Untersuchung der TNF-alpha vermittelten IFN-beta Signaltransduktion in malignen und nicht-malignen HPV positiven Zellen

Bestimmte humane Papillomviren sind an der Entstehung von Zervixkarzinomen beteiligt. In dieser Arbeit wird gezeigt, da�� maligne HPV-positive Zellen ihre F��higkeit zur Induktion von endogenem IFN-beta nach TNF-alpha verloren haben. Durch Infektion mit Encephalomyocarditis Virus (EMCV) oder Vesicular Stomatitis Virus (VSV) wurde die Induzierbarkeit des endogenen IFN-beta durch TNF-alpha in nicht-tumorigenen Zellen best��tigt. Alle malignen Zellinien zeigten eine intakte IFN Signaltransduktion, wenn Typ I oder Typ II Interferone exogen supplementiert wurden. Dies zeigt, da�� in tumorigenen Zervixkarzinomzellen die Kommunikation zwischen TNF-alpha und IFN-beta

Die Rolle der IFN-gamma Signal��bertragung und von MyD88 in der Angiotensin-II-induzierten vaskul��ren Dysfunkion, Inflammation und arteriellen Hypertonie

Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Rolle von myelomonozyt��ren Zellen, IFN-gamma (Interferon gamma), MyD88 (myeloid differentiation factor 88) und zugrundeliegenden Signalwege in der Angiotensin II (ATII)-induzierten vaskul��ren Inflammation, Dysfunktion und arteriellen Hypertonie untersucht. Wie bereits ver��ffentlichte Vordaten aus meiner Arbeitsgruppe zeigten, sch��tzt die Depletion von Lysozym M (LysM)+ myelomonozyt��ren Zellen (Diphteriatoxin-vermittelt in M��usen, die transgen f��r den humanen Diphtheriatoxin-Rezeptor sind, LysMiDTR M��use) vor der ATII-induzierten vaskul��ren Dysfunktion und arterieller Hypertonie, und kann durch adoptiven Zelltransfer von Wildtyp Monozyten wiederhergestellt werden. In meiner Arbeit konnte ich zeigen, dass die Rekonstitution von Monozyten-depletierten LysMiDTR M��usen mit Wildtyp Monozyten den Ph��notyp der vaskul��ren Dysfunktion wiederherstellen kann, die Rekonstitution mit gp91phox-/y oder Agtr1-/- Monozyten jedoch nicht. Die Hypertonus-mediierenden Effekte dieser infiltrierenden Monozyten scheinen demnach von der intakten ATII und NADPH Oxidase Signal��bertragung in diesen Zellen abh��ngig zu sein. Vermutlich ebenfalls f��r die Aktivierung der Monozyten funktionell wichtig sind IFN-gamma, produziert durch NK-Zellen, und der Transkriptionsfaktor T-bet (T-box expressed in T cells), exprimiert von NK-Zellen und Monozyten. IFN-gamma-/- M��use waren partiell gesch��tzt vor der ATII-induzierten vaskul��ren Dysfunktion und charakterisiert durch reduzierte Level an Superoxid im Gef���� im Vergleich zu ATII-infundierten Wildtyp M��usen. IFN-gamma-/- und T-bet defiziente Tbx21-/- M��use zeichneten sich ferner durch eine reduzierte ATII-mediierte Rekrutierung von NK1.1+ NK-Zellen, als ein Hautproduzent von IFN-gamma, sowie CD11b+GR-1low Interleukin-12 (IL-12) kompetenten Monozyten aus. Durch Depletions- und adoptive Transferexperimente konnte ich in dieser Arbeit NK-Zellen als essentielle Mitstreiter in der vaskul��ren Dysfunktion identifizieren und stellte fest, dass T-bet+LysM+ myelomonozyt��re Zellen f��r die NK-Zellrekrutierung in die Gef����wand und lokale IFN-gamma Produktion ben��tigt werden. Damit wurde erstmals NK-Zellen eine essentielle Rolle in der ATII-induzierten vaskul��ren Dysfunktion zugeschrieben. Au��erdem wurde der T-bet-IFN-gamma Signalweg und die gegenseitige Monozyten-NK-Zellaktivierung als ein potentielles therapeutisches Ziel in kardiovaskul��ren Erkrankungen aufgedeckt. Des Weiteren identifizierte ich in meiner Arbeit MyD88 als ein zentrales Signalmolek��l in der ATII-getriebenen Inflammation und vaskul��ren Gef����sch��digung. MyD88 Defizienz reduzierte den ATII-induzierten Anstieg des systolischen Blutdrucks und die endotheliale und glattmuskul��re vaskul��re Dysfunktion. Zus��tzlich waren die vaskul��re Superoxid-Bildung sowie die Expressionslevel der NADPH Oxidase, der wichtigsten Quelle f��r oxidativem Stress im Gef����, in ATII-infundierten MyD88-/- M��usen im Vergleich zum Wildtyp reduziert. Mit Hilfe von durchflusszytometrischen Analysen deckte ich zudem auf, dass die ATII-induzierte Einwanderung von CD45+ Leukozyten, insbesondere CD11b+Ly6G-Ly6Chigh inflammatorischen Monozyten in MyD88-/- M��usen signifikant abgeschw��cht war. Diese Resultate wurden durch immunhistochemische Untersuchung von Aortengewebe auf CD68+, F4/80+ und Nox2+ Makrophagen/Phagozyten sowie Expressionsanalysen von Inflammationsmarkern untermauert. Analysen der mRNA Expression in Aortengewebe zeigten ferner eine in Wildtyp M��usen nach ATII Infusion tendenziell gesteigerte Expression von inflammatorischen Monozytenmakern sowie eine abnehmende Expression von reparativen Monozytenmarken, w��hrend dieser Shift zu einem proinflammatorsichen Ph��notyp in MyD88-/- blockiert zu sein schien. Dies zeigt eine Rolle von MyD88 in der terminalen Differenzierung von myelomonozyt��ren Zellen an. Um dies weitergehend zu untersuchen und aufzudecken, ob die MyD88 Effekte abh��ngig sind von Zellen der h��matopoetischen Linie oder Gewebszellen, wurden Knochenmarktransferexperimente durchgef��hrt. MyD88 Defizienz in Knochenmark-abstammende Zellen reduzierte die ATII-induzierte vaskul��re Dysfunktion und Infiltration der Gef����wand mit CD45+ Leukozyten und inflammatorischen myelomonozyt��ren Zellen. Die protektiven Effekte der MyD88 Defizienz in der Angiotensin II-induzierten Inflammation konnten nicht auf Signalwege ��ber die Toll-like Rezeptoren TLR2, -7 oder -9 zur��ckgef��hrt werden, wie die Untersuchung der vaskul��ren Reaktivit��t entsprechender Knockout M��use zeigte. Zusammenfassend konnte ich in meiner Arbeit zeigen, dass die Infiltration der Gef����wand mit Nox2+AT1R+T-bet+MyD88+ myelomonozyt��ren Zellen und die Wechselwirkung und gegenseitige Aktivierung dieser Zellen mit IFN-gamma produzierenden NK-Zellen eine zentrale Bedeutung in der Pathogenese der Angiotensin II (ATII)-induzierten vaskul��ren Dysfunktion, Inflammation und arteriellen Hypertonie einnehmen.

