Folic acid derivatives for PET imaging and therapy addressing folate receptor positive tumors

Folic acid, also known as vitamin B9, is the oxidized form of 5,6,7,8-tetrahydrofolate, which serves as methyl- or methylene donor (C1-building blocks) during DNA synthesis. Under physiological conditions the required amount of 5,6,7,8-tetrahydrofolate for survival of the cell is accomplished through the reduced folate carrier (RFC). In contrast, the supply of 5,6,7,8-tetrahydrofolate is insufficient under pathophysiological conditions of tumors due to an increased proliferation rate. Consequently, many tumor cells exhibit an (over)expression of the folate receptor. This phenomenon has been applied to diagnostics (PET, SPECT, MR) to image FR-positive tumors and on the other hand to treat malignancies related to a FR (over)expression. Based on this concept, a new 18F-labeled folate for PET imaging has been developed and was evaluated in vivo using tumor-bearing mice. The incorporation of oligoethylene spacers into the molecular structure led to a significant enhancement of the pharmacokinetics in comparison to previously developed 18F-folates. The liver uptake could be reduced by one sixth by remaining a tumor uptake of 3%ID/g leading to better contrast ratios. Encouraged by these results, a clickable 18F-labeled serine-based prosthetic group has been synthesized, again with the idea to improve the metabolic and pharmacokinetic profile of hydrophilic radiotracers. Therefore, an alkyne-carrying azido-functionalized serine derivative for coupling to biomolecules was synthesized and a chlorine leaving group for 18F-labeling, which could be accomplished using a microwave-assisted synthesis, a [K⊂2.2.2]+/carbonate system in DMSO. Radiochemical yields of 77±6% could be achieved.rnThe promising results obtained from the FR-targeting concept in the diagnostic field have been transferred to the boron neutron capture therapy. Therefore, a folate derivative was coupled to different boron clusters and cell uptake studies were conducted. The synthesis of the folate-boron clusters was straightforward. At first, a linker molecule based on maleic acid was synthesized, which was coupled to the boron cluster via Michael Addition of a thiol and alkene and subsequently coupled to the targeting moiety using CuAAC. The new conjugates of folate and boron clusters led to a significant increase of boron concentration in the cell of about 5-times compared to currently used and approved boron pharmaceuticals. rnMoreover, azido-folate derivatives were coupled to macromolecular carrier systems (pHPMA), which showed an enhanced and specific accumulation at target sites (up to 2.5-times) during in vivo experiments. A specific blockade could be observed up to 30% indicating an efficient targeting effect. A new kind of nanoparticles consisting of a PDLLA core and p((HPMA)-b-LMA)) as surfactants were developed and successfully radiolabeled via 18F-click chemistry in good RCYs of 8±3%rnThe nanoparticles were obtained via the miniemulsion technique in combination with solvent evaporation. The 18F-labeled nanoparticles were applied to in vivo testing using a mouse model. PET imaging showed a “mixed” biodistribution of low molecular weight as well as high molecular weight systems, indicating a partial loss of the 18F-labeled surfactant.rnIn conclusion, the presented work successfully utilized the FR-targeting concept in both, the diagnostic field (PET imaging) and for therapeutic approaches (BNCT, drug delivery systems). As a result, the high potential of FR-targeting in oncological applications has been shown and was confirmed by small animal PET imaging.rn

Neurolinguistic analysis: aspects of language and speech deviations in Palestinian Arabic aphasics

The characteristics of aphasics’ speech in various languages have been the core of numerous studies, but Arabic in general, and Palestinian Arabic in particular, is still a virgin field in this respect. However, it is of vital importance to have a clear picture of the specific aspects of Palestinian Arabic that might be affected in the speech of aphasics in order to establish screening, diagnosis and therapy programs based on a clinical linguistic database. Hence the central questions of this study are what are the main neurolinguistic features of the Palestinian aphasics’ speech at the phonetic-acoustic level and to what extent are the results similar or not to those obtained from other languages. In general, this study is a survey of the most prominent features of Palestinian Broca’s aphasics’ speech. The main acoustic parameters of vowels and consonants are analysed such as vowel duration, formant frequency, Voice Onset Time (VOT), intensity and frication duration. The deviant patterns among the Broca’s aphasics are displayed and compared with those of normal speakers. The nature of deficit, whether phonetic or phonological, is also discussed. Moreover, the coarticulatory characteristics and some prosodic patterns of Broca’s aphasics are addressed. Samples were collected from six Broca’s aphasics from the same local region. The acoustic analysis conducted on a range of consonant and vowel parameters displayed differences between the speech patterns of Broca’s aphasics and normal speakers. For example, impairments in voicing contrast between the voiced and voiceless stops were found in Broca’s aphasics. This feature does not exist for the fricatives produced by the Palestinian Broca’s aphasics and hence deviates from data obtained for aphasics’ speech from other languages. The Palestinian Broca’s aphasics displayed particular problems with the emphatic sounds. They exhibited deviant coarticulation patterns, another feature that is inconsistent with data obtained from studies from other languages. However, several other findings are in accordance with those reported from various other languages such as impairments in the VOT. The results are in accordance with the suggestions that speech production deficits in Broca’s aphasics are not related to phoneme selection but rather to articulatory implementation and some speech output impairments are related to timing and planning deficits.

