Die Rolle von IL-17 in Patienten und im Mausmodell für Lungen-Adenokarzinom

Die Funktion der Th 17-Zelllinie im Lungenkarzinom wurde noch nicht vollständig verstanden. In dieser Studie wurde darüber berichtet, dass die Expression der Th17-Zellmarker (RORA, RORC2, IL-17A) in den Lungen der Patienten mit Adenokarzinom erhöht ist, und diese mit dem Transkriptionsfaktor der regulatorischen T-Zellen FOXP 3 positiv korrelieren, was auf eine Beziehung dieser Zelltypen deutet. Außerdem hat man auch herausgefunden, dass IL-17A mit T-bet Trankriptionsfaktor in den Patienten entgegengesetzt korreliert. Die Blockade in einem Mausmodell für Lungen-Adenokarzinom resultierte die Reduktion von Tumorbefall in der Lunge, lokale Expansion der IFNg produzierenden CD4+ T-Effektorzellen und Reduktion der CD4+CD25+FOXP3+ regulatorischen T-Zellen. Untersuchungen in T-bet(-/-) Mäusen zeigten, dass die antikarzinogenen Wirkungen der antiIL-17A-Behandlung T-bet Transkriptionsfaktor benötigen, um sowohl die FOXP3 regulatorischen T-Zellen als auch die Th17-Zellen in vivo zu supprimieren. Dementsprechend hat man herausgefunden, dass der Th17-Pfad beim Fehlen des T-bet Transkriptionsfaktors durch Hochregulierung des IL-23 Rezeptors in CD4+ T-Zellen stimuliert wurde. Bemerkenswert, dass der IL-17 Rezeptor hauptsächlich auf den CD4+CD62Lhigh naiven T-Zellen exprimiert wird und sowohl auf den CD4+T-bet+ Th1- als auch auf den CD4+CD25+FOXP3+ Treg -Zellen im Tumor fehlt. Dieses resultiert den Verlust der Kontrolle der IL-17 auf Th1 und Treg-Zellentwicklung. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Blockade des IL-17A eine mögliche klinische Behandlung darstellt, weil sie die IFNg produzierenden Th1 Zellen unterstützt und die CD4+CD25+FOXP3+ regulatorischen T Zellen in Lungen Karzinom reduziert.

Die Rolle des IL-2-Signalweges in einem murinen Adenokarzinom-Modell

Die Ursachen für die Entstehung von Lungentumoren sind vielseitig. Aus geschädigtem Drüsengewebe der Lunge kann sich die Tumorart des Adenokarzinoms entwickeln, welches zu den malignen Krebserkrankungen gehört und somit nach Etablierung eines Primärtumors metastasieren kann. Es wurde vielfach gezeigt, daß das Immunsystem bei der Bekämpfung eines mutierten Gewebes im fortschreitenden Verlauf des Tumorwachstums an Effektivität verliert. Die dahinter stehenden Mechanismen sind noch nicht ganz verstanden. Eine mögliche Ursache könnte eine fehlerhafte Regulation der Immunabwehr sein. Das Zytokin, welches bei dieser Regulation eine wichtige Rolle spielt, ist das Interleukin-2 (IL-2). Dieses aktiviert immunkompetente Zellen und gewährleistet deren Fortbestand während der Immunreaktion. In der vorliegenden Arbeit ist in einem murinen Modell von Bronchioadenokarzinom die Regulation von CD4+ T-Zellen durch IL-2 untersucht worden, beziehungsweise inwieweit eine Einflußnahme auf diese Regulation zur Verbesserung der Tumorabwehr beitragen kann. Die alpha-Kette des IL-2 Rezeptorkomplexes (CD25) ist neben dem Transkriptionsfaktor Foxp3 ein gängiger Marker für die Population der so genannten regulatorischen T-Zellen. Regulatorische T-Zellen treten im Tumorgewebe in erhöhtem Maße auf und inhibieren die gegen den Tumor gerichtete Effektorfunktion anderer Immunzellen. Durch intranasale Applikation eines anti-CD25 Antikörpers sollte, im speziellen bei den regulatorischen T-Zellen, das CD25 Molekül blockiert werden, um auf diese Weise die hochaffine Signalgebung zu unterbinden und die regulatorischen T-Zellen intratumoral zu depletieren. Es konnte gezeigt werden, daß die Blockade des IL-2 Rezeptors nicht zur Reduktion des Tumorwachstums beitrug. Trotz Applikation des Antikörpers waren die regulatorischen T-Zellen signifikant erhöht. Lediglich die Produktion des Zytokins Tumornekrosisfaktor-alpha (TNF-alpha) wurde durch die Zugabe des Antikörpers gesteigert, was aber keine Verbesserung der Tumorabwehr bewirkte. Als Alternative zur Blockade des IL-2 Rezeptors wurden verschiedene Dosen von rekombinantem IL-2 ebenfalls intranasal appliziert, um die T-Zell Populationen zusätzlich zu stimulieren. In diesem Fall war bei hohen Dosierungen eine Regression des Tumors zu erreichen. Die Regression ist auf eine erhöhte, durch das IL-2 aktivierte Produktion des Zytokins Interferon-gamma (IFN-gamma) zurückzuführen. Jedoch wurde sowohl bei der Blockade des IL-2 Rezeptors, als auch bei der Stimulation durch IL-2 ersichtlich, daß im Zusammenhang mit Adenokarzinom dem Zytokin TNF-alpha eine besondere Position zugedacht werden muß. Es ist bekannt, daß TNF-alpha in verschiedenen experimentellen Tumor-Modellen unterschiedliche Funktionen besitzt. Die Deletion des TNFs, hier dargestellt mittels TNF-knockout Mäusen, hatte eine kurative Wirkung. Die TNF-knockout Mäuse wiesen fast kein Tumorwachstum auf, die CD4+ T-Zellen aus den knockout Mäusen zeigten eine im Vergleich zum Wildtyp mehrfach höhere Produktion von IFN-gamma, bei gleichzeitiger Reduktion der regulatorischen T-Zellen. Es kann vermutet werden, daß TNF-alpha in dem verwendeten Adenokarzinom-Modell eine tumorunterstützende Wirkung hat. Dahingehend wäre die Neutralisierung der TNF-Signalgebung bei zusätzlicher Stimulation mit IL-2 als wirksamer Therapieansatz in Betracht zu ziehen.

