikropartikel detektiert, was abhängig von der Alkylkettenlänge war. Mit dem ungesättigten Lipid (DOPC) konnten hingegen Nanopartikel mit hinreichender Verkapselung und Partikelgrößenverteilung gebildet werden. Die Ergebnisse der thermischen und FTIR-spektroskopischen Analyse, welche den Einfluss des Arzneistoffes ausschließen ließen, liefern den Nachweis für die mögliche, bereits in der Literatur beschriebene Einlagerung des Wirkstoffs in lipid- und/oder cholesterinreiche Membranen. Mit Hilfe eines linearen Saccharosedichtegradienten konnte die Formulierung in Vesikel und Wirkstoff-Lipid-Komplexe nach bimodaler Verteilung aufgetrennt werden, wobei der Arzneistoff stärker mit den Komplexen als mit den Vesikeln assoziiert ist. Bei den Kleinwinkelneutronenstreu-Experimenten wurde die Methode der Kontrastvariation mit Erfolg angewendet. Dabei konnte gezeigt werden, dass Cholesterol in situ einen Komplex mit Amphotericin B bildet. Diesen Sachverhalt legt unter anderem die beobachtete Differenz in der äquivalenten Streulängendichte der Wirkstoff-Lipid- und Wirkstoff-Lipid-Cholesterin-haltigen kleinen unilamellaren Vesikeln nahe. Das Vorkommen von Bragg-Peaks im Streuprofil weist auf Domänen hin und systematische Untersuchungen zeigten, dass die Anzahl der Domänen mit steigendem Cholesteringehalt zunimmt, ab einem bestimmten Grenzwert jedoch wieder abnimmt. Die Domänen treten vor allem nahe der Außenfläche der Modellmembran auf und bestätigen, dass der Wirkstoff in den Cholesterinreichen Membranen vertikal eingelagert ist. Die Formulierung war sowohl Caco-2-Zellen als auch humanen roten Blutkörperchen gegenüber nicht toxisch und erwies sich unter Berücksichtigung der Aufnahme in Caco-2-Zellen als vielversprechend für die orale Applikation. Die Formulierung zeigt sich somit aussichtsreich und könnte in Tabletten weiterverarbeitet werden. Ein Filmüberzug würde den Wirkstoff gegen die saure Umgebung im Magen schützen. Für die Bestimmung der systemischen Verfügbarkeit der Formulierung sind Tierstudien notwendig. Die entwickelten multilamellaren Formulierungen einschließlich der Wirkstoff-Cholesterin-Komplexe bieten somit gute Aussichten auf die mögliche medizinische Anwendung. rnrn