Macrocyclic bisphosphonates for PET-diagnosis and endoradiotherapy of bone metastases

Die Fallzahlen von Prostata- und Brustkrebs nehmen aktuell die Spitzenplätze bei Krebserkrankungen weltweit ein. Eine schwerwiegende Folge dieser Erkrankung stellen Metastasierungen in das Knochengewebe dar, welche zu einer dramatischen Verschlechterung des Allgemeinzustandes und der Lebensqualität des Patienten führen. Die Symptome sind gekennzeichnet durch enorme Schmerzen in Kombination mit osteoblastischen und osteolytischen Knochenveränderungen, bis hin zu Frakturen und spinalen Kompressionssyndromen, sowie einer metabolischen Hypercalcaemie.rnBei der Diagnose und Therapie nehmen verschiedene Radiopharmaka eine Schlüsselrolle ein. Konjugate aus makrozyklischen Chelatoren und knochenaffinen Bisphosphonaten stellen ein geeignetes Mittel dar als so genannte Theranostika, die Diagnose und Therapie in einem Molekül vereinen. Hierbei konnten mit dem Generator basierenden PET-Nuklid 68Ga(III) und dem Therapienuklid 177Lu(III) erste Erfolge mit der Verbindung BPAMD am Patienten erzielt werden. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit ist es gelungen, die pharmakologischen Eigenschaften der BPAMD-Leitstruktur weiter zu optimieren und neue Derivate erfolgreich zu synthetisieren. Diese zeichneten sich durch eine erhöhte Knochenaffinität und eines besseren ´target to background´ Verhältnisses aus. Im Zuge der Derivatisierung ist es außerdem gelungen, erfolgreich eine Substanz darzustellen, welche über eine gesteigerte Blutretention verfügt und die letztendlich die Bioverfügbarkeit des Tracers erhöhte. Verbindungen solchen Typs können zu einem besseren Tumor zu gesundem Knochen Verhältnis beitragen und eventuell einen höheren Therapieerfolg erzielen. Eines dieser neuen vielversprechenden Bisphosphonate, [68Ga]NO2APBP konnte innerhalb einer klinischen Phase 0 bzw. I sein großes Potential als Diagnostikum zur Erfassung von Skelettmetastasen unter Beweis stellen. Innerhalb einer Testreihe mit 12 Patienten wurde eine hohe diagnostische Übereinstimmung mit dem Goldstandard 18F-Fluorid erreicht. In ausgesuchten Metastasen konnte sogar eine höhere Tracer-Aufnahme erzielt werden.rnIn Zukunft können makrozyklische Bisphosphonate eine wichtige Rolle bei der palliativen Schmerztherapie von Knochenmetastasen einnehmen. rn

Informationsstrukturen der protokollbasierten Medizin

Die protokollbasierte Medizin stellt einen interdisziplinären Brennpunkt der Informatik dar. Als besonderer Ausschnitt der medizinischen Teilgebiete erlaubt sie die relativ formale Spezifikation von Prozessen in den drei Bereichen der Prävention, Diagnose und Therapie.Letzterer wurde immer besonders fokussiert und gilt seit jeher im Rahmen klinischer Studien als Projektionsfläche für informationstechnologische Konzepte. Die Euphorie der frühen Jahre ernüchtert sich jedoch bei jeder Bilanz. Nur sehr wenige der unzählbaren Projekte haben ihre Routine in der alltäglichen Praxis gefunden. Die meisten Vorhaben sind an der Illusion der vollständigen Berechenbarkeit medizinischer Arbeitsabläufe gescheitert. Die traditionelle Sichtweise der klinischen Praxis beruht auf einer blockorientierten Vorstellung des Therapieausführungsprozesses. Sie entsteht durch seine Zerlegung in einzelne Therapiezweige, welche aus vordefinierten Blöcken zusammengesetzt sind. Diese können sequentiell oder parallel ausgeführt werden und sind selbst zusammengesetzt aus jeweils einer Menge von Elementen,welche die Aktivitäten der untersten Ebene darstellen. Das blockorientierte Aufbaumodell wird ergänzt durch ein regelorientiertes Ablaufmodell. Ein komplexes Regelwerk bestimmt Bedingungen für die zeitlichen und logischen Abhängigkeiten der Blöcke, deren Anordnung durch den Ausführungsprozeß gebildet wird. Die Modellierung der Therapieausführung steht zunächst vor der grundsätzlichen Frage, inwieweit die traditionelle Sichtweise für eine interne Repräsentation geeignet ist. Das übergeordnete Ziel besteht in der Integration der unterschiedlichen Ebenen der Therapiespezifikation. Dazu gehört nicht nur die strukturelle Komponente, sondern vorallem die Ablaufkomponente. Ein geeignetes Regelmodell ist erforderlich, welches den spezifischen Bedürfnissen der Therapieüberwachung gerecht wird. Die zentrale Aufgabe besteht darin, diese unterschiedlichen Ebenen zusammenzuführen. Eine sinnvolle Alternative zur traditionellen Sichtweise liefert das zustandsorientierte Modell des Therapieausführungsprozesses. Das zustandsorientierte Modell beruht auf der Sichtweise, daß der gesamte Therapieausführungsprozeß letztendlich eine lineare Folge von Zuständen beschreibt, wobei jeder Zustandsübergang durch ein Ereignis eingeleitet wird, an bestimmte Bedingungen geknüpft ist und bestimmte Aktionen auslösen kann. Die Parallelität des blockorientierten Modells tritt in den Hintergrund, denn die Menge der durchzuführenden Maßnahmen sind lediglich Eigenschaften der Zustände und keine strukturellen Elemente der Ablaufspezifikation. Zu jedem Zeitpunkt ist genau ein Zustand aktiv, und er repräsentiert eine von endlich vielen klinischen Situationen, mit all ihren spezifischen Aktivitäten und Ausführungsregeln. Die Vorteile des zustandsorientierten Modells liegen in der Integration. Die Grundstruktur verbindet die statische Darstellung der möglichen Phasenanordnungen mit der dynamischen Ausführung aktiver Regeln. Die ursprünglichen Inhalte des blockorientierten Modells werden als gewöhnliche Eigenschaften der Zustände reproduziert und stellen damit nur einen Spezialfall der zustandsbezogenen Sicht dar.Weitere Möglichkeiten für die Anreicherung der Zustände mit zusätzlichen Details sind denkbar wie sinnvoll. Die Grundstruktur bleibt bei jeder Erweiterung jedoch die gleiche. Es ergibt sich ein wiederverwendbares Grundgerüst,ein gemeinsamer Nenner für die Erfüllung der Überwachungsaufgabe.