Molekulare Charakterisierung der Il-9-Genexpression in T-Helfer-Typ-9-Zellen

CD4+ T-Zellen können in verschiedene T-Helferzellsubpopulationen differenzieren. Dabei hängt es von verschiedensten Milieubedingungen ab, welche Subpopulation sich ausprägt, damit die CD4+ T-Zelle durch die Sekretion verschiedenster Zytokine ihre Funktion im Immunsystem wahrnehmen kann.rnBei der Th9-Subpopulation handelt es sich um einen IL-9-produzierenden Phänotyp, welcher sich in der Anwesenheit von TGF-ß und IL-4 entwickelt39. Als treibender Transkriptionsfaktor für diese Subpopulation wurde das Protein IRF4 beschrieben45. Da dieser Transkriptionsfaktor auch für die Differenzierung weiterer Subpopulationen, wie Th2- und Th17-Zellen von Bedeutung ist30,121, stellte sich die Frage, welcher Interaktionspartner von IRF4 darüber entscheidet, welcher Subtyp sich entwickelt. Deshalb wurde in dieser Arbeit der Transkriptionsfaktor NFATc2 als möglicher Interaktionspartner für IRF4 am murinen Il9 Promotor untersucht. Allerdings zeigten Reportergen¬analysen, dass NFATc2 die IL-9-Produktion in Th9-Zellen inhibiert anstatt sie zu fördern. Th9-Zellen aus NFATc2-defizienten Tieren zeigen folglich im Vergleich zu wildtypischen Th9-Zellen sowohl nach Primär- als auch nach Restimulation eine verstärkte IL-9-Produktion. Der Faktor NFATc2 kann somit als transkriptioneller Aktivator für die IL-9-Expression in Th9-Zellen ausgeschlossen werden. In vivo wurden diese Beobachtungen dadurch untermauert, dass NFATc2-defiziente Tiere im Rahmen des Asthma bronchiale zu einer verstärkten pulmonalen Inflammation neigen und auch einen erhöhten Atemwegswiderstand nach Methacholin-Provokation aufweisen. Diese asthmatischen Symptome konnten durch Applikation eines neutralisierenden Antikörpers für IL-9 wesentlich gemildert werden. In einem B16F10-Melanommodell konnten NFATc2-defiziente Tiere gegenüber dem Wildtyp eine verbesserte anti-Tumorantwort ausprägen. Nach Gabe eines IL-9-neutralisierenden Antikörpers, wurde dieser Effekt wiederum gemildert.rnZusammenfassend lässt sich sagen, dass IRF4 nicht mit NFATc2 am murinen Il9 Promotor interagiert, um die IL-9-Expression in Th9-Zellen zu fördern. Eine NFATc2-Defizienz resultiert sogar in einer gesteigerten IL-9-Produktion, womit ein inhibitorischer Einfluss von NFATc2 in Bezug auf die IL-9-Expression in Th9-Zellen nachgewiesen werden konnte.rn