Transkriptionelle Regulation des humanen Interferon-gamma-Promotors in T-Lymphocyten

Interferon-gamma is mainly produced by activated T helper cells and cytotoxic T lymphocytes and sustains the immune-defense against viral and bacterial infections. For a better understanding of IFN-gamma promoter regulation in T cells, different DNA-binding motivs were examined. Hereby, a new motiv (-196 to -183) was identified, that binds to the transcription factor AP-1 in T helper cells and Jurkat T cells. This factor acts as an essential activator protein. Further investigation demonstrated that IL-12 and IL-18 induce different regulatory pathways. Both AP-1 and STAT-4 bindings at their cognate DNA elements (-196 to -183 and -224 to -215) are required for the IL-12 dependent activation whereas IL-18 causes direct activation via AP-1.Moreover, the TH2 cytokine IL-4 represses significantly the IFN-gamma promoter activity in CD4+ T cells. IL-4 induces GATA-3, that interacts with two DNA-motivs (-111 to -87) at the IFN-gamma promoter.Furthermore, transgenic mice were generated, yielding a human IFN-gamma promoter construct (410 bp) under the control of a luciferase reporter gene. The data demonstrated a specific IFN-gamma promoter activation by antiCD3 plus antiCD28 in CD4+ and CD8+ T cells. The luciferase activty in CD4+ T cells was reinforced by addition of IL-12 and IL-18 and repressed by IL-4.

Studien zur Immunregulation am Beispiel der Kollagen-Typ-II-induzierten Arthritis

Die Immunisierung von M��usen bestimmter St��mme (z.B. DBA/1) mit Kollagen-Typ-II (CII) f��hrt zu Gelenkentz��ndungen, die in ihrem Verlauf der Rheumatoiden Arthritis beim Menschen ��hnlich sind. Viele Untersuchungen deuten darauf hin, da�� vor allem TH1-Zellen entscheidend an der Entstehung einer CIA beteiligt sind. In diesem Zusammenhang ist IL-12, das an der Induktion der TH1-Zellantwort beteiligt ist, von herausragender Bedeutung. Zur Kl��rung der Funktion von IL-12 wurde ein IL-12-Antagonist, (IL-12(p40)2), der aus einem Homodimer der IL-12p40-Kette besteht, in vivo eingesetzt. DBA/1-M��use, die transgen f��r die T-Zellrezeptor ��-Kette eines CII-spezifischen, arthritogenen T-Zellklons sind und infolge dessen eine CIA mit 100%-iger Inzidenz, fr��hem Auftreten und einem schweren chronischen Verlauf entwickeln, wurden mit IL-12(p40)2 behandelt. Die Behandlung von TCR-��tg-M��usen mit IL-12(p40)2 verz��gerte die Entwicklung einer CIA und f��hrte zu deutlich abgeschw��chten Krankheitssymptomen, konnte aber nicht die Induktion einer CIA verhindern. Dar��ber hinaus produzierten die Milzzellen der IL-12(p40)2-behandelten Gruppe nach einer Stimulation mit CII geringere Menge an IFN-g, verglichen mit Kontrollgruppe. Somit resultiert aus einer in vivo Neutralisation von IL-12 eine supprimierte Entwicklung von CII-spezifischen TH1-Zellen. Diese Ergebnisse lassen darauf schlie��en, da�� endogen gebildetes IL-12 bei der Induktion einer CIA eine wichtige Rolle spielt, indem es die Differenzierung von TH1-Zellen f��rdert und die Produktion von IFN-g steigert. Hinsichtlich der Funktion von IFN-g bei der CIA gibt es allerdings widerspr��chliche Befunde. Zur Kl��rung der Funktion von IFN-g wurden die TCR-��tg-M��use mit M��usen gekreuzt, die defizient f��r die Produktion von IFN-g (IFN-g KO) sind. Es zeigte sich, da�� keine der verwendeten F2 (IFN-g KO, TCR-��tg)-M��use nach Immunisierung Symptome einer CIA entwickelten. Somit scheint IFN-g essentiell f��r die Entstehung einer CIA zu sein. Unerwarteterweise f��hrte aber auch die Behandlung mit IL-12 von F2 (IFN-g KO,TCR-��tg)-M��usen in 50% der Tiere zur Entwicklung einer CIA. Da solche M��use kein IFN-g bilden k��nnen, kann IL-12 auch unabh��ngig von IFN-g die Induktion einer CIA vermitteln. IL-12 scheint somit eine zweifache Bedeutung bei der Entstehung einer CIA zuzukommen, zum einen als direkter Induktor, wie am Beispiel der F2 (IFN-g KO, TCR-��tg)-M��use nachgewiesen wurde, und zum anderen als starker Promoter der IFN-g-Bildung in normalen M��usen.

Regulation und funktionelle Bedeutung der zellul��ren und humoralen Immunantwort in der Pathogenese der chronischen Hepatitis C Virusinfektion

Patienten mit akuter, selbstlimitierender HCV-Infektion und solche mit IFN-a Therapieresponse (SCR) zeigten eine hochregulierte NS3-spezifische T-Helferzellantwort.��ber die funktionelle Bedeutung der T-Helferzellantwort und der Antik��rpersynthese besteht jedoch noch Unklarheit.In dieser Studie wurde die proliferative Antwort der PBMC von Patienten mit anhaltender Therapieresponse (SCR; n=8), Non-Respondern (NR; n=13) und unbehandelten HCV-Patienten(UTR; n=10) sowie gesunden Kontrollen (HC; n=5) auf die rekombinanten HCV-Antigene Core, Helicase, NS3, NS4 und NS5-4 bestimmt und ihre Sekretion von IFN-.

