Mechanismus der Apoptose, Gentoxizität und DNA-Reparatur in Herpesvirus-Thymidinkinase-exprimierenden Säugerzellen nach Behandlung mit Antiherpes-Virustatika vom Typ der Nukleosidanaloga

Um Cytotoxizität und Gentoxizität nukleosidischer Antiherpes-Virustatika zu untersuchen, wurden stabile CHO-Klone etabliert, die Thymidinkinase (TK) des Herpes simplex-Virus Typ 1 (HSV-TK) oder des Varicella zoster-Virus (VZV-TK) exprimieren. In HSV-TK-exprimierenden Zellen wurde das Purinanalogon Ganciclovir (GCV) effizient in die genomische DNA eingebaut, worauf in den nächsten Replikationsrunden DNA-Strangbrüche und Aberrationen entstehen und Apoptose ausgelöst wird. GCV-induzierte Apoptose wird hauptsächlich über den mitochondrialen Weg vermittelt, wobei das anti-apoptotische Protein Bcl-2 im Mittelpunkt steht. Nach GCV-Behandlung konnte eine Caspase-9-vermittelte post-translationale Spaltung von Bcl-2 nachgewiesen werden. Das 23 kDa-großes Bcl-2-Fragment wirkt im Gegensatz zum intakten Bcl-2-Protein pro-apoptotisch und verstärkt die Cytochrom C-Freisetzung und damit die Aktivierung der Caspase-9, die Bcl-2 spaltet, was zu einem positiven 'Amplifikationsloop' des mitochondrialen apoptotischen Weges führt. In weiteren Experimenten wurde gezeigt, daß in die DNA inkorporiertes GCV durch Basenexzisionsreparatur repariert wird, wobei die DNA-Polymerase ß eine entscheidende Rolle spielt. Diese Reparatur führte zu einer signifikanten Reduktion der Apoptose und Klastogenität und damit zur Resistenzsteigerung gegenüber GCV. In VZV-TK-exprimierenden Zellen wurde gezeigt, daß Brivudin (BVDU), gleichermaßen Apoptose und Nekrose induzierte. Für die BVDU-induzierte Cytotoxizität konnte die Hemmung der Thymidylatsynthetase als Ursache identifiziert werden. Im Gegensatz zur GCV-induzierten Apoptose war für die BVDU-induzierte Apoptose der Rezeptor (Fas/CD95/APO-1)-vermittelte Weg von vorrangiger Bedeutung.

