Assembly and characterization of supramolecular architectures for biosensor applications

The research has included the efforts in designing, assembling and structurally and functionally characterizing supramolecular biofunctional architectures for optical biosensing applications. In the first part of the study, a class of interfaces based on the biotin-NeutrAvidin binding matrix for the quantitative control of enzyme surface coverage and activity was developed. Genetically modified ß-lactamase was chosen as a model enzyme and attached to five different types of NeutrAvidin-functionalized chip surfaces through a biotinylated spacer. All matrices are suitable for achieving a controlled enzyme surface density. Data obtained by SPR are in excellent agreement with those derived from optical waveguide measurements. Among the various protein-binding strategies investigated in this study, it was found that stiffness and order between alkanethiol-based SAMs and PEGylated surfaces are very important. Matrix D based on a Nb2O5 coating showed a satisfactory regeneration possibility. The surface-immobilized enzymes were found to be stable and sufficiently active enough for a catalytic activity assay. Many factors, such as the steric crowding effect of surface-attached enzymes, the electrostatic interaction between the negatively charged substrate (Nitrocefin) and the polycationic PLL-g-PEG/PEG-Biotin polymer, mass transport effect, and enzyme orientation, are shown to influence the kinetic parameters of catalytic analysis. Furthermore, a home-built Surface Plasmon Resonance Spectrometer of SPR and a commercial miniature Fiber Optic Absorbance Spectrometer (FOAS), served as a combination set-up for affinity and catalytic biosensor, respectively. The parallel measurements offer the opportunity of on-line activity detection of surface attached enzymes. The immobilized enzyme does not have to be in contact with the catalytic biosensor. The SPR chip can easily be cleaned and used for recycling. Additionally, with regard to the application of FOAS, the integrated SPR technique allows for the quantitative control of the surface density of the enzyme, which is highly relevant for the enzymatic activity. Finally, the miniaturized portable FOAS devices can easily be combined as an add-on device with many other in situ interfacial detection techniques, such as optical waveguide lightmode spectroscopy (OWLS), the quartz crystal microbalance (QCM) measurements, or impedance spectroscopy (IS). Surface plasmon field-enhanced fluorescence spectroscopy (SPFS) allows for an absolute determination of intrinsic rate constants describing the true parameters that control interfacial hybridization. Thus it also allows for a study of the difference of the surface coupling influences between OMCVD gold particles and planar metal films presented in the second part. The multilayer growth process was found to proceed similarly to the way it occurs on planar metal substrates. In contrast to planar bulk metal surfaces, metal colloids exhibit a narrow UV-vis absorption band. This absorption band is observed if the incident photon frequency is resonant with the collective oscillation of the conduction electrons and is known as the localized surface plasmon resonance (LSPR). LSPR excitation results in extremely large molar extinction coefficients, which are due to a combination of both absorption and scattering. When considering metal-enhanced fluorescence we expect the absorption to cause quenching and the scattering to cause enhancement. Our further study will focus on the developing of a detection platform with larger gold particles, which will display a dominant scattering component and enhance the fluorescence signal. Furthermore, the results of sequence-specific detection of DNA hybridization based on OMCVD gold particles provide an excellent application potential for this kind of cheap, simple, and mild preparation protocol applied in this gold fabrication method. In the final chapter, SPFS was used for the in-depth characterizations of the conformational changes of commercial carboxymethyl dextran (CMD) substrate induced by pH and ionic strength variations were studied using surface plasmon resonance spectroscopy. The pH response of CMD is due to the changes in the electrostatics of the system between its protonated and deprotonated forms, while the ionic strength response is attributed from the charge screening effect of the cations that shield the charge of the carboxyl groups and prevent an efficient electrostatic repulsion. Additional studies were performed using SPFS with the aim of fluorophore labeling the carboxymethyl groups. CMD matrices showed typical pH and ionic strength responses, such as high pH and low ionic strength swelling. Furthermore, the effects of the surface charge and the crosslink density of the CMD matrix on the extent of stimuli responses were investigated. The swelling/collapse ratio decreased with decreasing surface concentration of the carboxyl groups and increasing crosslink density. The study of the CMD responses to external and internal variables will provide valuable background information for practical applications.