Molekulare Reaktionsmuster in dendritischen Zellen nach Allergenexposition

Allergische Erkrankungen, wie zum Beispiel die allergische Rhinitis oder das allergische Asthma haben im Verlauf der letzten vier Jahrzehnte stark zugenommen. So leidet heute jeder vierte bis fünfte Mensch an einer Allergie. Ausgelöst wird diese IgE-vermittelte Hypersensibilitätsreaktion des Typs I (Allergie vom Soforttyp) von Allergenen und beruht auf der Aktivierung von Mastzellen durch die Interaktion eines Antigens mit dem an eine Mastzelle über die Fc-Rezeptoren gebundenen IgE-Moleküls. Die degranulierende Mastzelle sezerniert Mediatoren, was zu einem Auftreten von allergischen Symptomen führt. Die Bildung von IgE wird durch das von TH2-Zellen produzierte Zytokin IL-4 induziert. Das von TH1-Zellen produzierte Zytokin IFN- ist in der Lage die Sekretion von IL-4 zu inhibieren, wie auch IL-4 hemmend auf die Produktion von IFN- wirkt. Dieses TH1-/ TH2-Gleichgewicht ist bei allergischen Erkrankungen in Richtung TH2 verschoben. Allergene werden von antigenpräsentierenden Zellen aufgenommen, prozessiert und auf der Zelloberfläche präsentiert. Die potentesten antigenpräsentierenden Zellen sind die dendritischen Zellen, die nach Kontakt mit einem Allergen in die benachbarten Lymphknoten wandern, ausreifen und kostimulatorische Moleküle exprimieren. Sie sind so in der Lage T-Zellen zu aktivieren und entweder in TH1- oder in TH2-Zellen differenzieren zu lassen. Die zytokinabhängige TH1- beziehungsweise TH2-Differenzierung führt zur Aktivierung der Januskinasen. Im aktiven Zustand phosphorylieren sie STAT-Moleküle, die dimerisieren und in den Zellkern translozieren, wo sie unter anderem als Transkriptionsfaktoren für Zytokingene dienen. Unreife humane dendritische Zellen von Allergikern zeigen nach Stimulation mit Proteinallergenen eine schnelle Phosphorylierung des mit der TH2-Entwicklung assoziierten STAT6. Dahingegen sind TH1-Antwort hervorrufende Kontaktallergene nicht in der Lage STAT6 oder andere STAT-Moleküle in dendritischen Zellen zu induzieren. Die Transkriptionsfaktoren T-bet und GATA3 sind ebenfalls von Bedeutung für die TH1-/TH2-Entwicklung, da T-bet ausschließlich in TH1-Zellen, GATA3 nur in TH2-Zellen exprimiert wird. Die Regulation des JAK/STAT-Weg unterliegt den Molekülen der intrazellulär vorkommenden Familie der SOCS-Proteine. SOCS3 ist in TH2-Zellen höher exprimiert als SOCS1, wohingegen SOCS1 in TH1-Zellen eine erhöhte Expression gegenüber SOCS3 aufweist. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von Proteinallergenen auf humane dendritische Zellen untersucht. Zunächst konnte eine morphologische Veränderung der unreifen dendritischen Zellen nach Kontakt mit dem Allergenextrakt beobachtet werden. Die beginnende Ausreifung der Zellen konnte mittels Durchflußzytometrie anhand der kostimulatorischen Moleküle CD80 und CD86, insbesondere aber über den Marker für reife dendritische Zellen CD83, nachgewiesen werden. Die zu beobachtende beginnende Ausreifung scheint ein Effekt des bakteriellen Lipopolysaccharids (LPS) zu sein, das in dem Allergenextrakt vorkommt, da sich durch Zugabe des kationischen Antibiotikums Polymyxin B die beginnende Reifung verhindern ließ. Auf RNA-Ebene war es im Rahmen dieser Arbeit möglich, den Einfluss verschiedener Allergene auf unreifen humanen dendritischen Zellen näher zu charakterisieren. So weisen unreife humane dendritische Zellen nach Kontakt mit Proteinallergenextrakt ein TH2-assoziiertes Genexpressionprofil auf, was sich durch eine erhöhte relative Expression der Gene SOCS3 und GATA3 auszeichnet. Im Gegensatz hierzu zeigen unreife humane dendritische Zellen nach Inkubation mit dem Kontaktallergen MCI/MI eine erhöhte relative Expression des Gens T-bet, was mit einer TH1-Antwort assoziiert ist. Nach Zugabe des „TH1-/ TH2-neutralen“ Tetanustoxoids konnten erhöhte relative Expressionen der Gene GATA3, T-bet und SOCS3 gemessen werden. Die Ergebnisse in dem in dieser Arbeit benutzten humanen in vitro System geben Anlass zur Hypothese, dass die Art der Immunantwort (TH1 versus TH2) sich bereits auf Ebene der dendritischen Zellen anbahnt. GeneChip-Analysen mittels High Density Micro Arrays von unreifen humanen dendritischen Zellen, die entweder mit Proteinallergenextrakt oder mit LPS in Berührung kamen, zeigten statistisch signifikant regulierte Gene, die allerdings keine Gemeinsamkeiten aufwiesen. Es konnten für die mit Alllergenextrakt gepulsten dendritischen Zellen insgesamt 10 Gene identifiziert werden, jedoch gelang es nicht, diese näher zu deuten oder in einen Zusammenhang mit der allergischen Erkrankung oder der dendritischen Zelle zu bringen. Für die mit LPS, dem stärkeren Stimulus, gepulsten dendritischen Zellen konnten 40 Gene identifiziert werden, die unter anderem für die Maturierung der dendritischen Zelle verantwortlich sind. Zudem war es möglich, die Daten der Arrays auf Proteinebene exemplarisch anhand des Chemokins CXCL2 (Gro-β) zu verifizieren.