Sensibilisierung hitzeevozierter Ionenströme an nozizeptiven Spinalganglienneuronen der Ratte

Die freien Endigungen von Spinalganglienneuronen sind für die Detektion schmerzhafter Reize verantwortlich. Dabei rufen thermische, chemische oder mechanische Reize Ionenströme über die Membran und dadurch Membranpotentialänderungen hervor. Diese noxisch induzierten Ströme sind in großem Ausmaß durch chemische Substanzen und andere Reize modulierbar. Der Ionenkanal TRPV1 ist für die Detektion zahlreicher chemischer Reize und zumindest eines Teils der noxischen Hitzereize verantwortlich. Im Rahmen dieser Arbeit wurden einige der Mechanismen geklärt, die zur schnellen Sensibilisierung hitzeevozierter Ionenströme führen. Hierfür wurden akut dissoziierte Spinalganglienneurone der Ratte als Modell ihrer peripheren Endigung verwendet und mittels Ganzzellableitung in der patch-clamp-Technik untersucht. Die Verwendung von Trypsin während der Präparation von Spinalganglienneuronen hat keinen funktionellen Einfluss auf hitze- oder capsaicininduzierte Ströme, verbessert aber die Untersuchungsbedingungen für das patch-clamp-Verfahren. Bei 144 akut dissoziierten Spinalganglienneuronen wurden die Stromantworten auf drei im Abstand von 40 s durch Überspülen mit 45,3 bis 46,3°C heißer Extrazellularlösung applizierte einsekündige Hitzereize gemessen. Dabei ließen sich repetitiv reproduzierbare hitzeinduzierte Einwärtsströme von etwa 160 pA erzielen; es konnte keine Tachyphylaxie und nahezu keine Inaktivierung beobachtet werden. Direkt vor dem zweiten Hitzereiz wurden die Neurone für zwei Sekunden mit Extrazellularlösung überspült, die Kontrolllösung, 0,5 μM Capsaicin, 10 μM Natriumnitroprussid oder 10 μM YC-1 enthielt. Es fand sich kein Hinweis, dass Stickstoffmonoxid oder die Guanylatzyklase einen signifikanten Beitrag zur Sensibilisierung von hitzeinduzierten Strömen in Spinalganglienneuronen leisten, wobei ein durch den Versuchsaufbau bedingtes Auswaschen zytosolischer Faktoren, die für den Signalweg notwendig sind, nicht ausgeschlossen werden kann. Bei einer Konzentration von 0,5 μM löst Capsaicin für zwei Sekunden einen sehr kleinen Einwärtsstrom von etwa 33 pA aus und führt innerhalb von zwei Sekunden zu einer schnell reversiblen Sensibilisierung von hitzeinduzierten Einwärtsströmen in Spinalganglienneuronen (p<0,01). Das Ausmaß der Sensibilisierung ist proportional zur Größe des capsaicininduzierten Stromes (r=−0,7, p<0,001). Konstant halten der intrazellulären Calciumkonzentration mittels des Calciumchelators BAPTA verhindert die capsaicininduzierte Sensibilisierung hitzeinduzierter Ströme an Spinalganglienneuronen. Demzufolge beruht die capsaicininduzierte Sensibilisierung trotz der schnellen Kinetik nicht auf einer synergistischen Wirkung der beiden Agonisten Capsaicin und Hitze auf ihren gemeinsamen Rezeptor; vielmehr ist sie von einer Erhöhung der intrazellulären freien Calciumkonzentration abhängig. Funktionelle Änderungen der zellulären Funktion werden häufig durch Proteinkinasen vermittelt. Die zur Gruppe der MAP-Kinasen gehörende ERK (extracellular signal related kinase) wird bei Membrandepolarisation und Calciumeinstrom in die Zelle durch MEK (MAPK/extracellular signal related kinase kinase) aktiviert. Blockade der MEK/ERK-Kaskade durch den spezifischen MEK-Hemmstoff U0126 führt ebenfalls zu einer Aufhebung der Sensibilisierung der Hitzeantworten durch Capsaicin. Applikation von Capsaicin führt innerhalb von zwei Sekunden zu einer schnell reversiblen Sensibilisierung hitzeevozierter Ionenströme an nozizeptiven Spinalganglienneuronen. Diese Sensibilisierung wird durch einen Calciumeinstrom in die Zelle und die dadurch eintretende Aktivierung von Proteinkinasen hervorgerufen. Die MEK/ERK-Kaskade ist ein sehr schnell (deutlich unter 2 s) aktivierbares intrazelluläres Signalsystem, welches bei der Regulation der Empfindlichkeit nozizeptiver Spinalganglienneurone eine entscheidende Rolle spielt; die schnelle Kinetik ist dabei nur durch eine membranständige oder zumindest membrannahe Lokalisation dieser Proteinkinasen erklärbar. Durch Applikation zehnsekündiger Hitzereize lässt sich ebenfalls eine Sensibilisierung hitzeevozierter Ionenströme auslösen, die ebenso ausgeprägt ist, wie die Sensibilisierung durch 0,5 μM Capsaicin (p<0,005). Durch das immer größere Verständnis der Funktionsweise des nozizeptiven Systems ergeben sich ständig neue Ansätze für die Entwicklung neuer Analgetika. So könnte durch Modulation spezifischer intrazellulärer Proteinkinasen der Phosphorylierungszustand und damit die Aktivierbarkeit von Ionenkanälen, die der Transduktion noxischer Reize dienen, positiv beeinflusst werden. Neuere, noch spezifischere Inhibitoren der MEK können der Forschung und später auch der Therapie neue Möglichkeiten eröffnen.