Structuring of polymer surface by evaporation of sessile microdrops

In this thesis, we investigated the evaporation of sessile microdroplets on different solid substrates. Three major aspects were studied: the influence of surface hydrophilicity and heterogeneity on the evaporation dynamics for an insoluble solid substrate, the influence of external process parameters and intrinsic material properties on microstructuring of soluble polymer substrates and the influence of an increased area to volume ratio in a microfluidic capillary, when evaporation is hindered. In the first part, the evaporation dynamics of pure sessile water drops on smooth self-assembled monolayers (SAMs) of thiols or disulfides on gold on mica was studied. With increasing surface hydrophilicity the drop stayed pinned longer. Thus, the total evaporation time of a given initial drop volume was shorter, since the drop surface, through which the evaporation occurs, stays longer large. Usually, for a single drop the volume decreased linearly with t1.5, t being the evaporation time, for a diffusion-controlled evaporation process. However, when we measured the total evaporation time, ttot, for multiple droplets with different initial volumes, V0, we found a scaling of the form V0 = attotb. The more hydrophilic the substrate was, the more showed the scaling exponent a tendency to an increased value up to 1.6. This can be attributed to an increasing evaporation rate through a thin water layer in the vicinity of the drop. Under the assumption of a constant temperature at the substrate surface a cooling of the droplet and thus a decreased evaporation rate could be excluded as a reason for the different scaling exponent by simulations performed by F. Schönfeld at the IMM, Mainz. In contrast, for a hairy surface, made of dialkyldisulfide SAMs with different chain lengths and a 1:1 mixture of hydrophilic and hydrophobic end groups (hydroxy versus methyl group), the scaling exponent was found to be ~ 1.4. It increased to ~ 1.5 with increasing hydrophilicity. A reason for this observation can only be speculated: in the case of longer hydrophobic alkyl chains the formation of an air layer between substrate and surface might be favorable. Thus, the heat transport to the substrate might be reduced, leading to a stronger cooling and thus decreased evaporation rate. In the second part, the microstructuring of polystyrene surfaces by drops of toluene, a good solvent, was investigated. For this a novel deposition technique was developed, with which the drop can be deposited with a syringe. The polymer substrate is lying on a motorized table, which picks up the pendant drop by an upward motion until a liquid bridge is formed. A consecutive downward motion of the table after a variable delay, i.e. the contact time between drop and polymer, leads to the deposition of the droplet, which can evaporate. The resulting microstructure is investigated in dependence of the processes parameters, i.e. the approach and the retraction speed of the substrate and the delay between them, and in dependence of the intrinsic material properties, i.e. the molar mass and the type of the polymer/solvent system. The principal equivalence with the microstructuring by the ink-jet technique was demonstrated. For a high approach and retraction speed of 9 mm/s and no delay between them, a concave microtopology was observed. In agreement with the literature, this can be explained by a flow of solvent and the dissolved polymer to the rim of the pinned droplet, where polymer is accumulated. This effect is analogue to the well-known formation of ring-like stains after the evaporation of coffee drops (coffee-stain effect). With decreasing retraction speed down to 10 µm/s the resulting surface topology changes from concave to convex. This can be explained with the increasing dissolution of polymer into the solvent drop prior to the evaporation. If the polymer concentration is high enough, gelation occurs instead of a flow to the rim and the shape of the convex droplet is received. With increasing delay time from below 0 ms to 1s the depth of the concave microwells decreases from 4.6 µm to 3.2 µm. However, a convex surface topology could not be obtained, since for longer delay times the polymer sticks to the tip of the syringe. Thus, by changing the delay time a fine-tuning of the concave structure is accomplished, while by changing the retraction speed a principal change of the microtopolgy can be achieved. We attribute this to an additional flow inside the liquid bridge, which enhanced polymer dissolution. Even if the pendant drop is evaporating about 30 µm above the polymer surface without any contact (non-contact mode), concave structures were observed. Rim heights as high as 33 µm could be generated for exposure times of 20 min. The concave structure exclusively lay above the flat polymer surface outside the structure even after drying. This shows that toluene is taken up permanently. The increasing rim height, rh, with increasing exposure time to the solvent vapor obeys a diffusion law of rh = rh0  tn, with n in the range of 0.46 ~ 0.65. This hints at a non-Fickian swelling process. A detailed analysis showed that the rim height of the concave structure is modulated, unlike for the drop deposition. This is due to the local stress relaxation, which was initiated by the increasing toluene concentration in the extruded polymer surface. By altering the intrinsic material parameters i.e. the polymer molar mass and the polymer/solvent combination, several types of microstructures could be formed. With increasing molar mass from 20.9 kDa to 1.44 MDa the resulting microstructure changed from convex, to a structure with a dimple in the center, to concave, to finally an irregular structure. This observation can be explained if one assumes that the microstructuring is dominated by two opposing effects, a decreasing solubility with increasing polymer molar mass, but an increasing surface tension gradient leading to instabilities of Marangoni-type. Thus, a polymer with a low molar mass close or below the entanglement limit is subject to a high dissolution rate, which leads to fast gelation compared to the evaporation rate. This way a coffee-rim like effect is eliminated early and a convex structure results. For high molar masses the low dissolution rate and the low polymer diffusion might lead to increased surface tension gradients and a typical local pile-up of polymer is found. For intermediate polymer masses around 200 kDa, the dissolution and evaporation rate are comparable and the typical concave microtopology is found. This interpretation was supported by a quantitative estimation of the diffusion coefficient and the evaporation rate. For a different polymer/solvent system, polyethylmethacrylate (PEMA)/ethylacetate (EA), exclusively concave structures were found. Following the statements above this can be interpreted with a lower dissolution rate. At low molar masses the concentration of PEMA in EA most likely never reaches the gelation point. Thus, a concave instead of a convex structure occurs. At the end of this section, the optically properties of such microstructures for a potential application as microlenses are studied with laser scanning confocal microscopy. In the third part, the droplet was confined into a glass microcapillary to avoid evaporation. Since here, due to an increased area to volume ratio, the surface properties of the liquid and the solid walls became important, the influence of the surface hydrophilicity of the wall on the interfacial tension between two immiscible liquid slugs was investigated. For this a novel method for measuring the interfacial tension between the two liquids within the capillary was developed. This technique was demonstrated by measuring the interfacial tensions between slugs of pure water and standard solvents. For toluene, n-hexane and chloroform 36.2, 50.9 and 34.2 mN/m were measured at 20°C, which is in a good agreement with data from the literature. For a slug of hexane in contact with a slug of pure water containing ethanol in a concentration range between 0 and 70 (v/v %), a difference of up to 6 mN/m was found, when compared to commercial ring tensiometry. This discrepancy is still under debate.