Die kutane murine Mastzelle als Initiator angeborener und adaptiver Immunreaktionen der Haut

Für lange Zeit wurde die Mastzelle nur als Effektorzelle im Rahmen von Erkrankungen des atopischen Formenkreises gesehen. Erst lange Zeit nach ihrer ersten Beschreibung konnte gezeigt werden, dass die Mastzelle einen wichtigen Beitrag zur Abwehr von Pathogenen leistet. Dies wird vor allem durch Wege der alternativen Mastzellaktivierung, z.B. über Toll- like Rezeptoren, ermöglicht. In dieser Arbeit sollte daher zunächst die mögliche Funktion der Mastzelle bei der durch den synthetischen TLR7- Liganden Imiquimod induzierten Entzündungsreaktion der Haut und der Auswanderung von Langerhans Zellen in einem Mausmodell untersucht werden. Beide Reaktion waren dabei von Mastzellen abhängig sind. Für die frühe und schnelle Induktion der Entzündungsreaktion zeigten sich vor allem die Mastzellcytokine IL-1 und TNF-α verantwortlich. Bei der Auswanderung der Langerhans Zellen hingegen spielt das Mastzell-IL1 eine entscheidende Rolle. Imiquimod wurde in Form der Creme Aldara bereits erfolgreich zur transkutanen Immunisierung (TCI) in Mausversuchen verwendet. Da die oben beschriebenen Reaktionen, welche durch Imiquimod vermittelt werden, eine deutliche Abhängigkeit von Mastzellen zeigten, sollte nun auch die Funktion der Mastzelle bei der Entstehung einer adaptiven Immunantwort am Modell der transkutanen Immunisierung untersucht werden. Der Immunisierungserfolg und damit die Entstehung einer adaptiven Immunantwort konnte auch hier auf die Anwesenheit von Mastzellen zurückgeführt werden. Mastzellen können somit als ein weiteres wichtiges Bindeglied zwischen angeborener und erworbener Immunität gesehen werden und können so einen entscheidenden Einfluß auf die Entstehung einer adaptiven Immunantwort nehmen.

Die Rolle CD4 + CD25 + regulatorischer T-Zellen in der Niedrigzonentoleranz gegenüber Kontaktallergenen

Die allergische Kontaktdermatitis ist eine der häufigsten Berufserkrankungen, die durch die Exposition mit hohen Mengen eines Kontaktallergens ausgelöst wird. In Mausmodellen sehen wir, dass mittels einer Niedrigzonentoleranz (NZT) die Bildung einer Kontaktsensibilisierung unterdrückt werden kann. Bei der NZT führt die epikutane Applikation von subimmunogenen Dosen zu einer systemischen Toleranzentwicklung, die durch CD8+ Suppressor-T-Zellen Hapten-spezifisch vermittelt wird. Für die Generierung dieser CD8+ Suppressor-T-Zellen sind IL-10-sezernierende CD4+ regulatorischen T-Zellen (Tregs) notwendig. Aufbauend auf diesen Ergebnissen sollte in dieser Arbeit überprüft werden, ob natürlichen Tregs (nTregs) bei der NZT eine Rolle spielen und die Funktion und Aufgaben dieser Zellen während der NZT untersucht werden. rnWir konnten keine erhöhte Anzahl von nTregs während der Niedrigzonentoleranz gegenüber Kontaktallergenen im Vergleich zur CHS charakterisieren. Weiterhin haben wir gezeigt, dass eine Reduktion der nTregs durch Depletion mittels anti-CD25-Anikörper oder durch Cyclophosphamid-Gabe die Entstehung der CD8+ Suppressor-T-Zellen der NZT unterdrückt und damit die Entwicklung der Toleranzreaktion verhindert wird. Ferner wurde beobachtet, dass eine epikutane NZT Hapten-spezifisch durch CD8+ T-Zellen übertragen werden kann, während CD4+CD25+ T-Zellen eine Hapten-unspezifische Wirkung zeigten.rn

Das Interleukin-1Beta-Rezeptor-Homolog im Modifizierten Vakziniavirus Ankara (MVA) - Charakterisierung und möglicher Einfluss auf MVA-basierte Impfvektoren