Neue 18 F-markierte Liganden zur Visualisierung des GABA A, alpha 5-Rezeptorstatus mittels PET

Die heutige Verfügbarkeit der molekularen Bildgebung ermöglicht einen signifikanten Einfluss auf die Diagnostik und die Therapiekontrolle von neurodegenerativen Erkrankungen, die unter anderem durch Fehlsteuerungen im GABAergen System auftreten können. Die Visualisierung und Quantifizierung des GABAA-alpha5-Subtyps durch PET könnte dabei zu einem besseren Verständnis von Erkrankungen wie Alzheimer und traumatischen Neurosen (emotionales Langzeitgedächtnis) beitragen. Ferner eröffnen GABAA/alpha5-subtypselektive Liganden die Möglichkeit, wesentliche Grundlagen der elementaren Vorgänge von Lernen und Erinnern zu untersuchen. 7,8,9,10-Tetrahydro-(7,10-ethan)-1,2,4-triazol[3,4-alpha]phthalazine stellen sich als vielverspre-chende Leitstrukturen zur Entwicklung neuer 18F-markierter alpha5-subtypselektiver GABAA-Rezeptorliganden für die PET dar. Um diese neuartigen Substanzen hinsichtlich ihrer Potenz als GABAA-alpha5-subtypselektive Radioliganden zu verifizieren, wurden zunächst die entsprechenden 19F-Derivate TC07-TC12 synthetisiert. Diese Referenzverbindungen wurden in Rezeptor-bindungsassays und in Autoradiographien mit [3H]Ro 15-4513 als zu verdrängender Radioligand evaluiert. In beiden Experimenten als auch in in vivo-Verdrängungsexperimenten an Ratten konnte eine hohe Affinität im nanomolaren Bereich als auch eine hohe Selektivität bezüglich der GABAA/alpha5-Untereinheit für einige der dargestellten Referenzverbindungen nachgewiesen werden. Gemäß diesen vielversprechenden Ergebnissen wurden verschiedene Markie-rungsvorläufer für eine 18F-Direktmarkierung der relevantesten Substanz TC07 in einer mehrstufigen organischen Synthese dargestellt. Die anschließende 18F-Markierung erfolgte über eine nukleophile Substitution mit [18F]Fluorid. Die Reaktionsparameter wurden hinsichtlich Reaktionstemperatur und dauer, Markierungsvorläuferkonzentration, Basenabhängigkeit und verschiedenen Markierungsmethoden optimiert. Daraus resultierend konnte [18F]TC07 mit bis zu 45 % radiochemischer Ausbeute erhalten werden. Die zerfallskorrigierte, gesamtradiochemische Ausbeute von nca [18F]TC07 in isotonischer NaCl-Lösung betrug 15 %. Basierend auf den bisher erhaltenen Ergebnissen wurde der Radioligand in in vitro-, ex vivo- und in vivo µPET-Experimenten evaluiert. Die zunächst durchgeführten in vitro-Experimente deuteten auf eine homogene Verteilung der Aktivität hin und zeigten keine spezifische Anreicherung. Diese Ergebnisse wurden sowohl in ex vivo- als auch in in vivo-µPET-Studien bestätigt. Auch hier konnte nur eine niedrige Aktivitätsanreicherung, eine homogene Verteilung im gesamten Gehirn und keine Übereinstimmung mit der bekannten GABAA/alpha5-Subtypverteilung gefunden werden. Eine im Anschluss durchgeführte Metabolismusstudie zeigte eine langsame Metabolisierungsrate des [18F]TC07 und auch eine Organverteilungsstudie zeigte keine außergewöhnlichen Anreicherungen. Aus den erhaltenen Ergebnissen kann geschlossen werden, dass der Radioligand [18F]TC07 kein geeigneter Tracer zur in vivo-Visualisierung der alpha5-Untereinheit des GABAA-Rezeptors ist.

