Hsp70-Chaperone und ihre Rolle bei der Thylakoidmembranbiogenese im Cyanobakterium Synechocystis sp. PCC 6803

Im Genom des Cyanobakteriums Synechocystis sp. PCC6803 sind vier homologe Hsp70-Proteine kodiert. Im Rahmen dieser Arbeit konnten neue Erkenntnisse über die möglichen Funktionen der einzelnen Mitglieder der Hsp70-Proteinfamilie in dem Modellorganismus gewonnen bzw. bekannte Aufgabenbereiche erweitert werden. Wie für E. coli schon gezeigt, konnte auch für Synechocystis sp. nachgewiesen werden, dass eine Deletion des ribosomassoziierten Chaperons Trigger Factor ohne Beeinträchtigung der Zellviabilität möglich ist. Darüber hinaus war auch eine Doppeldeletion mit dnaK1 durchführbar. Als Auswirkung der Deletion ließ sich in den jeweiligen Deletionsstämmen eine veränderte Expression der homologen Hsp70-Proteine und Trigger Factor nachweisen. Mit Hilfe der Synechocystis sp.-Mutationsstämme ∆dnaK1, ∆dnaK2, ∆dnaK3, ∆tig und ∆dnaK1∆tig wurden Auswirkungen der Deletion bzw. Depletion umfassend dargestellt und daraus hervorgehende putative Funktionen eingehend diskutiert. Die Reduzierung der zellulären DnaK3-Konzentration um etwa 70 % führte im Depletionsstamm ΔdnaK3 zu weitreichenden physiologischen Änderungen hinsichtlich photosynthetischer Prozesse. Zusammen mit einer lichtabhängigen Expression, konnte DnaK3 als essentieller Faktor für die funktionelle Aufrechterhaltung der Thylakoidmembran identifiziert werden. Durch die Analyse des Proteoms und Lipidoms dunkeladaptierter Synechocystis sp.-Zellen konnte im Vergleich zu älteren Studien eine erheblich größere Anzahl von Proteinen detektiert und quantifiziert werden, womit neue Erkenntnisse über die physiologischen Veränderungen unter heterotrophem Wachstum sowie der Thylakoidmembranbiogenese gewonnen werden konnten.

Tandem repetitive DNA: Stabilität und Wirkung auf die Genexpression im transgenen System