Immune escape durch ��berexpression von HER-2/neu

In Tumoren und Onkogen-transformierten Zellen finden sich h��ufig Defizienzen in der Expression von Komponenten der MHC Klasse I-Antigenprozessierung, die mit einer verminderten MHC Klasse I-Oberfl��chenexpression und einer reduzierten Sensitivit��t der Zellen gegen��ber einer ZTL-vermittelten Lyse gekoppelt sein k��nnen. Da in den meisten F��llen die reduzierten Expressionsmuster ��ber Zytokine revertiert werden k��nnen, werden verschiedene Regulationsmechanismen als Ursache f��r die Defizienzen postuliert. Auch in Zellen, die den ���human epidermal growth factor receptor 2��� (HER-2/neu) ��berexprimieren, wurden derartige ���Immune escape���-Mechanismen identifiziert. Aufgrund der Amplifikation und/oder ��berexpression dieses Onkogens in Tumoren, die mit einer schnellen Progression der Erkrankung und einer schlechten Heilungsprognose assoziiert ist, wurden zahlreiche Therapien entwickelt, die auf einer Mobilisierung des Immunsystems gegen��ber HER-2/neu oder dessen Blockade durch spezifische Antik��rper abzielen. Die bisher jedoch nur unzureichenden Erfolge dieser Therapien k��nnten ihre Ursache in einer verminderten Immunogenit��t der HER-2/neu+-Zellen aufgrund von Defizienzen in der MHC Klasse I-Antigenprozessierung haben, weshalb die Untersuchung der molekularen Ursachen dieser Suppression f��r die Therapie von HER-2/neu+-Tumoren von besonderer Bedeutung ist. In dieser Arbeit wurde anhand eines in vitro-Systems ein HER-2/neu-vermittelter ���Immune escape���-Ph��notyp charakterisiert und die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen untersucht. Hierzu wurden murine, HER-2/neu--NIH3T3-Zellen mit HER-2/neu-transfizierten NIH3T3-Zellen verglichen. Die Untersuchung zeigte, dass die Oberfl��chenexpression von MHC Klasse I-Antigenen bei einer HER-2/neu-��berexpression vermindert ist. Dies ist assoziiert mit reduzierten Expressionen von LMP2, LMP10, PA28a, PA28b, ERAAP, TAP1, TAP2, und Tapasin, einem blockiertem TAP-Transport und einer fehlenden Sensitivit��t gegen��ber einer ZTL-vermittelten Lyse. Da die analysierten Defekte durch eine Stimulation mit IFN���g wieder revertiert werden k��nnen, wird eine transkriptionelle oder translationelle Regulation der betroffenen Gene durch HER-2/neu postuliert. Aufgrund dieser Ergebnisse ist eine T-Zell-vermittelte Therapie von HER-2/neu+-Tumoren als kritisch anzusehen. Die Untersuchung der Promotoren von TAP1/LMP2, TAP2 und Tapasin ergab geringere und durch IFN���g-induzierbare Promotoraktivit��ten in den HER-2/neu+-Zellen im Vergleich zu den HER-2/neu���-Zellen. Mittels Mutagenese-PCR und Gelretardationsanalysen konnte die Bindung eines Komplexes an zwei E2F- und einer P300-Bindungsstelle im Tapasin-Promotor identifiziert werden, die f��r die HER-2/neu-vermittelte Hemmung der Tapasin-Promotor��aktivit��t essentiell ist. Eine Inaktivierung der E2F- und P300-Motve in den TAP1/LMP2- und TAP2-Promotoren hatte dagegen keinen Einfluss auf die HER-2/neu-vermittelte Blockade der Promotoraktivit��t. Ein Vergleich der Promotoraktivit��ten der HER-2/neu+- mit Ras-transformierten Zellen ergab, dass die TAP1/LMP2- und TAP2-Promotoren in beiden Zellen supprimiert werden, w��hrend der Tapasin-Promotor bei Ras-Transformation nicht beein��tr��chtigt ist. Der Einsatz von Inhibitoren zeigte, dass die Suppression des Tapasin-Promotors vermutlich ��ber die PLC-g-PKC-Kaskade erfolgt. Dagegen konnte mit Inhibitoren gegen MAPK und PI3Kinase kein vergleichbarer Effekt erzielt werden. Aufgrund dieser Daten wird postuliert, dass HER-2/neu ��ber die Signalkaskade PLC-g���PKC���E2F/P300 die Tapasin-Promotoraktivit��t supprimiert, wohingegen noch bisher unbekannte Signalkaskaden von HER-2/neu und Ras zu einer Hemmung der TAP1/LMP2- und TAP2-Promotoraktivit��t f��hren. Da die Komplexbildung von E2F und P300 auch im Zellzyklus eine Rolle spielt, wird eine negative Korrelation zwischen Zell-Proliferation und MHC Klasse I-Antigenpr��sentation postuliert, die Gegenstand k��nftiger Studien sein wird.