Proton-conducting copolymers, blends and composites with phosphonic acid as protogenic group

ABSTRACT: In this work, proton conducting copolymers, polymer blends and composites containing phosphonic acid groups have been prepared. Proton conduction mechanisms in these materials are discussed respectively in both, the anhydrous and humidified state. Atom transfer radical copolymerization (ATRCP) of diisopropyl-p-vinylbenzyl phosphonate (DIPVBP) and 4-vinyl pyridine (4VP) is studied for the first time in this work. The kinetic parameters are obtained by using the 1H-NMR online technique. Proton conduction in poly(vinylbenzyl phosphonic acid) (PVBPA) homopolymer and its statistical copolymers with 4-vinyl pyridine (poly(VBPA-stat-4VP)s) are comprehensively studied in both, the “dry” and “wet” state. Effects of temperature, water content and polymer composition on proton conductivities are studied and proton transport mechanisms under various conditions are discussed. The proton conductivity of the polymers is in the range of 10-6-10-8 S/cm in nominally dry state at 150 oC. However, proton conductivity of the polymers increases rapidly with water content in the polymers which can reach 10-2 S/cm at the water uptake of 25% in the polymers. The highest proton conductivity obtained from the polymers can even reach 0.3 S/cm which was measured at 85oC with 80% relative humidity in the measuring atmosphere. Poly(4-vinyl pyridine) was grafted from the surface of SiO2 nanoparticles using ATRP in this work for the first time. Following this approach, silica nanoparticles with a shell of polymeric layer are used as basic particles in a polymeric acidic matrix. The proton conductivities of the composites are studied under both, humidified and dry conditions. In dry state, the conductivity of the composites is in the range of 10-10~10-4 S/cm at 150 oC. While in humid state, the composites show much higher proton conductivity. The highest proton conductivity obtained with the composites is 0.5 S/cm measured at 85oC with 80% relative humidity in the measuring atmosphere. The miscibility of poly (vinyl phosphonic acid) and PEO is studied for the first time in this work and a phase diagram is plotted based on a DSC study and optical microscopy. With this knowledge, homogeneous PVPA/PEO mixtures are prepared as proton-conducting polymer blends. The mobility of phosphonic acid groups and PEO in the blends is determined by 1H-MAS-NMR in temperature dependent measurements. The effect of composition and the role of PEO on proton conduction are discussed.

Biochemical analysis of the phosphatase domain of the human soluble epoxide hydrolase (sEH)