Zusammenfassung In der vorliegenden Arbeit wurden unterschiedliche Eigenschaften von tandem repetitiver DNA (trDNA) analysiert. Drei der untersuchten trDNA-Familien (Cla-Elemente, Alu-Elemente, 1,688-Satelliten-DNA) stammen aus der genomischen DNA von Insekten, während ein trDNA-Cluster artifiziell aus Hsp70 Promotoren hergestellt wurde. Untersucht wurde die Stabilität dieser trDNA-Sequenzfamilien innerhalb eines Plasmidvektors in E. coli bzw. nach Integration der trDNA auch im Genom von D. melanogaster. Der Schwerpunkt der Arbeit liegt jedoch in der Analyse des Einflusses von trDNA auf die Expression eines benachbarten Reportergens in D. melanogaster.Ziel der Untersuchungen zur Stabilität war es, Eigenschaften von trDNA-Clustern und Mechanismen aufzuzeigen, die die Stabilität derselben in E. coli und im Genom von D. melanogaster beeinflussen. Mit Ausnahme der Alu-Elemente zeigen alle trDNA-Familien eine deutliche Instabilität in E. coli. Am Beispiel der Cla-Elemente wurde gezeigt, daß spezifische Eigenschaften der trDNA-Familie, wie etwa die sequenzbedingte Krümmung der Helixachse, keinen Einfluß auf die Stabilität des trDNA-Clusters haben, sondern die Orientierung des trDNA-Clusters innerhalb des Vektors ausschlaggebend ist. Ein entscheidender Faktor könnte die Orientierung des trDNA-Clusters relativ zur Wanderungsrichtung der Replikationsgabel in E. coli sein. Am Beispiel des trDNA-Clusters aus artifiziellen Hsp70 Promotoren konnte gezeigt werden, daß verschiedene Rekombinationssysteme an der Instabilität in E. coli beteiligt sind. Die meisten beobachteten Deletionen von trDNA sind RecA-abhängig. Zusätzlich findet jedoch in einem kleinen Teil der Plasmide auch eine RecA-unabhängige Rekombination statt. Sowohl in E. coli als auch in D. melanogaster wurde als vorherrschender Mechanismus der trDNA-Instabilität die homologe Rekombination identifiziert. TrDNA-Cluster, die in E. coli deutlich instabil sind, können jedoch im Genom von D. melanogaster weitgehend stabil sein. Auch Faktoren, die in E. coli die Stabilität eines trDNA-Clusters beeinflussen, wie etwa die Orientierung, zeigen in D. melanogaster keinen Einfluß auf die Stabilität der trDNA-Cluster. Ergebnisse aus Stabilitätsuntersuchungen in E. coli können damit nicht ohne Überprüfung auf andere Organismen übertragen werden. Im Hauptteil der Arbeit sollte geklärt werden, ob trDNA generell die Expression benachbarter Gene beeinflußt und welche Eigenschaften der trDNA für diesen inhibitorischen oder stimulierenden Effekt verantwortlich sind. Keine der untersuchten trDNA-Familien zeigt einen inhibitorischen Effekt auf ein benachbartes Reportergen. Entgegen dem Modell von Dorer und Henikoff (1994) führen trDNA-Cluster nicht per se zu der Entstehung von Heterochromatin. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, daß sowohl ein trDNA-Cluster aus Cla-Elementen als auch aus Hsp70 Promotor-Elementen eine deutliche Steigerung der Expression des miniwhite-Reportergens bewirken. Diese Steigerung ist für beide trDNA-Familien unabhängig von der chromosomalen Lage des Transgens im Euchromatin. In beiden Fällen ist der Effekt von der Orientierung des trDNA-Clusters abhängig und verstärkt sich mit wachsender Kopienzahl der trDNA-Einheiten. Während eines der trDNA-Cluster aus trDNA-Einheiten besteht, die bekanntermaßen eine Promotoraktivität aufweisen (Hsp70 Promotoren), war für die Cla-Elemente kein Einfluß auf die Expression eines benachbarten Gens bekannt. Damit wurde für eine trDNA-Familie aus Chironomus nachgewiesen, daß sie auf ein benachbartes Gen ähnlich wirkt wie zusätzliche Promotoren. Die experimentellen Befunde unterstützen ein Modell, demzufolge die Cla-Elemente in gleicher Weise wie tandem repetitive Promotoren auf ein benachbartes Gen expressionssteigernd wirken. Die TATA-Box ist für das Modell ein wichtiges Strukturelement, da diese in beiden expressionssteigernden DNA-Sequenzen der trDNA-Cluster vorkommt und ausschließlich in einer Orientierung wirkt. Das Modell besagt, daß durch die Verbindung einer offenen Chromatinstruktur mit korrekt orientierten Bindungsstellen für TBP der Aufbau von vollständigen Transkriptionskomplexen an den tandem repetitiven Promotoren initiiert wird. Einer Perlenschnur ähnlich wären die Transkriptionskomplexe direkt verfügbar, nachdem ein Transkriptionskomplex den Promotor zur Transkription verlassen hat (Abb. 32). Dies würde zu der beobachteten Steigerung der Expression des Reportergens sowohl durch die tandem repetitiven Hsp70 Promotoren als auch durch die Cla-Elemente führen.