Strukturelle und funktionelle Untersuchungen zur Bedeutung der endogenen retroviralen Insertion HERV-K(C4) im C4-Gen des Menschen

Der L��ngenpolymorphismus des C4-Gens beruht auf der An- oder Abwesenheit einer 6.4 kb langen Insertion im Intron 9. Es handelt sich dabei um einen eigenst��ndigen bisher noch nicht beschriebenen Virus-Typ, der alle Sequenzmerkmale der Familie der humanen endogenen Retroviren (HERV) tr��gt und zu den HERV-K Viren geh��rt. Der Provirus wurde als HERV-K(C4) bezeichnet. Die Orientierung dieses retroviralen Elements ist entgegengesetzt zu der Transkriptionsrichtung des C4-Gens. Mittels RT-PCR, RNase Protection Assays und Northern-Blot Analysen konnte der Nachweis von HERV-K(C4)-Antisense mRNA-Transkripten in verschiedenen humanen Zellinien und Geweben erbracht werden. Die retroviralen Transkripte schlossen am 5'- und 3'-Ende Sequenzen des C4-Exon 9 und Exon 10 ein, so da�� diese wahrscheinlich "readthrough" Transkripte darstellen, die durch einen 5' des LTR2 gelegenen Promotor initiiert oder im Zusammenhang mit der C4-Expression transkribiert und reguliert werden. Weiterhin konnten insgesamt 4 HERV-K(C4)-mRNA Spezies, einschlie��lich einer Voll��ngen-RNA detektiert werden. Die drei subgenomischen mRNAs werden vermutlich durch einfaches und mehrfaches Splei��en generiert. Die quantitative Analyse in verschiedenen humanen Zellinien ergab, da�� HERV-K(C4) durchschnittlich mit einer Kopienanzahl zwischen ca.1 bis 100 Transkripten in einer Zelle vorkommt, so da�� es sich um low abundance mRNAs handelt. Mittels eines Reportergen-System konnte eine Aktivit��t des LTR2-Promotors in der Sense-Orientierung des Retrovirus nachgewiesen werden, die nach Stimulation mit IFN-��� signifikant abnahm. Ein humanes Modell-Systems wurde etabliert, um die Theorie einer Antisense-Abwehr gegen exogene Retroviren in HepG2-Zellen zu ��berpr��fen. Die Theorie basiert auf dem Nachweis von HERV-K(C4)-Antisense-Transkripten, die ��ber eine Heteroduplexbildung mit der Sense-mRNA von verwandten, infekti��sen Retroviren eine m��gliche Blockierung deren Translation erwirken k��nnten. Es konnte eine signifikante Abnahme der retroviralen Expression von bis zu 45% nach steigenden Dosen an IFN-��� in HepG2-Zellen nachgewiesen werden. Der funktionell aktive 3'-LTR-Sense Promotor sowie der Nachweis von HERV-K(C4)-Antisense Transkripten sprechen f��r die bedeutende Rolle von HERV-K(C4) bei der Genregulation und Schutz gegen exogene Retroviren, wodurch eine Selektion stattgefunden hat.

Charakterisierung von T-Zell-Antworten gegen humane Nierenzellkarzinome sowie Identifizierung von HLA-G als tumorassoziiertes Antigen und Immunevasionsmechanismus des Nierenzellkarzinoms

Humane Nierenzellkarzinom-(NZK)-Zelllinien wurden etabliert, um sie zur Generierung von autologen zytotoxischen T-Zelllinien einzusetzen. Erst nach Modifikation mit dem kostimulierenden B7-1-Molek��l wurden mit der NZK-Zelllinie MZ1257RC autologe, tumorspezifische T-Zelllinien generiert und charakterisiert. Die Aufkl��rung eines T-Zell-definierten TAA eines autologen, zytotoxischen T Zellklons wurde mittels Expressionsklonierung einer hergestellten cDNS-Expressionsbank begonnen. Nach in vitro-Sensibilisierung von peripheren Blutmonozyten mit der autologen NZK-Zelllinie MZ2733RC wurde die HLA-Klasse I-restringierte T Zelllinie XIE6 generiert, die die autologe und verschiedene allogene NZK- sowie Zervixkarzinom-Zelllinien, jedoch nicht autologe Nierenzellen lysiert. Die T Zellen exprimieren TZR V��13.6-Ketten und sezernieren GM-CSF und IL-10 nach Antigenstimulation. Jedoch ist die NZK-Zelllinie MZ2733RC wenig sensitiv gegen��ber autologen und allogenen Effektorzellen. Erst die Blockade ihrer HLA Klasse I-Molek��le auf der Zelloberfl��che erh��ht ihre Sensitivit��t gegen��ber allogenen lymphokin-aktivierten Killer-Zellen. Verantwortlich daf��r k��nnen nicht-klassische HLA Klasse Ib-Molek��le, insbesondere HLA-G sein, dessen Transkripte in der RNS der NZK-Zellen, jedoch nicht in Nierenzellen detektiert wurden. In einer detaillierten Studie wurden HLA-G-Transkripte in NZK-Zelllinien (58%), in NZK-Biopsien (80%), und nur in wenigen Nierenepithelbiopsien (10%) nachgewiesen. In der NZK-Zelllinie MZ2733RC wurde eine konstitutive HLA-G1-Proteinexpression beobachtet, die durch eine IFN-��-Behandlung induzierbar ist.

The role of Interleukin-12 in liver inflammation

Chronic liver inflammation during viral hepatitis is a major health problem worldwide. The role of proinflammatory cytokines, like IL-12, in breaking hepatic immune tolerance, and inducing acute liver inflammation and virus clearance is not clear. Nor is clear its role in uncontrolled severe inflammatory response, leading to fulminant hepatitis and hepatic failure. This work, focused in the study of the role of endogenous produced IL-12 in inducing hepatic inflammatory responses, demonstrates: In vitro, using adenovirus coding for IL-12, that hepatocytes stimulate CD4+ T cells in a tolerogenic manner, and that endogenous IL-12 is able to switch the immune response into Th1; and in vivo, that endogenous IL-12 induces hepatocyte damage and virus elimination in mice infected with adenovirus. In addition, and in order to study in vivo the relevance of IL-12 in acute inflammation, conditional IL-12 transgenic mice expressing IL-12 in the liver after cre-recombinase mediated induction were generated. For this purpose, an IL-12 fusion protein was created, which demonstrated high levels of bioactivity. Induction of IL-12 expression during embryonic development was achieved by crossbreeding with Act-Cre transgenic mice; induction of IL-12 expression in adult mice was achieved by a plasmid coding for the cre-recombinase. This study demonstrates that after induction, IL-12 is expressed in the liver of the transgenic mice. It also demonstrates that hepatic expression of IL-12 induces splenomegaly and liver inflammation, characterized by large infiltrations in portal tracts and veins, associated with hepatic damage, necrosis areas and lethality. Furthermore, constitutive hepatic IL-12 expression does not lead to abortion, but to total lethality, short after delivery. In conclusion, in this study, a transgenic mouse model has been generated, in which the expression of active IL-12 in the liver can be induced at any time; this model will be very helpful for studying hepatic pathologies. This study has also demonstrated that hepatic produced IL-12 is able of breaking liver tolerance inducing inflammation, virus elimination, severe hepatocyte damage, and lethality. These findings suggest IL-12 as a key cytokine in acute liver inflammation and fulminant hepatic failure. 5.1 Future studies Once the importance of IL-12 in inducing hepatic inflammation and virus elimination was demonstrated in this study, understanding the mechanisms of the IL-12 induced liver damage, and more important, how to avoid it will be the main focus in the future. It is very important to achieve hepatic inflammation for a more effective and faster viral elimination, but avoiding the toxicity of IL-12, which leads to massive liver injury and lethality is obviously necessary to allow IL-12 as therapy. For that purpose, future studies will be mainly base on three different points: 1. The determination of different cell populations present in the hepatic infiltration, which of them are responsible for liver injury, and as well their state of activation. 2. The measure of other pro- and anti-inflammatory cytokines and chemokines, which can play a role in IL-12-induced liver inflammation and hepatocyte damage. For these purposes, specific blocking antibodies (anti TNF-alpha, anti IL-12, anti IFN-g) will be used. The study with different transgenic mice: TNF-alpha Receptor knockout, TGF-b, will also help in determining the role of those cytokines during IL-12-induced liver damage and lethality. 3. The establishing of liver pathology models (viral infection, tumours, auto-antigens) in mice. Induction of IL-12 at any time of the pathology development will help in clarifying the role of IL-12 in those models. Finally, the transgenic mice expressing IL-23 in the liver will be generated.