Die lösliche Epoxidhydrolase (sEH) gehört zur Familie der Epoxidhydrolase-Enzyme. Die Rolle der sEH besteht klassischerweise in der Detoxifikation, durch Umwandlung potenziell schädlicher Epoxide in deren unschädliche Diol-Form. Hauptsächlich setzt die sEH endogene, der Arachidonsäure verwandte Signalmoleküle, wie beispielsweise die Epoxyeicosatrienoic acid, zu den entsprechenden Diolen um. Daher könnte die sEH als ein Zielenzym in der Therapie von Bluthochdruck und Entzündungen sowie diverser anderer Erkrankungen eingesetzt werden. rnDie sEH ist ein Homodimer, in dem jede Untereinheit aus zwei Domänen aufgebaut ist. Das katalytische Zentrum der Epoxidhydrolaseaktivität befindet sich in der 35 kD großen C-terminalen Domäne. Dieser Bereich der sEH s wurde bereits im Detail untersucht und nahezu alle katalytischen Eigenschaften des Enzyms sowie deren dazugehörige Funktionen sind in Zusammenhang mit dieser Domäne bekannt. Im Gegensatz dazu ist über die 25 kD große N-terminale Domäne wenig bekannt. Die N-terminale Domäne der sEH wird zur Haloacid Dehalogenase (HAD) Superfamilie von Hydrolasen gezählt, jedoch war die Funktion dieses N-terminal Domäne lange ungeklärt. Wir haben in unserer Arbeitsgruppe zum ersten Mal zeigen können, dass die sEH in Säugern ein bifunktionelles Enzym ist, welches zusätzlich zur allgemein bekannten Enzymaktivität im C-terminalen Bereich eine weitere enzymatische Funktion mit Mg2+-abhängiger Phosphataseaktivität in der N-terminalen Domäne aufweist. Aufgrund der Homologie der N-terminalen Domäne mit anderen Enzymen der HAD Familie wird für die Ausübung der Phosphatasefunktion (Dephosphorylierung) eine Reaktion in zwei Schritten angenommen.rnUm den katalytischen Mechanismus der Dephosphorylierung weiter aufzuklären, wurden biochemische Analysen der humanen sEH Phosphatase durch Generierung von Mutationen im aktiven Zentrum mittels ortsspezifischer Mutagenese durchgeführt. Hiermit sollten die an der katalytischen Aktivität beteiligten Aminosäurereste im aktiven Zentrum identifiziert und deren Rolle bei der Dephosphorylierung spezifiziert werden. rnrnAuf Basis der strukturellen und möglichen funktionellen Ähnlichkeiten der sEH und anderen Mitgliedern der HAD Superfamilie wurden Aminosäuren (konservierte und teilweise konservierte Aminosäuren) im aktiven Zentrum der sEH Phosphatase-Domäne als Kandidaten ausgewählt.rnVon den Phosphatase-Domäne bildenden Aminosäuren wurden acht ausgewählt (Asp9 (D9), Asp11 (D11), Thr123 (T123), Asn124 (N124), Lys160 (K160), Asp184 (D184), Asp185 (D185), Asn189 (N189)), die mittels ortsspezifischer Mutagenese durch nicht funktionelle Aminosäuren ausgetauscht werden sollten. Dazu wurde jede der ausgewählten Aminosäuren durch mindestens zwei alternative Aminosäuren ersetzt: entweder durch Alanin oder durch eine Aminosäure ähnlich der im Wildtyp-Enzym. Insgesamt wurden 18 verschiedene rekombinante Klone generiert, die für eine mutante sEH Phosphatase Domäne kodieren, in dem lediglich eine Aminosäure gegenüber dem Wildtyp-Enzym ersetzt wurde. Die 18 Mutanten sowie das Wildtyp (Sequenz der N-terminalen Domäne ohne Mutation) wurden in einem Expressionsvektor in E.coli kloniert und die Nukleotidsequenz durch Restriktionsverdau sowie Sequenzierung bestätigt. Die so generierte N-terminale Domäne der sEH (25kD Untereinheit) wurde dann mittels Metallaffinitätschromatographie erfolgreich aufgereinigt und auf Phosphataseaktivität gegenüber des allgemeinen Substrats 4-Nitophenylphosphat getestet. Diejenigen Mutanten, die Phosphataseaktivität zeigten, wurden anschließend kinetischen Tests unterzogen. Basiered auf den Ergebnissen dieser Untersuchungen wurden kinetische Parameter mittels vier gut etablierter Methoden berechnet und die Ergebnisse mit der „direct linear blot“ Methode interpretiert. rnDie Ergebnisse zeigten, dass die meisten der 18 generierten Mutanten inaktiv waren oder einen Großteil der Enzymaktivität (Vmax) gegenüber dem Wildtyp verloren (WT: Vmax=77.34 nmol-1 mg-1 min). Dieser Verlust an Enzymaktivität ließ sich nicht durch einen Verlust an struktureller Integrität erklären, da der Wildtyp und die mutanten Proteine in der Chromatographie das gleiche Verhalten zeigten. Alle Aminosäureaustausche Asp9 (D9), Lys160 (K160), Asp184 (D184) und Asn189 (N189) führten zum kompletten Verlust der Phosphataseaktivität, was auf deren katalytische Funktion im N-terminalen Bereich der sEH hindeutet. Bei einem Teil der Aminosäureaustausche die für Asp11 (D11), Thr123 (T123), Asn124 (N124) und Asn185 (D185) durchgeführt wurden, kam es, verglichen mit dem Wildtyp, zu einer starken Reduktion der Phosphataseaktivität, die aber dennoch für die einzelnen Proteinmutanten in unterschiedlichem Ausmaß zu messen war (2 -10% and 40% of the WT enzyme activity). Zudem zeigten die Mutanten dieser Gruppe veränderte kinetische Eigenschaften (Vmax allein oder Vmax und Km). Dabei war die kinetische Analyse des Mutanten Asp11  Asn aufgrund der nur bei dieser Mutanten detektierbaren starken Vmax Reduktion (8.1 nmol-1 mg-1 min) und einer signifikanten Reduktion der Km (Asp11: Km=0.54 mM, WT: Km=1.3 mM), von besonderem Interesse und impliziert eine Rolle von Asp11 (D11) im zweiten Schritt der Hydrolyse des katalytischen Zyklus.rnZusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass alle in dieser Arbeit untersuchten Aminosäuren für die Phosphataseaktivität der sEH nötig sind und das aktive Zentrum der sEH Phosphatase im N-terminalen Bereich des Enzyms bilden. Weiterhin tragen diese Ergebnisse zur Aufklärung der potenziellen Rolle der untersuchten Aminosäuren bei und unterstützen die Hypothese, dass die Dephosphorylierungsreaktion in zwei Schritten abläuft. Somit ist ein kombinierter Reaktionsmechanismus, ähnlich denen anderer Enzyme der HAD Familie, für die Ausübung der Dephosphorylierungsfunktion denkbar. Diese Annahme wird gestützt durch die 3D-Struktur der N-terminalen Domäne, den Ergebnissen dieser Arbeit sowie Resultaten weiterer biochemischer Analysen. Der zweistufige Mechanismus der Dephosphorylierung beinhaltet einen nukleophilen Angriff des Substratphosphors durch das Nukleophil Asp9 (D9) des aktiven Zentrums unter Bildung eines Acylphosphat-Enzym-Zwischenprodukts, gefolgt von der anschließenden Freisetzung des dephosphorylierten Substrats. Im zweiten Schritt erfolgt die Hydrolyse des Enzym-Phosphat-Zwischenprodukts unterstützt durch Asp11 (D11), und die Freisetzung der Phosphatgruppe findet statt. Die anderen untersuchten Aminosäuren sind an der Bindung von Mg 2+ und/oder Substrat beteiligt. rnMit Hilfe dieser Arbeit konnte der katalytischen Mechanismus der sEH Phosphatase weiter aufgeklärt werden und wichtige noch zu untersuchende Fragestellungen, wie die physiologische Rolle der sEH Phosphatase, deren endogene physiologische Substrate und der genaue Funktionsmechanismus als bifunktionelles Enzym (die Kommunikation der zwei katalytischen Einheiten des Enzyms) wurden aufgezeigt und diskutiert.rn