MVA ist ein attenuiertes Vakziniavirus, das durch wiederholte Passagierung von Chorioallantoisvirus Ankara auf Hühnerembryofibroblasten gewonnen wurde. Es ist bis auf wenige Ausnahmen nicht mehr in der Lage, in Säugerzellen zu replizieren, zeigt aber dennoch eine vollständige virale Proteinexpression und induziert nach Immunisierung eine zu VACV vergleichbare Immunantwort. Aus diesem Grund wurde es bereits als Impfstoff gegen die menschliche Pockenerkrankung eingesetzt, ohne hierbei die bei den klassischen Impfviren beobachtbaren Nebenwirkungen hervorzurufen. Das Genom von MVA enthält jedoch noch Immunmodulatoren, deren Deletion Ansatzpunkt für die weitere Verbesserung des Impfstoffes sein kann. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde eine Deletionsmutante untersucht, bei der das Gen für den Interleukin-1β Rezeptor (IL-1βR) deletiert ist (MVA ΔIL-1βR). Es konnte nachgewiesen werden, dass der IL-1βR in murinen als auch in humanen Zellen exprimiertes IL-1β bindet und somit inaktiviert. Des Weiteren wurde gefunden, dass MVA in der Lage ist, IL-1β in antigenpräsentierenden Zellen zu induzieren, welches aber durch die Neutralisierung aufgrund des IL-1βR nur transient nachzuweisen war. Im Gegensatz dazu induzierte MVA ΔIL-1βR eine anhaltende und um ein Vielfaches erhöhte Sekretion an IL-1β. Untersuchungen in antigenpräsentierenden Zellen aus knock-out Mäusen, die verschiedene Defizienzen in den Signalwegen zur IL-1β-Induktion trugen, zeigten, dass die Sekretion von IL-1β von Caspase-1 abhängig war, welches wahrscheinlich aus der vorgeschalteten Aktivierung der NLRP3- und/oder AIM2-Inflammasomen resultierte. Interessanterweise wurden auch Caspase-1 unabhängige Mechanismen beobachtet, die auf eine Inflammasom-unabhängige IL-1β-Induktion hinweisen könnten. In Bezug auf die Immunaktivierung führte die vermehrte Sekretion von IL-1β durch MVA ΔIL-1βR vermutlich zu einer verbesserten Antigenpräsentation, die die nachfolgende T-Zellantwort beeinflusste. In Übereinstimmung mit bereits veröffentlichten Daten wurde nach Immunisierung mit MVA ΔIL-1βR eine effektivere Gedächtnis-T-Zellantwort festgestellt, deren Charakteristika und zu Grunde liegenden Mechanismen hier untersucht wurden. Jedoch konnten weder Unterschiede in weiteren pro-inflammatorischen Zytokinmustern noch im Verlauf insbesondere der CD8+ T-Zell-Aktivierung und -erhaltung zwischen MVA und MVA ΔIL-1βR beobachtet werden. Als mögliche weitere Ursache für die veränderte Gedächtnis-T-Zellantwort könnte daher eine vermehrte Stimulation durch antigenpräsentierende Zellen und eine IL-21-vermittelte bessere Unterstützungsfunktion der CD8+ Gedächtnis-T-Zellen durch CD4+ T-Zellen in Frage kommen. Zusammenfassend konnten hier neue molekulare Mechanismen, die zur Induktion von IL-1β nach einer MVA-Infektion führen, aufgedeckt werden. Darüber hinaus existieren bereits erste Hinweise auf einen Vorteil der Deletion des IL-1βR für MVA-basierte Vektorimpfstoffe. Die vorliegende Arbeit hat weitere Daten erhoben, die das Erzielen verbesserter Immunantworten nach Immunisierung mit MVA ΔIL-1βR unterstützen, woraus sich neue Ansätze für die Entwicklung MVA-basierter Impfstoffe ergeben könnten.

Regulatory T cell-mediated suppression of Th9 cell development and effector function

T helper (Th) 9 cells are an important subpopulation of the CD4+ T helper cells. Due to their ability to secrete Interleukin-(IL-)9, Th9 cells essentially contribute to the expulsion of parasitic helminths from the intestinal tract but they play also an immunopathological role in the course of asthma. Recently, a beneficial function of Th9 cells in anti-tumor immune responses was published. In a murine melanoma tumor model Th9 cells were shown to enhance the anti-melanoma immune response via the recruitment of CD8+ T cells, dendritic cells and mast cells. In contrast to Th9 effector cells regulatory T cells (Tregs) are able to control an immune response with the aid of different suppressive mechanisms. Based on their ability to suppress an immune response Tregs are believed to be beneficial in asthma by diminishing excessive allergic reactions. However, concerning cancer they can have a detrimental function because Tregs inhibit an effective anti-tumor immune reaction. Thus, the analysis of Th9 suppression by Tregs is of central importance concerning the development of therapeutic strategies for the treatment of cancer and allergic diseases and was therefore the main objective of this PhD thesis.rnIn general it could be demonstrated that the development of Th9 cells can be inhibited by Tregs in vitro. The production of the lineage-specific cytokine IL-9 by developing Th9 cells was completely suppressed at a Treg/Th9 ratio of 1:1 on the transcriptional (qRT-PCR) as well as on the translational level (ELISA). In contrast, the expression of IRF4 that was found to strongly promote Th9 development was not reduced in the presence of Tregs, suggesting that IRF4 requires additional transcription factors to induce the differentiation of Th9 cells. In order to identify such factors, which regulate Th9 development and therefore represent potential targets for Treg-mediated suppressive mechanisms, a transcriptome analysis using “next-generation sequencing” was performed. The expression of some genes which were found to be up- or downregulated in Th9 cells in the presence of Tregs was validated with qRT-PCR. Time limitations prevented a detailed functional analysis of these candidate genes. Nevertheless, the analysis of the suppressive mechanisms revealed that Tregs probably suppress Th9 cells via the increase of the intracellular cAMP concentration. In contrast, IL-9 production by differentiated Th9 cells was only marginally affected by Tregs in vitro and in vivo analysis (asthma, melanoma model). Hence, Tregs represent very effective inhibitors of Th9 development whereas they have only a minimal suppressive influence on differentiated Th9 cells.rn