Hepatische ��berexpression des Interleukin-18 in transgenen M��usen und dessen biologische und immunologische Funktion

In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle von Interleukin-18 (IL-18) in der Leber untersucht. IL-18 wurde eine Bedeutung bei verschiedenen Lebererkrankungen zugeschrieben, die genauen Mechanismen sind jedoch nicht gekl��rt. IL-18 kann ein wesentlicher Faktor bei der Regulierung des Th1/Th2-Gleichgewichts in der Leber sein. Es wurden transgene M��use mit konstitutiver ��berexpression der inaktiven Form von IL-18 (proIL-18) sowie transgene M��use mit Expression der aktiven Form von IL-18 ohne Signalpeptid (FLAG-IL-18) und mit Signalpeptid (SP-IL-18) in Hepatozyten unter der transkriptionellen Kontrolle des murinen Albumin-Promoters etabliert. In eigenen Vorarbeiten wurde eine konstitutive Expression von proIL-18 in Wildtyp-Hepatozyten festgestellt. Bei der ��berexpression von proIL-18 in Hepatozyten zeigte sich eine Akkumulierung des Proteins in der Zelle und eine spontane entz��ndliche und fibrotische Aktivit��t in der Leber. Die Expression der aktiven Form von IL-18 ohne Signalpeptid (FLAG-IL-18) in Hepatozyten f��hrte zu einer Speicherkrankheit in der Leber. Das Fusionieren des aktiven Teils von IL-18 mit IgG-k-Leadersequenz (SP-IL-18) erm��glichte die Sezernierung von IL-18 aus der Zelle ohne Einflu�� auf die Produktion von IFN-g, TNF-a, IL-4 sowie Transaminasen. Die Rolle von IL-18 bei einem LPS-abh��ngigen Leberschaden mit und ohne Pr��konditionierung mit CpG-Oligonukleotiden in vivo wurde untersucht. Die Behandlung proIL-18-transgener M��use mit LPS f��hrte zur Sezernierung von biologisch aktivem IL-18 aus Hepatozyten. IL-18 hatte bei proIL-18- sowie bei SP-IL-18-transgenen M��usen nach der LPS-Gabe keinen Einflu�� auf die Lebersch��digung und Produktion von IFN-g, TNF-a, IL-4. Nach sequenzieller Behandlung mit CpG und LPS fand sich bei SP-IL-18-transgenen Tieren im Gegensatz zu proIL-18-transgenen M��usen eine st��rkere Produktion von GOT, IFN-g und TNF-a im Vergleich zu Wildtyptieren. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, da�� IL-18 alleine keine hepatotoxische Wirkung und keinen Einflu�� auf die Produktion von IFN-g, TNF-a, IL-4 hat, wof��r ein zus��tzlicher Stimulus notwendig ist. Die in der vorliegenden Arbeit etablierten proIL-18- und SP-IL-18-transgenen Mausmodelle liefern die Grundlage zu weiteren Untersuchungen der Rolle von IL-18 in der Leber bei der Immunmodulation.

