Untersuchung des immunogenen Potentials von Dense Bodies des Humanen Cytomegalovirus (HCMV) als Grundlage für die Entwicklung einer neuartigen HCMV-Vakzine

ZusammenfassungDas Humane Cytomegalovirus (HCMV) ist ein Erreger von erheblicher klinischer Bedeutung. Eine HCMV-Vakzine ist bislang nicht verfügbar. Immunität ist nur durch eine Kombination effizienter humoraler und zellulärer Effektormechanismen zu vermitteln. Inhalt der Arbeit war es zu untersuchen, ob defekte virale Partikel, sog. Dense Bodies (DB) eine derartige Immunantwort gegen HCMV induzieren können. Die Immunisierung mit DB induzierte im Mausmodell die Bildung HCMV-neutralisierender Antikörper, die über ein Jahr hinweg im Serum der Tiere nachweisbar blieben. Die Spiegel an neutralisierenden Antikörpern waren mit Titern vergleichbar, die nach einer durchlaufenen, natürlichen HCMV-Infektion in menschlichen Seren gemessen wurden. Obwohl DB ein Totantigen darstellen und keine de novo-Synthese von viralen Proteinen vermitteln, stimulierten sie zudem eine deutliche HCMV-spezifische, zytotoxische T-Zell-Antwort (CTL-Antwort). Die Analyse der T-Helferzell-Antwort ergab, dass die Applikation von DB eine Th1-artige Immunantwort auslöste, die die Kontrolle einer Virusinfektion unterstützt. DB des HCMV sind folglich geeignet, sowohl humorale als auch zelluläre Immuneffektormechanismen effizient zu induzieren. Sie erwiesen sich als ein wirksames Antigentransportsystem, das als vielversprechende Grundlage für die Entwicklung einer rekombinanten HCMV-Vakzine dienen kann. Um die Immunogenität der DB für die Anwendung am Menschen weiter zu optimieren, müssen sie um zusätzliche Epitope ergänzt werden. Derartige rekombinante DB können nur durch Konstruktion mutanter HCMV-Genome generiert werden. Daher wurden im Rahmen dieser Arbeit zwei Genombereiche des HCMV dahingehend charakterisiert, ob sie zur Insertion von Fremdsequenzen geeignet sind. Der Leserahmen UL32, der für das Phosphoprotein pp150 kodiert, erwies sich als essentiell. Mit der IE4-Region hingegen konnte ein 5 kB langes Genomfragment identifiziert werden, das aus dem Genom deletiert und gegen zusätzliche antigene Determinanten ausgetauscht werden kann. Zusammenfassend eröffnen die vorgestellten Ergebnisse neue Möglichkeiten zur Entwicklung eines wirksamen Impfstoffes gegen HCMV.

Untersuchung von Morphologie, Enzymverteilungen und Transportdynamik des Golgi-Apparates lebender Säugerzellen mittels hochauflösender MMM-4Pi-Mikroskopie in zwei Farben