Patient-Therapeut-Bindung bei Drogenabhängigen: Instrumentenvalidierung und Therapieevaluation

In der vorliegenden Arbeit wird zum einen ein Instrument zur Erfassung der Patient-Therapeut-Bindung validiert (Client Attachment to Therapist Scale, CATS; Mallinckrodt, Coble & Gantt, 1995), zum anderen werden Hypothesen zu den Zusammenhängen zwischen Selbstwirksamkeitserwartung, allgemeinem Bindungsstil, therapeutischer Beziehung (bzw. Therapiezufriedenheit), Patient-Therapeut-Bindung und Therapieerfolg bei Drogen-abhängigen in stationärer Postakutbehandlung überprüft. In die Instrumentenvalidierung (einwöchiger Retest) wurden 119 Patienten aus 2 Kliniken und 13 Experten einbezogen. Die Gütekriterien des Instrumentes fallen sehr zufriedenstellend aus. An der naturalistischen Therapieevaluationsstudie (Prä-, Prozess-, Post-Messung: T0, T1, T2) nahmen 365 Patienten und 27 Therapeuten aus 4 Kliniken teil. Insgesamt beendeten 44,1% der Patienten ihren stationären Aufenthalt planmäßig. Auf Patientenseite erweisen sich Alter und Hauptdiagnose, auf Therapeutenseite die praktizierte Therapierichtung als Therapieerfolgsprädiktoren. Selbstwirksamkeitserwartung, allgemeiner Bindungsstil, Patient-Therapeut-Bindung und Therapiezufriedenheit eignen sich nicht zur Prognose des Therapieerfolgs. Die zu T0 stark unterdurchschnittlich ausgeprägte Selbstwirksamkeits-erwartung steigert sich über den Interventionszeitraum, wobei sich ein Moderatoreffekt der Patient-Therapeut-Bindung beobachten lässt. Es liegt eine hohe Prävalenz unsicherer allgemeiner Bindungsstile vor, welche sich über den Therapiezeitraum nicht verändern. Die patientenseitige Zufriedenheit mit der Therapie steigt von T1 zu T2 an. Die Interrater-Konkordanz (Patient/Therapeut) zur Einschätzung der Patient-Therapeut-Bindung erhöht sich leicht von T1 zu T2. Im Gegensatz dazu wird die Therapiezufriedenheit von Patienten und Therapeuten zu beiden Messzeitpunkten sehr unterschiedlich beurteilt. Die guten Testgütekriterien der CATS sprechen für eine Überlegenheit dieses Instrumentes gegenüber der Skala zur Erfassung der Therapiezufriedenheit. Deshalb sollte die Patient-Therapeut-Bindung anhand dieses Instrumentes in weiteren Forschungsarbeiten an anderen Patientenkollektiven untersucht werden, um generalisierbare Aussagen zur Validität treffen zu können.

Untersuchungen über ADAMTS13 in Gerinnungsfaktorpräparaten

Zusammenfassung rnIn der vorliegenden Arbeit wurden sechs VWF/FVIII Gerinnungsfaktorkonzentrate unterschiedlicher Chargen auf ihre ADAMTS13 Aktivität, Antigen und VWF Multimere untersucht. Grund dafür ist die Annahme, dass bei der Aufkonzentrierung des VWFs möglicherweise auch erhöhte Mengen an ADAMTS13 vorhanden sind. Wäre dies nachweisbar, könnten die entsprechenden Konzentrate auch Anwendung bei TTP Patienten finden. Neben den Gerinnungsfaktorkonzentraten wurden ebenfalls die zur Plasmapherese verwendeten Therapeutika FFP und s/d Plasma analysiert. Es soll getestet werden, ob Unterschiede hinsichtlich der Qualität zwischen den Präparaten bestehen und inwiefern die Blutgruppen eine Auswirkung auf die ADAMTS13 Aktivität/Antigen haben. Überdies wurde die Bedeutung von ADAMTS13 als wichtiges diagnostisches Merkmal im Rahmen der Gegenüberstellung von Patienten mit thrombotischen Mikroangiopathien erörtert. Alle angewandten Methoden wurden zudem kritisch miteinander verglichen und auf ihre Eignung für die klinische Diagnostik getestet. Zur Untersuchung der ADAMTS13 Aktivität kamen drei unterschiedliche Methoden zur Anwendung, die BCS-Methode nach Böhm und zwei FRET Kits (Technozym®ADAMTS13/ActifluorTMADAMTS13). Für die Bestimmung des ADAMTS13 Antigen wurde das Technozym®ADAMTS13 Kit verwendete als auch der Imubind®ELISA angewendet. Mittels der SDS-Gelelektrophorese konnten die VWF Multimere dargestellt werden. Die Untersuchungen konnten zeigen, dass nur in Haemate®P, deutlich höhere ADAMTS13 Aktivitäten (12,3% bzw. 470ng/ml) sowie ein physiologische Antigenwerte vorlagen. Die anderen Faktorkonzentrate wiesen entweder nur sehr geringe bzw. keine Aktivitäten auf. Das Antigen lag bei allen Konzentraten im nachweisbaren Bereich. Folglich ist ein Einsatz von Haemate®P bei der Therapie der TTP, insbesondere bei hereditären Formen sowie bei Kindern, die durch eine Plasmapherese stark belastet werden, und bei Schwangeren, könnten, in Erwägung zu ziehen und innerhalb der Klinik zu testen. Die Plasmapräparate FFP und Octaplas® wiesen in allen Untersuchungen ADAMTS13 Aktivitäten und Antigen im mittleren bis hohen physiologischen Bereich auf. Insbesondere bei Blutgruppe 0 ließ sich beiden Präparaten eine höhere ADAMTS13 Aktivität und Antigen gegenüber den drei anderen Blutgruppen darstellen. Insgesamt waren die interindividuellen Schwankungen bei FFP deutlich höher als bei Octaplas®, was sich in der unterschiedlichen Herstellung der Präparate begründen lässt. Octaplas® ist also genauso geeignet zur Plasmapherese bei der TTP wie FFP, kann jedoch aufgrund seiner intensiveren Virusinaktivierung eine größere Sicherheit aufweisen und stellt sich auch in der Klinik als nebenwirkungsärmer dar. Bei der Gegenüberstellung der thrombotischen Mikroangiopathien konnte gezeigt werden, dass eine verminderte ADAMTS13 Aktivität ein wichtiges Unterscheidungsmerkmal ist und auch während der Remission schon diagnostizierbar werden kann. Auf der Grundlage der labordiagnostischen Werte und dem klinischen Erscheinungsbild im akuten Schub und in der Remission konnte ein diagnostischer Algorithmus für den klinischen Alltag erstellt werden. In der Methodenvalidierung erwies sich der ActifluorTMADAMTS13 Kit als der beste Kit, da er innerhalb kürzester Zeit zuverlässige Werte in Standardeinheiten liefert. Nach neuesten Erkenntnissen, bei der eine Unterscheidung von ADAMTS13 Aktivitäten über und unter 5 % von großer prognostischer Bedeutung sind, ist die BCS-Methode nach Böhm mit einer unteren Nachweisgrenze von 6,2% zu ungenau und auch hinsichtlich ihres Zeitaufwandes eher ungünstig.rn