Die Schleimkeratine TK-alpha and TK-gamma des Zebrabärblings Danio rerio

Die Schleimkeratine TKα und TKγ aus dem Schleimaal Eptatretus stoutii besitzten für Keratine außergewöhnliche Eigenschaften. In speziellen Drüsen reifen die Schleimkeratine zu 3 µm dicken und bis zu 60 cm langen kabelartigen Filamenten heran und werden anschließend zur Feindabwehr ins umgebende Wasser extrazellulär sezerniert, wodurch die viskoelastischen Eigenschaften des Schleims modifiziert werden. Mittlerweile wurden die Schleimkeratine auch in höheren Wirbeltiergruppen (Knochenfische und Amphibien) entdeckt. Zu Beginn meiner Promotion war jedoch bis auf EST-Verteilungsprofile noch nichts über die Expression und Funktion der Schleimkeratine in diesen Organismen bekannt. rnIm Rahmen meiner Arbeit wurden die Schleimkeratine TKα und TKγ erstmalig im Zebrabärbling Danio rerio identifiziert und näher charakterisiert. Mittels rekombinanter Expression wurden TKα und TKγ in ausreichenden Mengen hergestellt und auf ihre Bindungseigenschaften hin untersucht. Hierbei konnte ich zeigen, dass TKα und TKγ einerseits miteinander Heteromere formen und andererseits, dass das TKα in der Lage ist, auch homopolymere Strukturen auszubilden. Letztere Eigenschaft wurde bisher noch bei keinem bekannten cytoplasmatischen Keratin beschrieben. Ergänzend zu diesen Untersuchungen wurde eine Expressionsanalyse durchgeführt. Hierbei konnte gezeigt werden, dass die Schleimkeratine im Zebrabärbling nicht extrazellulär sezerniert werden und zum anderen keine höheren, kabelartigen Strukturen ausformen. Vielmehr werden die Schleimkeratine bei adulten Tieren in den basalen Zellschichten der Epidermis exprimiert, welche keinen mechanischen Schutz in Form von Schuppen aufweisen (Stirnhautepidermis, Epidermis in Geweben zwischen den Flossenstrahlen). Innerhalb dieser Zellen formen die Schleimkeratine ein filamentöses Netzwerk aus, dass sich an der basalen Zellseite konzentriert. Eine mögliche Funktion von TKα und TKγ könnte demnach in der Erhöhung der mechanischen Integrität von stark beanspruchten Geweben liegen, die keinen Schutz in Form von Schuppen aufweisen. So werden TKα und TKγ in larvalen Entwicklungsstadien in der Epidermis, sowie im mechanisch stark beanspruchten Notochord koexprimiert. rnDa das Notochord im Zebrabärbling auch in entwicklungsbiologischen Vorgängen eine entscheidende Rolle spielt und weiterhin in aktuellen Untersuchungen am glatten Krallen-frosch Xenopus laevis Funktionen der Schleimkeratine TKα und TKγ innerhalb von Degenerationsprozessen während der Metamorphose nachgewiesen werden konnten, sind auch im Zebrabärbling Danio rerio Funktionen der Schleimkeratine TKα und TKγ im Rahmen von Entwicklungsprozessen denkbar.rn

Tensid- und Interpolyelektrolytkomplexe semiflexibler Polyelektrolyte

Hochgeladene semiflexible kationische und anionische Polyelektrolyte wurden mit niedermolekularen Tensiden zu Polyelektrolyt-Tensid-Komplexen (PETK) umgesetzt und in organischen Lösungsmitteln mit Streumethoden und Rasterkraftmikroskopie charakterisiert. Die synthetisierten PETK wurden anschließend, mit dem Ziel einer strukturkontrollierten Komplexbildung, für die Bildung von Interpolyelektrolytkomplexen (IPEK) in organischen Lösungsmitteln verwendet und anhand ihres Komplexbildungsverhaltens mit wässrigen Systemen verglichen. Die Umsetzung von zylindrischen Polymerbürsten mit Poly(styrolsulfonat)-, bzw. Poly(2-vinylpyridinium)-Seitenketten mit entgegengesetzt geladenen Tensiden verlief, trotz einer Graftingdichte von eins, quantitativ. Mit Streumethoden konnte gezeigt werden, dass die gebildeten PETK in Lösung als molekulare Zylinder vorliegen. Die Synthese von pUC19-DNA-Tensidkomplexen (DNA-TK), die sich in Alkoholen gut lösen, ist nur in stark basischer Lösung gelungen. Während der Charakterisierung der DNA-TK mit Streumethoden zeigte sich eine starke Abhängigkeit des Trägheitsradius von dem Verhältnis DNA-/Salz+. Die Bildung von IPEK aus hochgeladenen Polyelektrolyt-Bürsten bzw. PETK-Bürsten wurde an verschiedenen Beispielen in Wasser und DMF durchgeführt und mit Streumethoden verfolgt. Alle Systeme zeigten ein zu der IPEK-Bildung von linearen Polyelektrolyten analoges Komplexbildungsverhalten. Bei der Komplexierung von Poly(styrolsulfonat)-Bürsten-Tensidkomplexen mit kommerziellen Polyamidoamin-G5-Dendrimeren (PAMAM) oder Poly(ethylenoxid) modifizierten Poly(ethylenimin)-Bürsten hingegen wurden über den gesamten Gewichtsbruchbereich mit Streumethoden und AFM zylindrische Aggregate gefunden, die den Dimensionen der Poly(styrolsulfonat)-Bürsten-Tensidkomplexe entsprechen. Durch statistische Höhenanalyse der AFM-Bilder wurde ein linearer Zusammenhang zwischen der Komplexhöhe und dem Gewichtsbruch an PAMAM, bzw. PEI-PEO gefunden, der auf die Zunahme der Molmasse der Komplexe durch Wachstum entlang des Zylinderdurchmessers hindeutet. Die Bildung von Aggregaten, mit mehr als einem Polyanion, wurde nicht beobachtet.