Bcl-2-homologe Proteine aus dem Schwamm Geodia cydonium

'Bcl-2-homologe Proteine aus dem Schwamm Geodia cydonium: Klonierung, Charakterisierung und Funktionsanalyse von Apoptose-Regulatoren der Porifera'. Auf der Suche nach der molekularbiologischen Grundlage der Apoptose in den Porifera, dem phylogenetisch ältesten Metazoen-Tierstamm, wurden Mitglieder der apoptoseregulatorischen Bcl?2 Familie unter Anwendung diverser Techniken im Schwamm G. cydonium identifiziert: GCBHP1 und GCBHP2. Detaillierte Analysen offenbarten Bcl-2-charakteristische Signaturen sowie eine durch apoptotische Stimuli induzierbare Expression. Die parallele HSP70-Induktion zeugte von der GCBHP2-Expression als Teil einer antiapoptotischen Streßantwort zum Schutz des Organismus'. Die kontinuierliche Transkription des im Rahmen dieser Arbeit gleichfalls klonierten Proliferationsmarkers SEP1 veranschaulichte zudem die Effektivität dieser Streßreaktion. Mit der Herstellung eines rekombinanten Proteins und der Gewinnung eines Antiserums konnte auch die streßinduzierte Proteinexpression des GCBHP2 verfolgt werden. Zum Zweck der Funktionsstudie wurden Säugetierzellen (HEK-293, NIH/3T3) mit einem GCBHP2-Konstrukt stabil transfiziert und auf die Expression des Schwammproteins untersucht. Diese Zellen unterschieden sich bereits phänotypisch von mock-transfizierten Zellen. Immunzytochemische Untersuchungen enthüllten eine für antiapoptotische Bcl-2 Proteine charakteristische Assoziation mit Mitochondrien. Unter dem Einfluß zweier apoptotischer Stimuli wurde für GCBHP2-transfizierte Zellen eine vierzehn-/sechsmal höhere Vitalität und eine reduzierte Aktivierung der Caspase-Kaskade registriert (im Vergleich zu mock-transfizierten Kontrollen). Somit wurde der antiapoptotische Charakter des GCBHP2 und die Existenz apoptotischer Mechanismen in den Porifera bestätigt.

Control of protein degradation pathways by BAG proteins and changes during aging

Many age-related neurodegenerative disorders such as Alzheimer’s disease, Parkinson’s disease, amyotrophic lateral sclerosis and polyglutamine disorders, including Huntington’s disease, are associated with the aberrant formation of protein aggregates. These protein aggregates and/or their precursors are believed to be causally linked to the pathogenesis of such protein conformation disorders, also referred to as proteinopathies. The accumulation of protein aggregates, frequently under conditions of an age-related increase in oxidative stress, implies the failure of protein quality control and the resulting proteome instability as an upstream event of proteinopathies. As aging is a main risk factor of many proteinopathies, potential alterations of protein quality control pathways that accompany the biological aging process could be a crucial factor for the onset of these disorders.rnrnThe focus of this dissertation lies on age-related alterations of protein quality control mechanisms that are regulated by the co-chaperones of the BAG (Bcl-2-associated athanogene) family. BAG proteins are thought to promote nucleotide exchange on Hsc/Hsp70 and to couple the release of chaperone-bound substrates to distinct down-stream cellular processes. The present study demonstrates that BAG1 and BAG3 are reciprocally regulated during aging leading to an increased BAG3 to BAG1 ratio in cellular models of replicative senescence as well as in neurons of the aging rodent brain. Furthermore, BAG1 and BAG3 were identified as key regulators of protein degradation pathways. BAG1 was found to be essential for effective degradation of polyubiquitinated proteins by the ubiquitin/proteasome system, possibly by promoting Hsc/Hsp70 substrate transfer to the 26S proteasome. In contrast, BAG3 was identified to stimulate the turnover of polyubiquitinated proteins by macroautophagy, a catabolic process mediated by lysosomal hydrolases. BAG3-regulated protein degradation was found to depend on the function of the ubiquitin-receptor protein SQSTM1 which is known to sequester polyubiquitinated proteins for macroautophagic degradation. It could be further demonstrated that SQSTM1 expression is tightly coupled to BAG3 expression and that BAG3 can physically interact with SQSTM1. Moreover, immunofluorescence-based microscopic analyses revealed that BAG3 co-localizes with SQSTM1 in protein sequestration structures suggesting a direct role of BAG3 in substrate delivery to SQSTM1 for macroautophagic degradation. Consistent with these findings, the age-related switch from BAG1 to BAG3 was found to determine that aged cells use the macroautophagic system more intensely for the turnover of polyubiquitinated proteins, in particular of insoluble, aggregated quality control substrates. Finally, in vivo expression analysis of macroautophagy markers in young and old mice as well as analysis of the lysosomal enzymatic activity strongly indicated that the macroautophagy pathway is also recruited in the nervous system during the organismal aging process.rnrnTogether these findings suggest that protein turnover by macroautophagy is gaining importance during the aging process as insoluble quality control substrates are increasingly produced that cannot be degraded by the proteasomal system. For this reason, a switch from the proteasome regulator BAG1 to the macroautophagy stimulator BAG3 occurs during cell aging. Hence, it can be concluded that the BAG3-mediated recruitment of the macroauto-phagy pathway is an important adaptation of the protein quality control system to maintain protein homeostasis in the presence of an enhanced pro-oxidant and aggregation-prone milieu characteristic of aging. Future studies will explore whether an impairment of this adaptation process may contribute to age-related proteinopathies.