Molekulare Reaktionsmuster in dendritischen Zellen nach Allergenexposition

Allergische Erkrankungen, wie zum Beispiel die allergische Rhinitis oder das allergische Asthma haben im Verlauf der letzten vier Jahrzehnte stark zugenommen. So leidet heute jeder vierte bis f��nfte Mensch an einer Allergie. Ausgel��st wird diese IgE-vermittelte Hypersensibilit��tsreaktion des Typs I (Allergie vom Soforttyp) von Allergenen und beruht auf der Aktivierung von Mastzellen durch die Interaktion eines Antigens mit dem an eine Mastzelle ��ber die Fc���-Rezeptoren gebundenen IgE-Molek��ls. Die degranulierende Mastzelle sezerniert Mediatoren, was zu einem Auftreten von allergischen Symptomen f��hrt. Die Bildung von IgE wird durch das von TH2-Zellen produzierte Zytokin IL-4 induziert. Das von TH1-Zellen produzierte Zytokin IFN-��� ist in der Lage die Sekretion von IL-4 zu inhibieren, wie auch IL-4 hemmend auf die Produktion von IFN-��� wirkt. Dieses TH1-/ TH2-Gleichgewicht ist bei allergischen Erkrankungen in Richtung TH2 verschoben. Allergene werden von antigenpr��sentierenden Zellen aufgenommen, prozessiert und auf der Zelloberfl��che pr��sentiert. Die potentesten antigenpr��sentierenden Zellen sind die dendritischen Zellen, die nach Kontakt mit einem Allergen in die benachbarten Lymphknoten wandern, ausreifen und kostimulatorische Molek��le exprimieren. Sie sind so in der Lage T-Zellen zu aktivieren und entweder in TH1- oder in TH2-Zellen differenzieren zu lassen. Die zytokinabh��ngige TH1- beziehungsweise TH2-Differenzierung f��hrt zur Aktivierung der Januskinasen. Im aktiven Zustand phosphorylieren sie STAT-Molek��le, die dimerisieren und in den Zellkern translozieren, wo sie unter anderem als Transkriptionsfaktoren f��r Zytokingene dienen. Unreife humane dendritische Zellen von Allergikern zeigen nach Stimulation mit Proteinallergenen eine schnelle Phosphorylierung des mit der TH2-Entwicklung assoziierten STAT6. Dahingegen sind TH1-Antwort hervorrufende Kontaktallergene nicht in der Lage STAT6 oder andere STAT-Molek��le in dendritischen Zellen zu induzieren. Die Transkriptionsfaktoren T-bet und GATA3 sind ebenfalls von Bedeutung f��r die TH1-/TH2-Entwicklung, da T-bet ausschlie��lich in TH1-Zellen, GATA3 nur in TH2-Zellen exprimiert wird. Die Regulation des JAK/STAT-Weg unterliegt den Molek��len der intrazellul��r vorkommenden Familie der SOCS-Proteine. SOCS3 ist in TH2-Zellen h��her exprimiert als SOCS1, wohingegen SOCS1 in TH1-Zellen eine erh��hte Expression gegen��ber SOCS3 aufweist. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von Proteinallergenen auf humane dendritische Zellen untersucht. Zun��chst konnte eine morphologische Ver��nderung der unreifen dendritischen Zellen nach Kontakt mit dem Allergenextrakt beobachtet werden. Die beginnende Ausreifung der Zellen konnte mittels Durchflu��zytometrie anhand der kostimulatorischen Molek��le CD80 und CD86, insbesondere aber ��ber den Marker f��r reife dendritische Zellen CD83, nachgewiesen werden. Die zu beobachtende beginnende Ausreifung scheint ein Effekt des bakteriellen Lipopolysaccharids (LPS) zu sein, das in dem Allergenextrakt vorkommt, da sich durch Zugabe des kationischen Antibiotikums Polymyxin B die beginnende Reifung verhindern lie��. Auf RNA-Ebene war es im Rahmen dieser Arbeit m��glich, den Einfluss verschiedener Allergene auf unreifen humanen dendritischen Zellen n��her zu charakterisieren. So weisen unreife humane dendritische Zellen nach Kontakt mit Proteinallergenextrakt ein TH2-assoziiertes Genexpressionprofil auf, was sich durch eine erh��hte relative Expression der Gene SOCS3 und GATA3 auszeichnet. Im Gegensatz hierzu zeigen unreife humane dendritische Zellen nach Inkubation mit dem Kontaktallergen MCI/MI eine erh��hte relative Expression des Gens T-bet, was mit einer TH1-Antwort assoziiert ist. Nach Zugabe des ���TH1-/ TH2-neutralen��� Tetanustoxoids konnten erh��hte relative Expressionen der Gene GATA3, T-bet und SOCS3 gemessen werden. Die Ergebnisse in dem in dieser Arbeit benutzten humanen in vitro System geben Anlass zur Hypothese, dass die Art der Immunantwort (TH1 versus TH2) sich bereits auf Ebene der dendritischen Zellen anbahnt. GeneChip-Analysen mittels High Density Micro Arrays von unreifen humanen dendritischen Zellen, die entweder mit Proteinallergenextrakt oder mit LPS in Ber��hrung kamen, zeigten statistisch signifikant regulierte Gene, die allerdings keine Gemeinsamkeiten aufwiesen. Es konnten f��r die mit Alllergenextrakt gepulsten dendritischen Zellen insgesamt 10 Gene identifiziert werden, jedoch gelang es nicht, diese n��her zu deuten oder in einen Zusammenhang mit der allergischen Erkrankung oder der dendritischen Zelle zu bringen. F��r die mit LPS, dem st��rkeren Stimulus, gepulsten dendritischen Zellen konnten 40 Gene identifiziert werden, die unter anderem f��r die Maturierung der dendritischen Zelle verantwortlich sind. Zudem war es m��glich, die Daten der Arrays auf Proteinebene exemplarisch anhand des Chemokins CXCL2 (Gro-��) zu verifizieren.

In vivo- und in vitro-Untersuchungen zur Immunantwort und Parasitenentwicklung bei Infektionen mit dem Darmparasiten Cryptosporidium parvum