Mechanismen der Progenitorzell-induzierten Gefäßneubildung und myokardialen Funktionsverbesserung

Entscheidend für die Sauerstoffversorgung im ischämischen Gewebe ist die Bildung von Blutgefäßen. Dieser Vorgang findet im erwachsenen Organismus in Form von Arteriogenese, Angiogenese und Vaskulogenese statt. Die Entdeckung, dass endotheliale Progenitorzellen (EPC) aus dem Knochenmark mobilisiert werden können, um sich im Ischämiegebiet an der Bildung neuer Kapillaren zu beteiligen, eröffnet einen vollkommen neuen therapeutischen Ansatz. In der hier vorliegenden Arbeit konnte in drei unterschiedlichen Tiermodellen, dem Matrigelmodell, dem Hinterlaufischämiemodell und dem Infarktmodell der Nacktmaus gezeigt werden, dass eine Zelltherapie mit EPC die Neovaskularisation steigert und zu einer myokardialen Funktionsverbesserung beiträgt. Der entscheidende Beitrag der Arbeit liegt jedoch in der Erforschung des Zeitraums der Wirkung der Stammzelltherapie. In allen drei Tiermodellen konnte durch ein spezifisches Abtöten der mit der viralen Thymidinkinase (TK) transduzierten EPC der positive Effekt auf die Neovaskularisation gestoppt werden. Im Herzinfarktmodell der Nacktmaus kam es sogar zu einer signifikanten Verschlechterung der Herzfunktion sowie zu einer Vergrößerung des Infarktareals. Dieser Effekt war durch Apoptose der Zellen in der dritten und vierten Woche nach Infarkt und Zellinfusion zu beobachten. Somit besitzen EPC nicht nur eine Rolle in der initialen Freisetzung von Zytokinen, sondern tragen auch langfristig zur Aufrechterhaltung des zelltherapeutischen Effektes bei. Ob hierfür allein der Mechanismus der Differenzierung verantwortlich ist, bleibt in weiteren Untersuchungen abzuklären. Denkbar wäre auch eine Beeinflussung des Remodeling über parakrine Langzeiteffekte. Im zweiten Teil der Doktorarbeit wurde versucht, das eingeschränkte zelltherapeutische Potential von Progenitorzellen von Patienten mit „Koronarer Herzkrankheit“ (KHK) und ischämischer Kardiomyopathie mit Hilfe zweier eNOSTranskriptionsverstärker, „eNOS-enhancer“, zu verbessern. Im Matrigelmodell der Maus konnten wir eine Verbesserung des Neovaskularisationspotentials von Knochenmarkszellen (BMC) von Patienten nach Präinkubation mit dem eNOS-enhancer nachweisen. Auch im Myokardinfarktmodell der Maus konnten eine Verbesserung der Herzfunktion und eine Reduktion der Infarktgröße beobachtet werden. Beim direkten Vergleich der beiden eNOS-enhancer konnte kein Unterschied gefunden werden. Zusammenfassend leistet die hier vorliegende Arbeit einen wichtigen Beitrag zum Verständnis für die Bedeutung von Progenitorzellen im Rahmen der Stammzelltherapie nach Myokardinfarkt. Ferner wurde die Möglichkeit aufgezeigt, durch gezielte Beeinflussung der Progenitorzellen ihr therapeutisches Potential signifikant zu steigern.