Evaluation zellulärer Mechanismen der allergen-spezifischen Immuntherapie in einem chronischen Modell der allergischen Atemwegsentzündung

Klinische Studien haben gezeigt, dass die allergenspezifische Immuntherapie (SIT) eine effektive Therapieoption für allergische Erkrankungen ist. Obwohl dieses Therapieverfahren seit über 100 Jahren existiert, sind die zugrunde liegenden Suppressionsmechanismen jedoch nicht vollständig verstanden. Bisher wird angenommen, dass der Behandlungserfolg der SIT auf einer Blockade durch allergenspezifische Antikörper, einer Verschiebung des Th1-Th2-Gleichgewichtes und/oder auf einer Suppression durch regulatorische T-Zellen (Tregs) basiert. Um die Effekte der SIT in einer chronischen Erkrankung in vivo untersuchen zu können, wurde in dieser Doktorarbeit ein Mausmodell für chronisches Asthma entwickelt, das die Situation im Menschen nach einer SIT nachahmt. rnDurch eine SIT war es möglich, allergeninduzierte Asthmasymptome wie Atemwegshyperreagibilität (AHR), Eosinophilie in der Lunge, IgE-Produktion und Atemwegsentzündung im Modell zu unterdrücken. Bemerkenswert ist, dass durch OVA-spezifische Immuntherapie (OVA-IT) ebenfalls eine Verringerung der strukturellen Veränderungen im Lungengewebe im chronischen Krankheitsverlauf erreicht wurde.rnDes Weiteren wurde in diesem Modell nach den Prozessen gesucht, die für die toleranzinduzierende Wirkung der SIT verantwortlich sein können. Dabei wurde im Vergleich zur Placebo-behandelten Gruppe eine erhöhte Antwort spezifischer IgG1-Antikörper, eine verstärkte Th1-Antwort, sowie eine erhöhte Frequenz von FoxP3+ Tregs und von IL-10-produzierenden T-Zellen (Tr1-Zellen) nach OVA-IT festge-stellt. Zur weiteren Untersuchung der von SIT-induzierten T-Zellantworten wurden Mausmodelle des allergischen Asthmas mit einem akuten Verlauf gewählt.rnDie Bedeutung der Th1-Zellen für die SIT wurde in T-bet-/- Mäusen untersucht, welche aufgrund des Fehlens des Transkriptionsfaktors T-bet keine stabile Th1-Antwort induzieren können. Durch SIT war es möglich, allergeninduzierte Asthmasymptome wie AHR, eosinophile Granulozyten in der Lunge, IgE-Produktion und Atemwegsentzündung in den T-bet-/- Tieren im gleichen Maße wie in den Wildtyptieren zu unterdrücken. Diese Untersuchung zeigte, dass die SIT auch ohne funktionelle Th1-Zellen die allergische Entzündung unterdrücken kann. rnDie Rolle der Tregs für die SIT wurde in DO11.10 Mäusen und DO11.10 RAG-/- Mäusen untersucht. In beiden Stämmen konnte nach SIT eine Induktion OVA-spezifischer Tregs nachgewiesen werden. In DO11.10 RAG-/- Mäusen können durch den Knockout im rag2-Gen keine natürlichen, d.h. im Thymus gereiften, Tregs entstehen. Im Blut von DO11.10 RAG-/- Mäusen war direkt nach Durchführung der OVA-IT eine FoxP3+ Treg-Population detektierbar. Demnach wird durch die OVA-IT eine de-novo-Induktion von FoxP3+ Tregs in Gang gesetzt. In Abwesenheit der natürlichen Tregs zeigte sich weiterhin, dass diese Zellen zur Produktion von IL-10 in T-Zellen und somit zum Erfolg der SIT beitragen.rnDie Rolle der FoxP3+ Tregs bei der SIT wurde in DEREG Mäusen untersucht. Eine Depletion der FoxP3+ Tregs in DEREG Mäusen während der Durchführung der OVA-IT hob die protektiven Effekte der Therapie jedoch nur teilweise auf. rnUm die Rolle des regulatorischen Zytokins IL-10 bei der SIT zu untersuchen, wurde ein blockierender Antikörper gegen den IL-10-Rezeptor (anti-IL-10R) im chronischen Modell des allergischen Asthmas mit SIT angewendet. Anti-IL-10R hob die protektive Wirkung der SIT auf die AHR, die Atemwegsentzündung und die strukturellen Veränderungen im Lungengewebe auf. Somit ist die protektive Wirkung der SIT abhängig vom IL-10-Signalweg.rnZusammenfassend stellt diese Arbeit die Bedeutung der SIT für allergische Erkrankungen heraus. SIT kann durch die positive Beeinflussung der allergiebedingten, strukturellen Veränderungen in der Lunge auch für Asthmapatienten große Vorteile bringen. Die aus Studien bekannten Mechanismen konnten im Modell bestätigt werden und wurden im weiteren Verlauf untersucht. Die Arbeit stellt im Besonderen die Bedeutung der IL-10-produzierenden und FoxP3+ Tregs für die Effektivität der SIT in den Vordergrund. Zudem ist durch die Etablierung eines neuen Mausmodells der SIT für chronisches allergisches Asthma ein Mittel zur weiteren Erforschung der zugrunde liegenden Prozesse dieser erfolgreichen Therapie geschaffen worden. rn