Cryptosporidium parvum ist ein intrazellul��rer protozoischer Darmparasit (Apikomplexa), der weltweit zu den bedeutendsten Erregern von Diarrh��en beim Menschen und einer Reihe von Nutztieren z��hlt. Vor allem immunkompromittierte Personen wie zum Beispiel AIDS-Patienten erleiden schwere, chronische bis lebensbedrohende Erkrankungen. Da nach wie vor keine effektive Therapie gegen eine Kryptosporidiose in Form eines spezifisch wirkenden Chemotherapeutikums oder einer Vakzine existiert, ist es notwendig, die Immunantwort des Wirtes gegen den Parasiten und dessen Bindung, Invasion und die intrazellul��re Entwicklung in den Epithelzellen eingehend zu studieren, um neue Ansatzpunkte zu entwickeln. Wohingegen Menschen zeitlebens suszeptibel f��r eine Infektion mit C. parvum sind, entwickeln M��use eine nat��rliche Resistenz und k��nnen als adulte Tiere nicht mehr infiziert werden. Daher sind Mausmodelle der Kryptosporidiose auf neonatale oder immunsupprimierte und immundefiziente adulte M��use beschr��nkt. Bei der ��berwindung einer C. parvum-Infektion sind Effektoren der nat��rlichen und adaptiven Immunit��t beteiligt. Die zentrale Rolle spielen CD4+-T-Zellen, sowie Interferon-gamma und Interleukin-12. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Infektionen in IFN-gamma (GKO)- und IL-12 p40 (IL12KO)-Knockout-M��usen (C57BL/6) etabliert, f��r die bereits gezeigt wurde, dass sie eine Suszeptibilit��t gegen��ber einer Erstinfektion besitzen. Erstmals wurden die beiden Infektionsmodelle parallel unter denselben Bedingungen analysiert, um R��ckschl��sse auf die Funktion und die Bedeutung der beiden Th1-Zytokine IFN-gamma und IL-12 bei der Auseinandersetzung mit dem Parasiten und der ��berwindung einer Infektion ziehen zu k��nnen. Es wurden deutliche Unterschiede im Infektionsverlauf, bei der H��he und Dauer der Parasitenausscheidung und der induzierten systemischen und mukosalen Antik��rperantwort beobachtet. Zum ersten Mal konnte gezeigt werden, dass neben IL12KO auch GKO in der Lage sind, eine erste Infektion zu ��berwinden und eine Resistenz gegen��ber einer erneuten Konfrontation mit dem Parasiten zu entwickeln. Alle Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Etablierung einer protektiven Immunit��t gegen eine Kryptosporidiose generell unabh��ngig von der Anwesenheit der Zytokine IFN-gamma und IL-12 ist, der Verlust von IFN-gamma jedoch schwerer wiegt. Bei GKO-M��usen persistierte der Parasit in Form einer niedriggradigen chronischen Infektion. Die beiden Infektionsmodelle stellten sich als ideales System f��r die Etablierung einer effektiven Immunisierungsstrategie heraus. Intranasale Immunisierungen, welche neben einer systemischen auch eine mukosale Immunantwort induzieren k��nnen, schienen einen richtigen Ansatz darzustellen. Intraperitoneale und subkutane Immunisierungen f��hrten zwar zur Ausbildung einer starken spezifischen IgG-Antwort im Serum, diese war jedoch nicht in der Lage, einen Schutz vor einer Infektion zu vermitteln. Neben den in vivo Untersuchungen wurde des Weiteren auch die intrazellul��re Entwicklung von C. parvum in einem in vitro Kultursystem verfolgt. Zum ersten Mal wurde die Genexpression von vier Oberfl��chenproteinen der invasiven Zoitenstadien und eines Oozystenwandproteins parallel durch RT-PCR analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass alle untersuchten Gene w��hrend der intrazellul��ren Entwicklung differentiell exprimiert werden, was eine unterschiedliche Funktion der Proteine w��hrend des Entwicklungszyklus nahe legt. Das Expressionsmuster der verschiedenen Gene charakterisiert bestimmte Abschnitte innerhalb des Entwicklungszyklus. Dabei wurden Marker f��r die Invasion (CP17) sowie f��r die asexuelle (GP900) und sexuelle Replikation (COWP) identifiziert.

Untersuchungen zur Lymphozytotoxizit��t gegen Tumoren in Nierenzellkarzinom-Patienten und HLA-kompatiblen gesunden Spendern

In der vorliegenden Arbeit wurden Blutlymphozyten, die aus allogenen, serologisch HLA (humanes Leukozytenantigen)-identischen gesunden Geschwisterspendern von Nierenzellkarzinom (RCC, engl. renal cell carcinoma)-Patienten isoliert wurden, auf ihre antitumorale Reaktivit��t in vitro untersucht. Dazu war die vorangehende Generierung von stabil in vitro wachsenden Tumorzelllinien der Patienten zwingende Voraussetzung. Insgesamt wurden aus prim��rem Tumorgewebe von 65 Nierenzellkarzinom-Patienten Tumorzellen isoliert und daraus Zellkulturen angelegt. In 28 % der F��lle gelang es, eine konstant in Zellkultur wachsende Tumorzelllinie zu etablieren. Daneben wurden aus 56 Tumorpatienten auch die aus dem angrenzenden Nierengewebe gewonnenen nicht-malignen Nierenzellen ��ber wenige Zellkultur-Passagen expandiert. In vier Patienten mit stabil in vitro wachsender Tumorzelllinie war ein allogener HLA-identischer Geschwisterspender verf��gbar. In diesen Modellsystemen wurden in gemischten Lymphozyten-Tumorzell-Kulturen (MLTCs, engl. mixed lymphocyte tumor cell cultures) die Blutlymphozyten der Patienten und der gesunden Geschwisterspender mit der jeweiligen Nierenzellkarzinom-Zelllinie stimuliert und tumorreaktive CD8+ zytotoxische T-Lymphozyten (CTLs, engl. cytotoxic T-lymphocytes) generiert. Wenn m��glich wurden aus den so gewonnenen ���Responder���-Massenkulturen CD8+ T-Zellklone isoliert und hinsichtlich ihrer Funktionalit��t in IFN-��-ELISpot-Assays und 51Chrom-Zytotoxizit��tstests untersucht. Durch Blockade der HLA-Molek��le mit monoklonalen Antik��rpern wurden die HLA-Restriktionselemente sowie weitere an der Erkennung beteiligte Oberfl��chenmolek��le analysiert. Kreuzreaktivit��tsuntersuchungen mit einem breiten Zielzell-���Panel��� gaben Aufschluss ��ber die Reaktivit��t der CTLs gegen RCC, nicht-maligne Nierenzellen, h��matopoetische Zielzellen von Patient und Geschwisterspender und weitere Tumorzelllinien aus Nierenzellkarzinomen und anderen Tumorentit��ten. Interessanterweise zeigten die Geschwister-MLTC-���Responder���-Lymphozyten im Vergleich zu den autologen MLTC-���Responder���-Lymphozyten eine st��rkere Proliferation und Zytotoxizit��t nach Stimulation mit Tumorzellen. Die allogenen tumorreaktiven ���Responder���-Lymphozyten entstammten der CD8+ CD62L(high)+ Subpopulation, die naive Vorl��ufer- und ���central memory���-T-Zellen enth��lt. Im Gegensatz zu autologen MLTC-Lymphozyten und tumorinfiltrierenden Lymphozyten konnte aus nahezu allen allogenen MLTCs mithilfe des Grenzverd��nnungsverfahrens ein breites Spektrum an tumorreaktiven CTL-Klonen expandiert werden. Diese lysierten entweder ausschlie��lich die autologe RCC-Zelllinie oder kreuzreagierten mit autologen nicht-malignen Nierenzellen. Eine Minderheit der CTL-Klone erkannte au��erdem h��matopoetische Zellen des Patienten oder allogene Tumorzellen. Als HLA-Restriktionselemente der allogenen tumorreaktiven CD8+ CTL-Klone wurden HLA-A2, -A3, -A11, -A24 und -B7 identifiziert. Weiterhin wurden in einem Modellsystem bisher unbekannte, stark proliferierende CD3+ CD16+ CD57+ CTL-Klone mit nicht-HLA-restringierter Tumorreaktivit��t isoliert. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit erstmals, dass allogene Blutlymphozyten von HLA-identischen gesunden Geschwistern eine Vielfalt von tumorreaktiven CD8+ CTL-Klonen enthalten. Im direkten Vergleich mit autologen Blutlymphozyten der betroffenen Patienten besitzen allogene Blutlymphozyten der Geschwister eine st��rkere proliferative und zytotoxische Tumorreaktivit��t. Die Ergebnisse dieser Arbeit ermutigen weitere Bem��hungen, tumorreaktive T-Zellen aus dem Blut von HLA-identischen gesunden Geschwisterspendern in vitro zu generieren. Solche T-Zellen w��ren in zweierlei Hinsicht von Interesse: Zum einen erm��glichen sie die Identifizierung der Zielantigene, die von T-Zellen aus gesunden Individuen auf Tumoren erkannt werden und als Zielstrukturen von antigenspezifischen Immuntherapien (z. B. Vakzination) dienen k��nnten. Zum anderen k��nnten diese T-Zellen m��glicherweise f��r eine adoptive Immuntherapie der betroffenen Tumorpatienten verwendet werden.