Plasmoscope: Automated spectroscopy of single nanoparticles

Plasmonen sind die kollektive resonante Anregung von Leitungselektronen. Vom Licht angeregternPlasmonen in subwellenlängen-grossen Nanopartikeln heissen Partikelplasmonen und sind vielversprechende Kandidaten für zukünftige Mikrosensoren wegen der starken Abhängigkeit der Resonanz an extern steuerbaren Parametern, wie die optischen Eigenschaften des umgebenden Mediums und die elektrische Ladung der Nanopartikel. Die extrem hohe Streue_zienz von Partikelplasmonen erlaubt eine einfache Beobachtung einzelner Nanopartikel in einem Mikroskop.rnDie Anforderung, schnell eine statistisch relevante Anzahl von Datenpunkten sammeln zu können,rnund die wachsende Bedeutung von plasmonischen (vor allem Gold-) Nanopartikeln für Anwendungenrnin der Medizin, hat nach der Entwicklung von automatisierten Mikroskopen gedrängt, die im bis dahin nur teilweise abgedeckten spektralen Fenster der biologischen Gewebe (biologisches Fenster) von 650 bis 900nm messen können. Ich stelle in dieser Arbeit das Plasmoscope vor, das genau unter Beobachtung der genannten Anforderungen entworfen wurde, in dem (1) ein einstellbarer Spalt in die Eingangsö_nung des Spektrometers, die mit der Bildebene des Mikroskops zusammenfällt, gesetzt wurde, und (2) einem Piezo Scantisch, der es ermöglicht, die Probe durch diesen schmalen Spalt abzurastern. Diese Verwirklichung vermeidet optische Elemente, die im nahen Infra-Rot absorbieren.rnMit dem Plasmoscope untersuche ich die plasmonische Sensitivität von Gold- und Silbernanostrnäbchen, d.h. die Plasmon-Resonanzverschiebung in Abhängigkeit mit der Änderung des umgebendenrnMediums. Die Sensitivität ist das Mass dafür, wie gut die Nanopartikeln Materialänderungenrnin ihrer Umgebung detektieren können, und damit ist es immens wichtig zu wissen, welche Parameterrndie Sensitivität beein_ussen. Ich zeige hier, dass Silbernanostäbchen eine höhere Sensitivität alsrnGoldnanostäbchen innerhalb des biologischen Fensters besitzen, und darüberhinaus, dass die Sensitivität mit der Dicke der Stäbchen wächst. Ich stelle eine theoretische Diskussion der Sensitivitätrnvor, indenti_ziere die Materialparameter, die die Sensitivität bein_ussen und leite die entsprechendenrnFormeln her. In einer weiteren Annäherung präsentiere ich experimentelle Daten, die die theoretische Erkenntnis unterstützen, dass für Sensitivitätsmessschemata, die auch die Linienbreite mitberücksichtigen, Goldnanostäbchen mit einem Aspektverhältnis von 3 bis 4 das optimalste Ergebnis liefern. Verlässliche Sensoren müssen eine robuste Wiederholbarkeit aufweisen, die ich mit Gold- und Silbernanostäbchen untersuche.rnDie Plasmonen-resonanzwellenlänge hängt von folgenden intrinsischen Materialparametern ab:rnElektrondichte, Hintergrundpolarisierbarkeit und Relaxationszeit. Basierend auf meinen experimentellen Ergebnissen zeige ich, dass Nanostäbchen aus Kupfer-Gold-Legierung im Vergleich zu ähnlich geformten Goldnanostäbchen eine rotverschobene Resonanz haben, und in welcher Weiserndie Linienbreite mit der stochimetrischen Zusammensetzung der legierten Nanopartikeln variiert.rnDie Abhängigkeit der Linienbreite von der Materialzusammensetzung wird auch anhand von silberbeschichteten und unbeschichteten Goldnanostäbchen untersucht.rnHalbleiternanopartikeln sind Kandidaten für e_ziente photovoltaische Einrichtungen. Die Energieumwandlung erfordert eine Ladungstrennung, die mit dem Plasmoscope experimentell vermessen wird, in dem ich die lichtinduzierte Wachstumsdynamik von Goldsphären auf Halbleiternanost äbchen in einer Goldionenlösung durch die Messung der gestreuten Intensität verfolge.rn

The relevance of the silica metabolizing enzyme silicatein-alpha to biomineralization and the formation of biogenic silica in siliceous sponges