Der Einfluss der löslichen Spaltprodukte des Amyloid-beta-Vorläuferproteins auf die Proteinhomöostase

Die Alzheimer’sche Erkrankung (AD) ist die am häufigsten vorkommende Form der Demenz. Die Spaltung des APP scheint eine große Rolle in der Pathologie der Erkrankung zu spielen. APP kann auf zwei Wegen prozessiert werden. Dem amyloidogenen Weg, bei dem neben einem löslichen extrazellulären Fragment (sAPPβ) und der APP Intrazellulären Domäne (AICD) auch Aβ entsteht. Auf dem nicht-amyloidogenen Weg entsteht sAPPα, p3 und die AICD. Dem sAPPα werden neuroprotektiv Eigenschaften zugeschrieben. rnEs konnte gezeigt werden, dass sAPPα in jungen IMR90 Zellen, den durch proteasomalen Stress ausgelösten Anstieg der Bag3 und Hsp70 Proteinlevel senkt. Gleichzeitig konnte gezeigt werden, dass sAPPα die Zellviabilität nach proteasomalen Stress erhöht und weniger Aggresomen gebildet werden. Die Analyse der proteasomalen Aktivität zeigte, dass sAPPα die proteasomale Aktivität gestresster junger Zellen erhöhen kann. In alten IMR90 Zellen konnte keine Beeinflussung der Autophagie und der proteasomalen Aktivität festgestellt werden. Das ist ein Anhaltspunkt dafür, dass im Alter das Proteasom zu stark geschädigt ist, um durch sAPPα aktiviert zu werden. Das bei der amyloidogenen Prozessierung von APP entstehende sAPPβ zeigte eine ähnliche protektive Eigenschaft. rnInsgesamt konnte ein protektiver Einfluss von sAPPα und sAPPβ unter proteotoxischen Bedingungen in jungen und klonalen Zellen gezeigt werden, wodurch die Zellviabilität verbessert wird. rn

Evolutionäre Veränderungen in der Nutzung redox-aktiver Aminosäuren und ihre Ursachen