Induktion tolerogener dendritischer Zellen zur Suppression von experimenteller autoimmuner Enzephalomyelitis und Kontaktallergie

Dendritische Zellen (DC) spielen als professionelle antigenpräsentierende Zellen (APC) eine zentrale Rolle in der Aktivierung und Regulierung antigenspezifischer Immunantworten. Aus diesem Grund wird der therapeutische Einsatz von DC zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen und Allergien sowie zur Tumorbekämpfung erforscht. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit untersuchten wir das Potenzial einer biolistischen DNA-Vakzinierung zur Induktion tolerogener DC in vivo. Im Tiermodell der Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein Peptid 35-55 (MOGp35-55) induzierten experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) sollte mittels präventiver biolistischer Kovakzinierung von Plasmid-DNA kodierend für MOG und die immunregulatorischen Zytokine TGFβ oder IL-10 eine protektive Immunität induziert werden. Die MOG-Expression stand dabei entweder unter der Kontrolle des ubiquitär aktiven CMV-Promotors oder des murinen Fascin-Promotors, um eine ektopische MOG-Expression spezifisch in dermalen DC und Langerhanszellen zu erreichen. Dass MOGp35-55-präsentierende DC nach biolistischer DNA-Vakzinierung von der Haut in die drainierenden Lymphknoten migrieren und dort T-Zellen aktivieren, konnte im Vorfeld anhand einer substanziellen Proliferation von MOGp35-55-reaktiven 2D2 T-Zellen nachgewiesen werden. Im präventiven Ansatz der MOGp35-55-induzierten EAE zeigten Mäuse, die mit MOG-kodierenden Plasmiden biolistisch transfiziert wurden, eine leicht reduzierte EAE-Symptomatik. Die Kotransfektion von MOG und TGFβ führte zu einer Verstärkung der EAE-Suppression – unabhängig davon, ob die MOG-Expression unter der Kontrolle des CMV- oder des Fascin-Promotors stand. Interessanterweise resultierte die Koapplikation von MOG- und IL-10-kodierender Plasmid-DNA nur bei DC-fokussierter MOG-Expression zu reduzierter EAE-Symptomatik. Für biolistische DNA-Vakzinierungen stellt somit der Fascin-Promotor eine potente Alternative zu viralen Promotoren dar. Entsprechend der milderen EAE-Symptome beobachteten wir bei behandelten EAE-Mäusen einen geringeren Grad an Demyelinisierung sowie eine reduzierte Infiltration des ZNS mit IFNγ-produzierenden CD4+ Th1- und IL-17-produzierenden CD4+ Th17-Zellen. Desweiteren zeigten Milzzellen ex vivo nach MOGp35-55-Restimulation eine inhibierte Proliferation und eine signifikant reduzierte IFNγ- und IL-17-Zytokinproduktion. Überraschenderweise ging die antigenspezifische Immunsuppression nicht mit der Expansion von Foxp3+ regulatorischen T-Zellen einher. Da die Milzen aber erhöhte Mengen an CD8+IFNγ+ T-Zellen aufweisen, könnte ein zytotoxisch-suppressiver Mechanismus für die Inhibition der Th1- und Th17-Immunantwort verantwortlich sein. Nachfolgende Untersuchungen sind notwendig, um die induzierten immunologischen Mechansimen mittels biolistischer DNA-Vakzinierung aufzuklären. Der zweite Teil der Arbeit befasst sich mit der Generierung von tolerogenen DC in vitro. Dafür wurden murine Knochenmarkszellen unter DC-differenzierenden Bedingungen in Gegenwart des synthetischen Glucocorticoids Dexamethason (DEX) kultiviert. Die DEX-Zugabe führte zur Differenzierung von APC mit geringer CD11c-Expression. DEX-APC waren in vitro weitestgehend gegen LPS stimulierungsresistent und zeigten eine reduzierte Expression von MHC-II und den kostimulatorischen Molekülen CD80, CD86 und CD40. Ihrem tolerogenen Phänotyp entsprechend besaßen DEX-APC ein geringeres syngenes T-Zellstimulierungspotenzial als unbehandelte BM-DC. Anhand der erhöhten Oberflächenexpression von CD11b, GR1 und F4/80 besteht eine phänotypische Ähnlichkeit zu myeloiden Suppressorzellen. Die Fähigkeit von DEX-APC in vivo antigenspezifische Toleranz zu induzieren, wurde durch einen therapeutischen Ansatz im murinen Krankheitsmodell der Kontaktallergie überprüft. Die therapeutische Applikation von DEX-APC führte hierbei im Vergleich zur Applikation von PBS oder unbehandelten BM-DC zu einer signifikant reduzierten Ohrschwellungsreaktion. Zusammenfassend demonstrieren die Ergebnisse dieser Arbeit, dass potente tolerogene DC sowohl in vivo als auch in vitro induziert werden können. Dass diese Zellpopulation effektiv antigenspezifische Immunreaktionen supprimieren kann, macht sie zu einem vielversprechenden Werkzeug in der Behandlung von Autoimmunerkrankungen und Allergien.rn