Die technische Silikatproduktion erfordert in der Regel hohe Temperaturen und extreme pH-Werte. In der Natur hingegen haben insbesondere Kieselschwämme die außergewöhnliche Fähigkeit, ihr Silikatskelett, das aus einzelnen sogenannten Spiculae besteht, enzymatisch mittels des Proteins Silicatein zu synthetisieren. rnIm Inneren der Spiculae, im zentralen Kanal, befindet sich das Axialfilament, welches hauptsächlich aus Silicatein-α aufgebaut ist. Mittels Antikörperfärbungen und Elektronenmikroskopischen Analysen konnte festgestellt werden, dass Silicatein in mit Kieselsäure-gefüllten Zellorganellen (silicasomes) nachzuweisen ist. Mittels dieser Vakuolen kann das Enzym und die Kieselsäure aus der Zelle zu den Spiculae im extrazellulären Raum befördert werden, wo diese ihre endgültige Länge und Dicke erreichen. Zum ersten Mal konnte nachgewiesen werden, dass rekombinant hergestelltes Silicatein-α sowohl als Siliciumdioxid-Polymerase als auch Siliciumdioxid-Esterase wirkt. Mittels Massenspektroskopie konnte die enzymatische Polymerisation von Kieselsäure nachverfolgt werden. Durch Spaltung der Esterbindung des künstlichen Substrates Bis(p-aminophenoxy)-dimethylsilan war es möglich kinetische Parameter der Siliciumdioxid-Esterase-Aktivität des rekombinanten Silicateins zu ermitteln.rnZu den größten biogenen Silikatstukuren auf der Erde gehören die Kieselnadeln der Schwammklasse Hexactinellida. Nadelextrakte aus den Schwammklassen Demospongien (S. domuncula) und Hexactinellida (M. chuni) wurden miteinander verglichen um die potentielle Existenz von Silicatein oder Silicatein-ähnliche Molekülen und die dazu gehörige proteolytischen Aktivität nachzuweisen. Biochemische Analysen zeigten, dass das 27 kDA große isolierte Polypeptid in Monoraphis mehrere gemeinsame Merkmale mit den Silicateinen der Demospongien teilt. Dazu gehören die Größe und die Proteinase-Aktivität. rnUm die Frage zu klären, ob das axiale Filament selbst zur Formbildung der Skelettelemente beiträgt, wurde ein neues mildes Extraktionsverfahren eingeführt. Dieses Verfahren ermöglichte die Solubilisierung des nativen Silicateins aus den Spiculae. Die isolierten Silicateine lagen als Monomere (24 kDa) vor, die Dimere durch nicht-kovalente Bindungen ausbildeten. Darüber hinaus konnten durch PAGE-Gelelektrophorese Tetramere (95 kDa) und Hexamere (135 kDa) nachgewiesen werden. Die Monomere zeigten eine beträchtliche proteolytische Aktivität, die sich während der Polymerisationsphase des Proteins weiter erhöhte. Mit Hilfe der Lichtmikroskopie und Elektronenmikroskopie (TEM) konnte die Assemblierung der Proteine zu filamentartigen Strukturen gezeigt werden. Die Selbstorganisation der Silicatein-α-Monomeren scheint eine Basis für Form- und Musterbildung der wachsenden Nadeln zu bilden.rn Um die Rolle des kürzlich entdeckten Proteins Silintaphin-1, ein starker Interaktionspartner des Silicatein-α, während der Biosilifizierung zu klären, wurden Assemblierungs-Experimente mit den rekombinanten Proteinen in vitro durchgeführt. Zusätzlich wurde deren Effekt auf die Biosilikatsynthese untersucht. Elektronenmikroskopische Analysen ergaben, dass rekombinantes Silicatein-α zufällig verteilte Aggregate bildet, während die Koinkubation beider Proteine (molekulares Verhältnis 4:1) über fraktal artige Strukturen zu Filamenten führt. Auch die enzymatische Aktivität der Silicatein-α-vermittelte Biosilikatsynthese erhöhte sich in Gegenwart von Silintaphin-1 um das 5,3-fache. rn

Biochemische Charakterisierung der Zyklin-abhängigen Kinase 2,Aktivator-Komplexe des Parasiten Eimeria tenella sowie deren Nutzung in der Wirkstoffforschung