Glykolytische Aktivität von Ovarialkarzinomzelllinien in vitro und in vivo und die Bedeutung von HIF-1alpha

Ovarialkarzinome stellen eine schwer zu therapierende onkologische Erkrankung mit im Durchschnitt sehr schlechter Prognose dar. Die Notwendigkeit einer weiteren Verbesserung der Therapie dieser Erkrankung ist sehr offensichtlich. Studien an anderen Tumorentitäten haben die große Bedeutung des Glukosestoffwechsels, speziell des Laktats, in der Erken- nung, Kategorisierung und Therapie von onkologischen Erkrankungen gezeigt. In der Kon- trolle des Glukosestoffwechsels, aber auch vieler anderer Funktionen, wie z. B. des Tumor- wachstums und des Zellüberlebens, hat sich der Hypoxia Inducible Factor (HIF) als beson- ders wichtig herausgestellt. In der vorliegenden Arbeit wurde daher der Glukosestoffwechsel in Ovarialkarzinomen und seine Beeinflussung durch eine Herunterregulierung von HIF-1α untersucht. Hierzu wurden die Ovarialkarzinomzelllinien OC 316 und IGROV1 (Wildtyp) und die Zelllinie OC 316 mit einem lentiviralen Vektor zur Herunterregulierung von HIF-1α ver- wendet. Das Wachstumsverhalten, die Laktatproduktion und der Glukoseverbrauch wurden bei diesen Zelllinien in vitro untersucht. Darüber hinaus wurden mithilfe der bildgebenden Biolumineszenz ATP, Laktat, Pyruvat und Glukose in Xenotransplantaten dieser Zelllinien gemessen. Diese in unserer Arbeitsgruppe entwickelte Methode erlaubt die quantitative Er- fassung von Metaboliten in selektiven Gewebsarealen, wie z. B. in vitalen Tumorregionen, in stomatösen Arealen oder im tumornahen Normalgewebe.rnIn dieser Arbeit kann gezeigt werden, dass die glykolytische Aktivität von Ovarialkarzinom- zelllinien mit dem Wachstumsverhalten positiv korreliert ist. Eine Herunterregulierung von HIF-1α führt zu einer deutlichen Verlangsamung des Zellwachstums, wobei allerdings alle HIF-Zielgene betroffen sein können. Des Weiteren wird mit den hier gezeigten Daten die prognostische Bedeutung des Laktats bestätigt. Hohe Laktatwerte in vitro waren mit schnel- lerem Wachstum korreliert. Zusätzlich zeigen die vorliegenden Daten, dass die gewonnenen Befunde in vitro nur näherungsweise auf die in vivo Situation übertragbar sind. Eine Herun- terregulierung von HIF-1α zeigt keine signifikant unterschiedlichen Laktatwerte in den Xe- notransplantaten. Allerdings spiegeln sich zelllinienspezifische Unterschiede in der metabo- lischen Aktivität in vitro im metabolischen Verhalten der entsprechenden Xenografttumoren recht gut wider.rnDie gewonnenen Ergebnisse weisen zum einen auf die prognostische Bedeutung einer Bestimmung von Laktatkonzentrationen aus Tumorbiopsien hin und bestätigen zum anderen die klinische Aussagekraft metabolischer Aktivitätsmessungen mittels PET. Solche Daten könnten dazu dienen Patienten einer individualisierten Therapie zuzuführen. Außerdem wur- de die Effektivität, aber auch die Komplexität einer gegen HIF-1α gerichteten Therapie auf Protein- und Genebene bestätigt. Somit zeigen die erzielten Resultate einerseits Möglichkei- ten einer individualisierten Therapie auf, andererseits unterstreichen sie die große Notwen- digkeit weiterer Grundlagenforschung auf diesem Gebiet.