Analyse des anti-inflammatorischen Pilzmetaboliten S-Curvularin in verschiedenen Modellen der rheumatoiden Arthritis

An der Entwicklung und Aufrechterhaltung chronisch-inflammatorischer Erkrankungen wie der rheumatoiden Arthritis (RA) ist die Fehlregulation verschiedener pro-inflammatorischer Gene von entscheidender Bedeutung. Bei der RA führt unter anderem eine erhöhte Expression der induzierbaren NO-Synthase (iNOS) zu einer gesteigerten NO-Produktion, was schließlich zum Knochenabbau beiträgt. Für eine Therapie der RA werden häufig Glukokortikoide eingesetzt, die jedoch viele Nebenwirkungen zeigen. Um eine mögliche Therapiealternative zu identifizieren, sollten die Effekte des anti-inflammatorisch wirksamen Pilzmetaboliten S-Curvularin in verschiedenen Modellen der RA analysiert werden.rnIn humanen C-28/I2-Chondrozyten als in vitro-Modell der RA führte die Inkubation mit einem Zytokingemisch zu einer Induktion der iNOS-Expression, die vom chondrogenen Differenzierungsgrad der Zellen abhängig war. Entscheidend für die iNOS-Induktion in C-28/I2-Zellen ist hauptsächlich der p38-MAPK-, der JAK-STAT- und der NF-kappa B-Signaltransduktionsweg. Eine Inkubation der Zellen mit S-Curvularin führte zu einer deutlichen Hemmung der iNOS-Expression. Dexamethason hatte hingegen keinen Effekt auf die iNOS-Expression, was vermutlich auf die fehlende Expression der Glukokortikoidrezeptor-mRNA zurückgeführt werden kann. Daher können von S-Curvularin abgeleitete Pharmaka möglicherweise auch in Fällen einer Steroidresistenz zur Therapie von RA-Patienten zum Einsatz kommen.rnIm Tiermodell der Kollagen-induzierten Arthritis konnte die anti-inflammatorische Wirkung von S-Curvularin auf mehreren Ebenen bestätigt werden. Die Pilzsubstanz reduzierte sowohl die Schwellung der Pfoten als auch die Expression CII-induzierter pro-inflammatorischer Gene, wie z.B. S100A8, Defb6, Camp und Mpo. Dabei waren die Effekte von S-Curvularin meist deutlicher als in Dexamethason-behandelten Mäusen. Die Analyse von Zytokinen (z.B. TNF-alpha, IL-1beta) und Chemokinen (z.B. MCP-1, MIP-1alpha) zeigte, dass die CII-induzierte Expression dieser pro-inflammatorischen Mediatoren in den Pfoten der Mäuse durch eine Therapie mit S-Curvularin und Dexamethason wieder reduziert werden konnte, wobei Unterschiede zwischen den Behandlungen beobachtet werden konnte.rnAuch im Tiermodell der LPS-induzierten akuten Entzündung wurde die iNOS- und die S100A8-Expression in verschiedenen Geweben S-Curvularin reduziert. rnrnS-Curvularin ist also in der Lage, in verschiedenen Modellen der RA und im akuten Entzündungsmodell die pro-inflammatorische Genexpression effizient zu hemmen und könnte somit in Zukunft eine Rolle in der Therapie der RA einnehmen.rn