Der Stamm der Apicomplexa ist eine artenreiche Gruppe, der einzellige, meist obligat intrazelluläre Parasiten angehören, darunter auch erstzunehmende Krankheitserreger wie Plasmodium sp. sowie tierpathogene Vertreter wie Eimeria sp. und Theileria sp. Eimeria sp. verursacht die Kokzidiose beim Huhn. Diese Krankheit bedingt weltweite Verluste in der Geflügelindustrie von etwa 3 Milliarden US$ pro Jahr [DALLOUL & LILLEHOJ, 2006; SHIRLEY et al., 2007; LUCIUS & LOOS-FRANK, 2008]. Die Parasiten weisen eine hohe Resistenzbildungsrate gegen vorhandene Wirkstoffe auf. Zudem ist der Einsatz von Vakzinen mit Nebenwirkungen verbunden und für hohe Produktionskosten verantwortlich. Daher ist die Entwicklung von neuen, kostengünstigen und effektiven Kokzidiostatika eine dringend notwendige Herausforderung [KINNAIRD et al., 2004]. rnAuf Grund ihrer essentiellen, regulatorischen Funktion im eukaryotischen Zellzyklus sind Zyklin-abhängige Kinasen (CDKs) validierte Zielproteine [LEHNINGER et al., 2005]. Auch Eimeria tenella CDC2-related kinase 2 (EtCRK2) wurde bereits mittels des bekannten CDK-Inhibitors Flavopiridol als Zielprotein chemisch validiert [ENGELS et al., 2010]. Wie bei allen CDKs ist die Aktivität von EtCRK2 abhängig von der Bindung eines Aktivators, der zur Zyklin-Proteinfamilie gehört. Dieser natürliche EtCRK2-Aktivator war jedoch bislang nicht bekannt. Deshalb war ein Teil dieser Arbeit die Identifizierung des natürlichen EtCRK2-Aktivators. Bioinformatische Analysen identifizierten vier E. tenella Zyklin-ähnliche Proteine (EtCYC1, EtCYC3a, EtCYC3b und EtCYC4), die nah verwandt zu den Plasmodium falciparum-Zyklinen sind [ENGELS et al., 2010; SUÁREZ FERNÁNDEZ et al., bislang unveröffentlichte Daten]. Im Rahmen dieser Arbeit konnten zwei neue Aktivatoren identifiziert und biochemisch charakterisiert werden: der bekannte CDK-Aktivator XlRINGO und das neue E. tenella-Zyklin EtCYC3a. Nachdem der nicht-radioaktive TR-FRET-Assay für die EtCRK2 etabliert und optimiert wurde, konnte die EtCRK2-Aktivität im Komplex mit beiden Aktivatoren und weitere wichtige kinetische Parameter bestimmt werden.rnZusätzlich wurde dieser Assay zum in vitro Screening einer kommerziellen Chemikalienbibliothek auf die EtCRK2 eingesetzt, um potentielle Inhibitoren für EtCRK2 zu identifizieren. Dieses in vitro Screening gefolgt von einer in silico Hit-Anreicherung identifizierte 19 aktive Verbindungen für die durch EtCYC3a und XlRINGO aktivierte EtCRK2. Zudem wurden drei Struktur-Cluster definiert: Naphthoquinone, 8-Hydroxyquinoline und 2-Pyrimidinyl-aminopiperidin-propan-2-ole. rnDie aktivsten Vertreter von jedem Cluster wurden als Leitstrukturen ausgewählt und auf EtCRK2 und HsCDK2 getestet. Aufgrund ihrer inhibierenden Wirkung auf EtCRK2 stellen diese Verbindungen viel versprechende Leitstrukturen für die Entwicklung eines neuen Antikokzidiums dar. Hiermit konnte auch gezeigt werden, dass BES124764, der Vertreter des 2-Pyrimidinyl-aminopiperidin-propan-2-ol-Clusters, in der Lage ist, die EtCRK2 selektiv zu inhibieren. rnDaher wird BES124764 sowie einige Derivate in den Leitstruktur-Optimierungsprozess für die Auffindung eines neuen Arzneimittelkandidaten gegen Kokzidiose eingehen.rn

Mesonic chiral perturbation theory - odd intrinsic parity sector

In der vorliegenden Dissertation werden zwei verschiedene Aspekte des Sektors ungerader innerer Parität der mesonischen chiralen Störungstheorie (mesonische ChPT) untersucht. Als erstes wird die Ein-Schleifen-Renormierung des führenden Terms, der sog. Wess-Zumino-Witten-Wirkung, durchgeführt. Dazu muß zunächst der gesamte Ein-Schleifen-Anteil der Theorie mittels Sattelpunkt-Methode extrahiert werden. Im Anschluß isoliert man alle singulären Ein-Schleifen-Strukturen im Rahmen der Heat-Kernel-Technik. Zu guter Letzt müssen diese divergenten Anteile absorbiert werden. Dazu benötigt man eine allgemeinste anomale Lagrange-Dichte der Ordnung O(p^6), welche systematisch entwickelt wird. Erweitert man die chirale Gruppe SU(n)_L x SU(n)_R auf SU(n)_L x SU(n)_R x U(1)_V, so kommen zusätzliche Monome ins Spiel. Die renormierten Koeffizienten dieser Lagrange-Dichte, die Niederenergiekonstanten (LECs), sind zunächst freie Parameter der Theorie, die individuell fixiert werden müssen. Unter Betrachtung eines komplementären vektormesonischen Modells können die Amplituden geeigneter Prozesse bestimmt und durch Vergleich mit den Ergebnissen der mesonischen ChPT eine numerische Abschätzung einiger LECs vorgenommen werden. Im zweiten Teil wird eine konsistente Ein-Schleifen-Rechnung für den anomalen Prozeß (virtuelles) Photon + geladenes Kaon -> geladenes Kaon + neutrales Pion durchgeführt. Zur Kontrolle unserer Resultate wird eine bereits vorhandene Rechnung zur Reaktion (virtuelles) Photon + geladenes Pion -> geladenes Pion + neutrales Pion reproduziert. Unter Einbeziehung der abgeschätzten Werte der jeweiligen LECs können die zugehörigen hadronischen Strukturfunktionen numerisch bestimmt und diskutiert werden.