Bisphosphonat-assoziierte Osteonekrose der Kiefer : In-vitro-Untersuchungen zur Pathologie und zu möglichen Therapieansätzen

Die Bisphosphonat-assoziierte Osteonekrose der Kiefer (BP-ONJ) stellt eine ernstzunehmende Nebenwirkung der Therapie mit stickstoffhaltigen Bisphosphonaten (N-BP) dar, deren Ätiologie bisher noch nicht vollständig geklärt ist. Da entzündliche Prozesse eine wichtige Rolle zu spielen scheinen, wurde der Einfluss verschiedener Bisphosphonate auf die Mechanismen der granulozytären Erregerabwehr untersucht. Die N-BP Ibandronat, Pamidronat und Zoledronat steigerten die Phagozytose und den oxidativen Burst signifikant. Die fMLP-stimulierte Chemotaxis wurde durch Ibandronat und Zoledronat signifikant reduziert. Das stickstofffreie Clodronat zeigte keinen Effekt auf die getesteten Abwehrmechanismen. Auf der Suche nach therapeutischen Optionen gegen die BP-ONJ wurden die Isoprenoide Farnesol, Geranylgeraniol, Eugenol, Menthol, Limonene und Squalene auf deren Fähigkeit untersucht, die schädigenden Effekte Zoledronats auf verschiedene Zelllinien zu antagonisieren. Geranylgeraniol zeigte als einzige Verbindung eine protektive Wirkung auf gingivale Fibroblasten, Endothelzellen und Osteoblasten. Desweiteren kam es unter Zoledronat zum Anstieg der kleinen GTPasen RhoA und RhoB in gingivalen Fibroblasten. Auch der Gehalt an GTP-gebundenem RhoA stieg nach Zoledronat-Inkubation. Der Einfluss des N-BPs ließ sich auch auf Proteinebene durch Geranylgeraniol antagonisieren und nicht durch Farnesol. Die Tatsache, dass N-BP die granulozytäre Abwehr beeinflussen, unterstützt die Bedeutung keimreduzierender Maßnahmen im Rahmen der Nekroseprophylaxe und -therapie. Außerdem untermauern die Ergebnisse der Arbeit das Potential Geranylgeraniols als neue therapeutische Option.

Synthese und Evaluierung von (Radio)Liganden für den Free Fatty Acid Rezeptor 1

Der Free Fatty Acid Receptor 1 (FFAR1) ist ein G-Protein gekoppelter Rezeptor, welcher neben einer hohen Expression im Gehirn auch eine verstärkte Expressionsrate auf den β-Zellen des Pankreas aufweist. Diese Expressionsmuster machen ihn zu einem idealen Target für die Visualisierung der sogenannten β-Zell-Masse mittels molekularer bildgebender Verfahren wie der PET. Eine Entwicklung geeigneter Radiotracer für die β-Zell-Bildgebung würde sowohl für die Diagnostik als auch für die Therapie von Typ-1- und Typ-2-Diabetes ein wertvolles Hilfsmittel darstellen.rnAufbauend auf einem von Sasaki et al. publiziertem Agonisten mit einem vielversprechendem EC50-Wert von 5,7 nM wurden dieser Agonist und zwei weitere darauf basierende 19F-substituierte Moleküle als Referenzverbindungen synthetisiert (DZ 1-3). Für die 18F-Markierung der Moleküle DZ 2 und DZ 3 wurden die entsprechenden Markierungsvorläufer (MV 1-3) synthetisiert und anschließend die Reaktionsparameter hinsichtlich Temperatur, Lösungsmittel, Basensystem und Reaktionszeit für die nukleophile n.c.a. 18F-Fluorierung optimiert. Die abschließende Entschützung zum fertigen Radiotracer wurde mit NaOH-Lösung durchgeführt und die Tracer injektionsfertig in isotonischer NaCl-Lösung mit radiochemischen Ausbeuten von 26,9 % ([18F]DZ 2) und 39 % ([18F]DZ 3) erhalten.rnZusätzlich wurde ein Chelator zur 68Ga-Markierung an den Liganden gekoppelt (Verb. 46) und die Markierungsparameter optimiert. Nach erfolgter Markierung mit 95 % radiochemischer Ausbeute, wurde der Tracer abgetrennt und in vitro Stabilitätsstudien durchgeführt. Diese zeigten eine Stabilität von mehr als 90 % über 120 min in sowohl humanem Serum (37 °C) als auch isotonischer NaCl-Lösung.rnMit einem ebenfalls synthetisierten fluoreszenzmarkierten Derivat des Liganden (Verb. 43) wurden erste LSM-Bilder an sowohl Langerhansschen Inseln als auch FFAR1-tragenden RIN-M Zellen durchgeführt, welche einen vielversprechenden Uptake des neuen Liganden in die Zellen zeigen. Weitere Untersuchungen und biologische Evaluierungen stehen noch aus. Mit den Referenzsubstanzen wurden zusätzlich Vitalitätsstudien an Langerhansschen Inseln durchgeführt, um einen negativen toxischen Einfluss auszuschließen.rn

Individualisierte Krebstherapie : präklinischer „proof of concept“ einer mutationsspezifischen Immuntherapie