Die Rolle regulatorischer T-Zellen im experimentellen allergischen Asthma

Im ersten Teil der Dissertation wurde in einem experimentellen Asthmamodell demonstriert, dass die Signaltransduktion ��ber IL-6 das Gleichgewicht zwischen Effektorzellen und regulatorischen T-Zellen durch verschiedene Rezeptorkomponenten kontrolliert. Hierbei zeigte sich, dass speziell das IL-6 Trans-Signaling ��ber den sIL-6R die TH2 Cytokinproduktion steuert. Dagegen f��hrt die Blockade des mIL-6R zur Expansion regulatorischer T-Zellen mit suppressiven Eigenschaften. Diese CD4+CD25+ Tregs induzieren au��erdem IFN gamma produzierende CD4+ T-Zellen in der Lunge und verbessern daneben die AHR. Im ��berblick konnte in der vorliegenden Dissertation demonstriert werden, dass IL-6 die Balance zwischen der Funktion von Effektorzellen und regulatorischen T-Zellen in der Lunge ��ber unterschiedliche Wege kontrolliert, dem sIL-6R und dem mIL-6R. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die lokale Blockade der IL-2R alpha- und IL-2R beta-Kette untersucht. Hier konnte gezeigt werden, dass die Blockade der IL-2R beta-Kette zur Verbesserung der AHR als auch der Rekrutierung eosinophiler Granulozyten in den Atemwegen f��hrt. Beide Blockaden f��hren zur Reduktion der TH2 Cytokine IL-4 und IL-5, wohingegen IL-13 nur nach Blockade der IL-2R beta-Kette vermindert sezerniert wird. In diesem Zusammenhang wurde auch die Rolle CD4+CD25+ regulatorischer T-Zellen untersucht, wobei eine Induktion dieser Population in den Lymphknoten nach Blockade der IL-2R beta-Kette nachgewiesen werden konnte. Die Blockade der IL-2R beta-Kette wirkt sich positiv auf experimentelle Asthmastudien aus und stellt somit ein m��gliches therapeutisches Potential dar, erfordert aber teilweise noch weitere Untersuchungen.

Rolle von NFATc2 in einem murinen Asthmamodell

Nuclear factor of activated T cells (NFAT) ist eine Familie der Transkriptionsfaktoren, welche eine wichtige Rolle bei der Regulation der T-Zellvermittelten Signalkaskade in der Lymphozytenpopulation spielt. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Nuclear Factor of Activated T cells-2 (NFATc2) defiziente M��use einen erh��hten Atemwegswiderstand, einen pathologische Ver��nderung der Lunge und einen erh��hten IgE Spiegel im Vergleich zu den Wildtypen vorweisen. Die NFATc2 Defizienz konnte ebenfalls sowohl mit einer erh��hten Anzahl an Th2 und Th17 Zellen, die eine erh��hte Proliferation vorweisen, als auch einer erniedrigten Anzahl an CD8+ CD122- T-Zellen, die geringere Mengen an IFN-g produzieren, in Verbindung gebracht werden. Die aus den NFATc2(-/-) M��usen isolierten CD4+ T-Zellen zeigen im Vergleich zu denen der Wildtypen neben der erh��hten Proliferation einen vermehrte Aktivierung (CD4higCD44highCD69high). Weiterhin konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass in Anwesenheit eines Allergens, die NFATc2(-/-) M��use eine erh��hte Anzahl an regulatorischen T-Zellen (CD4+CD25+Foxp3+GITR++) in der Lunge vorweisen, die wiederum die Effektorzellen in diesen hemmen. Ein Grund f��r die geringere Freisetzung an IFN-g durch die CD8+ T-Zellen in den NFATc2 defizienten M��usen ist eine erh��hte Subpopulation von CD8+CD122+ (IL-2Rb Kette) CD127hi (IL-7Ra Kette) ���long-lived memory Zellen��� in den NFATc2(-/-) M��usen. Diese besitzen einen regulatorischen Effekt, so dass immundefiziente SCID M��use, die in einem adoptiven Transfer mit OVA-spezifischen CD8+ und CD4+ T-Zellen, welchen aus NFATc2(-/-) M��use isoliert werden, behandelt wurden, eine erh��hten Atemwegswiderstand, eine erh��hte IL-17 und eine erniedrigte IFN-g Produktion vorweisen. Eine Depletion der memory CD8+CD122+IL-7Rhigh T-Zellen hebt dagegen die verringerte IFN-g Produktion der CD8+CD122- T-Zellen auf und f��hrt zu einer Erniedrigung des Atemwegswiderstandes in einem SCID Model Zusammenfassend zeigen unsere Untersuchungen, dass sowohl die IFN-g Produktion der CD8+ Effektor T-Zellen als auch die Anzahl an CD4+CD25+Foxp3+GITR++ regulatorischen T-Zellen die Entwicklung der Th2 und Th17 als auch die H��he des Atemwegswiderstandes unterdr��ckt.