Kinetic modeling and experiments on gas uptake and chemical transformation of organic aerosol in the atmosphere

Aerosolpartikel beeinflussen das Klima durch Streuung und Absorption von Strahlung sowie als Nukleations-Kerne für Wolkentröpfchen und Eiskristalle. Darüber hinaus haben Aerosole einen starken Einfluss auf die Luftverschmutzung und die öffentliche Gesundheit. Gas-Partikel-Wechselwirkunge sind wichtige Prozesse, weil sie die physikalischen und chemischen Eigenschaften von Aerosolen wie Toxizität, Reaktivität, Hygroskopizität und optische Eigenschaften beeinflussen. Durch einen Mangel an experimentellen Daten und universellen Modellformalismen sind jedoch die Mechanismen und die Kinetik der Gasaufnahme und der chemischen Transformation organischer Aerosolpartikel unzureichend erfasst. Sowohl die chemische Transformation als auch die negativen gesundheitlichen Auswirkungen von toxischen und allergenen Aerosolpartikeln, wie Ruß, polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAK) und Proteine, sind bislang nicht gut verstanden.rn Kinetische Fluss-Modelle für Aerosoloberflächen- und Partikelbulk-Chemie wurden auf Basis des Pöschl-Rudich-Ammann-Formalismus für Gas-Partikel-Wechselwirkungen entwickelt. Zunächst wurde das kinetische Doppelschicht-Oberflächenmodell K2-SURF entwickelt, welches den Abbau von PAK auf Aerosolpartikeln in Gegenwart von Ozon, Stickstoffdioxid, Wasserdampf, Hydroxyl- und Nitrat-Radikalen beschreibt. Kompetitive Adsorption und chemische Transformation der Oberfläche führen zu einer stark nicht-linearen Abhängigkeit der Ozon-Aufnahme bezüglich Gaszusammensetzung. Unter atmosphärischen Bedingungen reicht die chemische Lebensdauer von PAK von wenigen Minuten auf Ruß, über mehrere Stunden auf organischen und anorganischen Feststoffen bis hin zu Tagen auf flüssigen Partikeln. rn Anschließend wurde das kinetische Mehrschichtenmodell KM-SUB entwickelt um die chemische Transformation organischer Aerosolpartikel zu beschreiben. KM-SUB ist in der Lage, Transportprozesse und chemische Reaktionen an der Oberfläche und im Bulk von Aerosol-partikeln explizit aufzulösen. Es erforder im Gegensatz zu früheren Modellen keine vereinfachenden Annahmen über stationäre Zustände und radiale Durchmischung. In Kombination mit Literaturdaten und neuen experimentellen Ergebnissen wurde KM-SUB eingesetzt, um die Effekte von Grenzflächen- und Bulk-Transportprozessen auf die Ozonolyse und Nitrierung von Protein-Makromolekülen, Ölsäure, und verwandten organischen Ver¬bin-dungen aufzuklären. Die in dieser Studie entwickelten kinetischen Modelle sollen als Basis für die Entwicklung eines detaillierten Mechanismus für Aerosolchemie dienen sowie für das Herleiten von vereinfachten, jedoch realistischen Parametrisierungen für großskalige globale Atmosphären- und Klima-Modelle. rn Die in dieser Studie durchgeführten Experimente und Modellrechnungen liefern Beweise für die Bildung langlebiger reaktiver Sauerstoff-Intermediate (ROI) in der heterogenen Reaktion von Ozon mit Aerosolpartikeln. Die chemische Lebensdauer dieser Zwischenformen beträgt mehr als 100 s, deutlich länger als die Oberflächen-Verweilzeit von molekularem O3 (~10-9 s). Die ROIs erklären scheinbare Diskrepanzen zwischen früheren quantenmechanischen Berechnungen und kinetischen Experimenten. Sie spielen eine Schlüsselrolle in der chemischen Transformation sowie in den negativen Gesundheitseffekten von toxischen und allergenen Feinstaubkomponenten, wie Ruß, PAK und Proteine. ROIs sind vermutlich auch an der Zersetzung von Ozon auf mineralischem Staub und an der Bildung sowie am Wachstum von sekundären organischen Aerosolen beteiligt. Darüber hinaus bilden ROIs eine Verbindung zwischen atmosphärischen und biosphärischen Mehrphasenprozessen (chemische und biologische Alterung).rn Organische Verbindungen können als amorpher Feststoff oder in einem halbfesten Zustand vorliegen, der die Geschwindigkeit von heterogenen Reaktionenen und Mehrphasenprozessen in Aerosolen beeinflusst. Strömungsrohr-Experimente zeigen, dass die Ozonaufnahme und die oxidative Alterung von amorphen Proteinen durch Bulk-Diffusion kinetisch limitiert sind. Die reaktive Gasaufnahme zeigt eine deutliche Zunahme mit zunehmender Luftfeuchte, was durch eine Verringerung der Viskosität zu erklären ist, bedingt durch einen Phasenübergang der amorphen organischen Matrix von einem glasartigen zu einem halbfesten Zustand (feuchtigkeitsinduzierter Phasenübergang). Die chemische Lebensdauer reaktiver Verbindungen in organischen Partikeln kann von Sekunden bis zu Tagen ansteigen, da die Diffusionsrate in der halbfesten Phase bei niedriger Temperatur oder geringer Luftfeuchte um Größenordnungen absinken kann. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen wie halbfeste Phasen die Auswirkung organischeer Aerosole auf Luftqualität, Gesundheit und Klima beeinflussen können. rn