Seit der Entdeckung des Golgi-Apparates im Jahre 1898 wurden seine Struktur, seine enzymatische Zusammensetzung und die Dynamik des in ihm stattfindenden Proteintransports intensiv untersucht. Dennoch blieben bis heute wesentliche Fragen zu seiner Funktionsweise unbeantwortet. So existieren nach wie vor mehrer konkurrierende Modelle zur Organisation der hoch komplexen räumlichen Verteilung seiner Enzyme sowie zum grundlegenden Mechanismus des Intra-Golgi Transports. Die Beantwortung dieser und weiterer Fragen ist für das Verständnis des Golgi-Apparates essentiell, aber aus methodischen Gründen höchst schwierig, da es bisher nicht möglich war die Struktur und Dynamik des Golgi-Apparates lebender Zellen mit der hierfür notwendigen Auflösung und Geschwindigkeit zu untersuchen. Bis heute gibt es für die funktionsmorphologischen Untersuchungen des Golgi-Apparates lebender Zellen keine echte Alternative zur Fernfeld- Fluoreszenzmikroskopie. Das MMM-4Pi-Mikroskop ermöglicht als erstes Fluoreszenzmikroskop, aufgrund seiner Auflösung von ~200 nm in der Fokalebene und 100-150 nm entlang der optischen Achse, die Untersuchung der Subkompartimente des Golgi-Apparates und kann, aufgrund seiner hohen Aufnahmegeschwindigkeit von 0.5 Hz, die Dynamik des Intra-Golgi Transports zeitlich auflösen. Ziel dieser Arbeit war es daher, den Golgi-Apparate lebender Zellen in zwei Farben sowie mit einer bisher nicht möglichen räumlichen und zeitlichen Auflösung zu untersuchen. Um die Leistungsfähigkeit der dreidimensionalen Bildgebung dieser Methode zu überprüfen, wurde erstmals der Golgi-Apparat fixierter Säugerzellen korrelativ mit dem Transmissionselektronenmikroskop und dem MMM-4Pi-Mikroskop aufgenommen. Die rekonstruierten Strukturen korrelierten in allen drei Raumrichtungen zu über 80%, was die Validität beider Methoden eindrucksvoll unter Beweis stellt. Zudem konnten mit dem MMM-4Pi-Mikroskop Aussackungen von Golgi-Cisternen aufgelöst werden, was die Eignung dieser Methode zur strukturellen Analyse der Subkompartimente des Golgi-Apparates unterstreicht. Des Weiteren wurde, in einer Reihe zweifarbiger Aufnahmeserien, die Verteilung dreier Golgi-Enzyme in lebenden Säugerzellen untersucht, und ihre mittlere relative Distanz bestimmt. Ihre aus der Literatur bekannten Lokalisationen konnten in zwei Fällen bestätigt (GalT, MannII) und in einem Fall korrigiert werden (2-OST). Im Gegensatz zu der konfokal bestimmten Cis-/Mid-Lokalisation von 2-OST zeigen die Ergebnisse der hoch aufgelösten Distanzanalyse deutlich, dass eine Mid-/Trans-Lokalisation vorliegt. Dieses Ergebnis wurde elektronenmikroskopisch überprüft und bestätigt. Da die räumliche Anordnung der Golgi-Enzyme die Reihenfolge ihrer Akitvität wiederspiegelt, ist eine möglichst präzise Bestimmung ihrer Konzentrationsverteilungen essentiell, um die Funktion des Golgi-Apparates zu verstehen. Insbesondere zeigt dieses Resultat, dass die Bestimmung der Lokalisation von Golgi-Enzymen über konfokale Kolokalisationsstudien zu falschen Ergebnissen führen kann. Die Kombination hoher räumlicher Auflösung mit einer schnellen Datenaufnahme erlaubte die Analyse der Transportdynamik innerhalb des Golgi-Apparates von Säugerzellen. In mehreren Zeitserien zweifarbiger Aufnahmen wurde der Transport des Frachtproteins VSVG relativ zum Trans-Golgi-Marker GalT untersucht. Dabei zeigte sich, dass das Trans-Golgi-Kompartiment in einigen Fällen durch eine deutliche Formänderung auf die Ankunft eines VSVG-Transportpulses reagierte und sich insgesamt wesentlich dynamischer verhielt als der Transportpuls selbst. Diese Beobachtung bestätigt tendenziell Transportmodelle, die den Golgi-Apparat nicht als statisches, sondern als dynamisches, aktiv am Transport beteiligtes Organell beschreiben. Die hier vorgestellten Experimente stellen die ersten Untersuchungen zur Verteilung von Golgi-Enzymen sowie zur Transportdynamik des Golgi-Apparates lebender Zellen mit einer dreidimensionalen Auflösung im Bereich von 100-200 nm dar. Wie am Beispiel von 2 OST gezeigt, ist es mit dem MMM-4Pi-Mikroskop allgemein möglich, die Lokalisation von Golgi-Enzymen wesentlich präziser als bisher zu bestimmen. Bei der Untersuchung dynamischer Prozesse ist in naher Zukunft eine Steigerung der Leistungsfähigkeit der Methode zu erwarten. Zum einen werden CCD-Kameras mit kürzeren Auslesezeiten und einer elektronischen Verstärkung des Signals die Datenaufnahme weiter beschleunigen. Zum anderen könnte durch die Entwicklung eines parallelisierten Mikroskops mit Einphotonen-Anregung das Bleichen konsekutiver Aufnahmen verringert werden, wodurch längere Aufnahmeserien möglich sein werden.