Da nicht-synonyme tumorspezifische Punktmutationen nur in malignen Geweben vorkommen und das veränderte Proteinprodukt vom Immunsystem als „fremd“ erkannt werden kann, stellen diese einen bisher ungenutzten Pool von Zielstrukturen für die Immuntherapie dar. Menschliche Tumore können individuell bis zu tausenden nicht-synonymer Punktmutationen in ihrem Genom tragen, welche nicht der zentralen Immuntoleranz unterliegen. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Hypothese zu untersuchen, dass das Immunsystem in der Lage sein sollte, mutierte Epitope auf Tumorzellen zu erkennen und zu klären, ob auf dieser Basis eine wirksame mRNA (RNA) basierte anti-tumorale Vakzinierung etabliert werden kann. Hierzu wurde von Ugur Sahin und Kollegen, das gesamte Genom des murinen B16-F10 Melanoms sequenziert und bioinformatisch analysiert. Im Rahmen der NGS Sequenzierung wurden mehr als 500 nicht-synonyme Punktmutationen identifiziert, von welchen 50 Mutationen selektiert und durch Sanger Sequenzierung validiert wurden. rnNach der Etablierung des immunologischen Testsysteme war eine Hauptfragestellung dieser Arbeit, die selektierten nicht-synonyme Punktmutationen in einem in vivo Ansatz systematisch auf Antigenität zu testen. Für diese Studien wurden mutierte Sequenzen in einer Länge von 27 Aminosäuren genutzt, in denen die mutierte Aminosäure zentral positioniert war. Durch die Länge der Peptide können prinzipiell alle möglichen MHC Klasse-I und -II Epitope abgedeckt werden, welche die Mutation enthalten. Eine Grundidee des Projektes Ansatzes ist es, einen auf in vitro transkribierter RNA basierten oligotopen Impfstoff zu entwickeln. Daher wurden die Impfungen naiver Mäuse sowohl mit langen Peptiden, als auch in einem unabhängigen Ansatz mit peptidkodierender RNA durchgeführt. Die Immunphänotypisierung der Impfstoff induzierten T-Zellen zeigte, dass insgesamt 16 der 50 (32%) mutierten Sequenzen eine T-Zellreaktivität induzierten. rnDie Verwendung der vorhergesagten Epitope in therapeutischen Vakzinierungsstudien bestätigten die Hypothese das mutierte Neo-Epitope potente Zielstrukturen einer anti-tumoralen Impftherapie darstellen können. So wurde in therapeutischen Tumorstudien gezeigt, dass auf Basis von RNA 9 von 12 bestätigten Epitopen einen anti-tumoralen Effekt zeigte.rnÜberaschenderweise wurde bei einem MHC Klasse-II restringierten mutiertem Epitop (Mut-30) sowohl in einem subkutanen, als auch in einem unabhängigen therapeutischen Lungenmetastasen Modell ein starker anti-tumoraler Effekt auf B16-F10 beobachtet, der dieses Epitop als neues immundominantes Epitop für das B16-F10 Melanom etabliert. Um den immunologischen Mechanismus hinter diesem Effekt näher zu untersuchen wurde in verschieden Experimenten die Rolle von CD4+, CD8+ sowie NK-Zellen zu verschieden Zeitpunkten der Tumorentwicklung untersucht. Die Analyse des Tumorgewebes ergab, eine signifikante erhöhte Frequenz von NK-Zellen in den mit Mut-30 RNA vakzinierten Tieren. Das NK Zellen in der frühen Phase der Therapie eine entscheidende Rolle spielen wurde anhand von Depletionsstudien bestätigt. Daran anschließend wurde gezeigt, dass im fortgeschrittenen Tumorstadium die NK Zellen keinen weiteren relevanten Beitrag zum anti-tumoralen Effekt der RNA Vakzinierung leisten, sondern die Vakzine induzierte adaptive Immunantwort. Durch die Isolierung von Lymphozyten aus dem Tumorgewebe und deren Einsatz als Effektorzellen im IFN-γ ELISPOT wurde nachgewiesen, dass Mut-30 spezifische T-Zellen das Tumorgewebe infiltrieren und dort u.a. IFN-γ sekretieren. Dass diese spezifische IFN-γ Ausschüttung für den beobachteten antitumoralen Effekt eine zentrale Rolle einnimmt wurde unter der Verwendung von IFN-γ -/- K.O. Mäusen bestätigt.rnDas Konzept der individuellen RNA basierten mutationsspezifischen Vakzine sieht vor, nicht nur mit einem mutations-spezifischen Epitop, sondern mit mehreren RNA-kodierten Mutationen Patienten zu impfen um der Entstehung von „escape“-Mutanten entgegenzuwirken. Da es nur Erfahrung mit der Herstellung und Verabreichung von Monotop-RNA gab, also RNA die für ein Epitop kodiert, war eine wichtige Fragestellungen, inwieweit Oligotope, welche die mutierten Sequenzen sequentiell durch Linker verbunden als Fusionsprotein kodieren, Immunantworten induzieren können. Hierzu wurden Pentatope mit variierender Position des einzelnen Epitopes hinsichtlich ihrer in vivo induzierten T-Zellreaktivitäten charakterisiert. Die Experimente zeigten, dass es möglich ist, unabhängig von der Position im Pentatop eine Immunantwort gegen ein Epitop zu induzieren. Des weiteren wurde beobachtet, dass die induzierten T-Zellfrequenzen nach Pentatop Vakzinierung im Vergleich zur Nutzung von Monotopen signifikant gesteigert werden kann.rnZusammenfassend wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit präklinisch erstmalig nachgewiesen, dass nicht-synonyme Mutationen eine numerisch relevante Quelle von Zielstrukturen für die anti-tumorale Immuntherapie darstellen. Überraschenderweise zeigte sich eine dominante Induktion MHC-II restringierter Immunantworten, welche partiell in der Lage waren massive Tumorabstoßungsreaktionen zu induzieren. Im Sinne einer Translation der gewonnenen Erkenntnisse wurde ein RNA basiertes Oligotop-Format etabliert, welches Eingang in die klinische Testung des Konzeptes fand.rn