Gewebe, Zellen und speziell Zellkompartimente unterscheiden sich in ihrer Sauerstoffkonzentration, Stoffwechselrate und in der Konzentration an gebildeten reaktiven Sauerstoffspezies. Um eine mögliche Änderung in der Aminosäurennutzung durch den Einfluss von Sauerstoff und seinen reaktiven Spezies untersuchen zu können wurden, Bereiche bzw. Kompartimente der menschlichen Zelle definiert, die einen Referenzrahmen bildeten und bekannt dafür sind, einen relativ hohen Grad an reaktiven Sauerstoffspezies aufzuweisen. Aus dem Vergleich wurde deutlich, dass vor allem die beiden redox-aktiven und schwefeltragenden Aminosäuren Cystein und Methionin durch eine besondere Verteilung und Nutzung charakterisiert sind. Cystein ist hierbei diejenige Aminosäure mit den deutlichsten Änderungen in den fünf untersuchten Modellen der oxidativen Belastung. In all diesen Modellen war die Nutzung von Cystein deutlich reduziert, wohingegen Methionin in Proteinen des Mitochondriums und der Elektronentransportkette angereichert war. Dieser auf den ersten Blick paradoxe Unterschied zwischen Cystein und Methionin wurde näher untersucht, indem die differenzierte Methioninnutzung in verschiedenen Zellkompartimenten von Homo sapiens charakterisiert wurde.rnDie sehr leicht zu oxidierende Aminosäure Methionin zeigt ein ungewöhnliches Verteilungsmuster in ihrer Nutzungshäufigkeit. Entgegen mancher Erwartung wird Methionin in zellulären Bereichen hoher oxidativer Belastung und starker Radikalproduktion intensiv verwendet. Dieses Verteilungsmuster findet man sowohl im intrazellulären Vergleich, als auch im Vergleich verschiedener Spezies untereinander, was daraufhin deutet, dass es einen lokalen Bedarf an redox-aktiven Aminosäuren gibt, der einen sehr starken Effekt auf die Nutzungshäufigkeit von Methionin ausübt. Eine hohe Stoffwechselrate, die im Allgemeinen mit einer erhöhten Produktion von Oxidantien assoziiert wird, scheint ein maßgeblicher Faktor der Akkumulation von Methionin in Proteinen der Atmungskette zu sein. Die Notwendigkeit, oxidiertes Antioxidans wieder zu reduzieren, findet auch bei Methionin Anwendung, denn zu Methioninsulfoxid oxidiertes Methionin wird durch die Methioninsulfoxidreduktase wieder zu Methionin reduziert. Daher kann die spezifische Akkumulation von Methionin in Proteinen, die verstärkt reaktiven Sauerstoffspezies ausgesetzt sind, als eine systematische Strategie angesehen werden, um andere labile Strukturen vor ungewollter Oxidation zu schützen. rnDa Cystein in allen untersuchten Modellen der oxidativen Belastung und im Besonderen in Membranproteinen der inneren Mitochondrienmembran lebensspannenabhängig depletiert war, wurde dieses Merkmal näher untersucht. Deshalb wurde die Hypothese getestet, ob ein besonderer Redox-Mechanismus der Thiolfunktion für diese selektive Depletion einer im Allgemeinen als harmlos oder antioxidativ geltenden Aminosäure verantwortlich ist. Um den Effekt von Cysteinresten in Membranen nachzustellen, wurden primäre humane Lungenfibroblasten (IMR90) mit diversen Modellsubstanzen behandelt. Geringe Konzentrationen der lipophilen Substanz Dodecanthiol verursachten eine signifikante Toxizität in IMR90-Zellen, die von einer schnellen Zunahme an polyubiquitinierten Proteinen und anderen Indikatoren des proteotoxischen Stresses, wie Sequestosom 1 (P62), HSP70 und HSP90 begleitet wurde. Dieser Effekt konnte spezifisch der Chemie der Thiolfunktion in Membranen zugeordnet werden, da Dodecanol (DOH), Dodecylmethylsulfid (DMS), Butanthiol oder wasserlösliche Thiole weder eine cytotoxische Wirkung noch eine Polyubiquitinierung von Proteinen verursachten. Die Ergebnisse stimmen mit der Hypothese überein, dass Thiole innerhalb von biologischen Membranen als radikalische Kettentransferagentien wirken. Diese Eigenschaft wird in der Polymerchemie durch Nutzung von lipophilen Thiolen in hydrophoben Milieus technisch für die Produktion von Polymeren benutzt. Da die Thiylradikal-spezifische Reaktion von cis-Fettsäuren zu trans-Fettsäuren in 12SH behandelten Zellen verstärkt ablief, kann gefolgert werden, dass 12SH zellulär radikalisiert wurde. In lebenden Organismen kann demnach die Oxidation von Cystein die Schädigung von Membranen beschleunigen und damit Einfallstore für die laterale Radikalisierung von integralen Membranproteinen schaffen, welche möglicherweise der Langlebigkeit abträglich ist, zumindest, wenn sie in der inneren Mitochondrienmembran auftritt.