Expressions- und Funktionsanalysen von Neuroglobin und Cytoglobin

Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurden Untersuchungen zur Expression und Funktion der respiratorischen Proteine Neuroglobin (Ngb) und Cytoglobin (Cygb) in Vertebraten durchgeführt. Beide Globine wurden erst kürzlich entdeckt, und ihre Funktionen konnten trotz vorliegender Daten zur Struktur und biochemischen Eigenschaften dieser Proteine bisher nicht eindeutig geklärt werden. Im ersten Abschnitt der vorliegenden Arbeit wurde die zelluläre und subzelluläre Lokalisation von Neuroglobin und Cytoglobin in murinen Gewebeschnitten untersucht. Die Expression von Ngb in neuronalen und endokrinen Geweben hängt offensichtlich mit den hohen metabolischen Aktivitäten dieser Organe zusammen. Insbesondere im Gehirn konnten regionale Unterschiede in der Ngb-Expression beobachtet werden. Dabei korrelierte eine besonders starke Neuroglobin-Expression mit Gehirnbereichen, die bekanntermaßen die höchsten Grundaktivitäten aufweisen. In Anbetracht dessen liegt die Funktion des Neuroglobins möglicherweise im basalen O2-Metabolismus dieser Gewebe, wobei Ngb als O2-Lieferant und kurzfristiger O2-Speicher den vergleichsweise hohen Sauerstoffbedarf vor Ort sicherstellen könnte. Weitere Funktionen in der Entgiftung von ROS bzw. RNS oder die kürzlich publizierte mögliche Rolle des Ngb bei der Verhinderung der Mitochondrien-vermittelten Apoptose durch eine Reduktion des freigesetzten Cytochrom c wären darüber hinaus denkbar. Die Cygb-Expression im Gehirn beschränkte sich auf relativ wenige Neurone in verschiedenen Gehirnbereichen und zeigte dort vorwiegend eine Co-Lokalisation mit der neuronalen NO-Synthase. Dieser Befund legt eine Funktion des Cytoglobins im NO-Metabolismus nahe. Quantitative RT-PCR-Experimente zur mRNA-Expression von Ngb und Cygb in alternden Säugern am Bsp. der Hamsterspezies Phodopus sungorus zeigten keine signifikanten Änderungen der mRNA-Mengen beider Globine in alten im Vergleich zu jungen Tieren. Dies widerspricht publizierten Daten, in denen bei der Maus anhand von Western Blot-Analysen eine Abnahme der Neuroglobin-Menge im Alter gezeigt wurde. Möglicherweise handelt es sich hierbei um speziesspezifische Differenzen. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführte vergleichende Sequenzanalyse der humanen und murinen NGB/Ngb-Genregion liefert zum einen Hinweise auf die mögliche Regulation der Ngb-Expression und zum anderen eine wichtige Grundlage für die funktionellen Analysen dieses Gens. Es konnte ein minimaler Promotorbereich definiert werden, der zusammen mit einigen konservierten regulatorischen Elementen als Basis für experimentelle Untersuchungen der Promotoraktivität in Abhängigkeit von äußeren Einflüssen dienen wird. Bioinformatische Analysen führten zur Identifizierung des sog. „neuron restrictive silencer element“ (NRSE) im Ngb-Promotor, welches vermutlich für die vorwiegend neuronale Expression des Proteins verantwortlich ist. Die kontrovers diskutierte O2-abhängige Regulation der Ngb-Expression konnte hingegen anhand der durchgeführten komparativen Sequenzanalysen nicht bestätigt werden. Es wurden keine zwischen Mensch und Maus konservierten Bindestellen für den Transkriptionsfaktor HIF-1 identifiziert, der die Expression zahlreicher hypoxieregulierter Gene, z.B. Epo und VEGF, vermittelt. Zusammen mit den in vivo-Daten spricht dies eher gegen eine Regulation der Ngb-Expression bei verminderter Verfügbarkeit von Sauerstoff. Die Komplexität der Funktionen von Ngb und Cygb im O2-Stoffwechsel der Vertebraten macht den Einsatz muriner Modellsysteme unerlässlich, die eine sukzessive Aufklärung der Funktionen beider Proteine erlauben. Die vorliegende Arbeit liefert auch dazu einen wichtigen Beitrag. Die hergestellten „gene-targeting“-Vektorkonstrukte liefern in Verbindung mit den etablierten Nachweisverfahren zur Genotypisierung von embryonalen Stammzellen die Grundlage zur erfolgreichen Generierung von Ngb-knock out sowie Ngb- und Cygb-überexprimierenden transgenen Tieren. Diese werden für die endgültige Entschlüsselung funktionell relevanter Fragestellungen von enormer Bedeutung sein.

Segmentale Musterbildung in der terminalen Abdominalregion des zentralen Nervensystems von Drosophila melanogaster

In dieser Arbeit wurden Mechanismen der Musterbildung in der terminalen Abdominalregion des Zentralnervensystems von Drosophila melanogaster untersucht. Dazu wurden zunächst die Anzahl der angelegten Neuromere und das Muster der dort lokalisierten neuralen Stammzellen (Neuroblasten) analysiert. Dabei zeigte sich, dass sowohl die Größe der Neuromere, als auch die Anzahl an Neuroblasten von anterior nach posterior sukzessiv abnimmt, wobei keine geschlechtsspezifischen Unterschiede in der Anzahl der vorhandenen Neuroblasten festgestellt werden konnten. Durch die Kombination einer Vielzahl von molekularen Markern war es anschließend möglich, die Identität aller Neuroblasten in diesem Bereich aufzuklären und in einer Karte zusammenzutragen. Sie weisen alle eine serielle Homologie zu Neuroblasten in weiter anterior gelegenen Segmenten auf. Des Weiteren wurde die embryonale Identität der geschlechtsspezifischen Neuroblasten untersucht und deren postembryonalen mänchenspezifischen Zellstammbäume charakterisiert. Diese detaillierten Beschreibungen bildeten die Grundlage für die funktionelle Analyse von geschlechts- und segmentspezifischen Faktoren, die zur Musterbildung in dieser Region des Zentralnervensystems beitragen. So konnte gezeigt werden, dass die weibliche Isoform von doublesex den programmierten Zelltod der geschlechtsspezifischen Neuroblasten induziert, während die männliche Isoform diesen verhindert. Das Hox-Gen Abdominal-B zeigt relativ milde Effekte auf das Überleben dieser Neuroblasten, was darauf hindeutet, dass weitere Faktoren benötigt werden, um diesen Prozess in segmentspezifischer Weise zu kontrollieren. Die Funktion von Hox-Genen wurde ferner im Hinblick auf die abgeleitete Morphologie der terminalen Neuromere untersucht. Es konnte herausgefunden werden, dass die regulatorische Isoform von Abdominal-B auf mehreren Ebenen wirkt: Sie beeinflusst die Zusammensetzung bestimmter Zellstammbäume durch Modifikation von Zelldeterminationsprozessen und durch die Kontrolle des programmierten Zelltods. Außerdem unterdrückt sie die Bildung einer spezifischen Subpopulation von Neuroblasten. Allerdings benötigt Abdominal-B.r die Co-Expression des ParaHox-Gens caudal, um sein gesamtes Potenzial bezüglich der Suppression dieser Neuroblasten zu entfalten. Die vorliegende Arbeit hat somit erste Einblicke in die geschlechtsspezifische und segmentspezifische Spezifizierung der terminalen Abdominalregion des Zentralnervensystems von Drosophila auf Ebene des Neuroektoderms, der daraus hervorgehenden Neuroblasten und deren Tochterzellen gewährt. Die vollständige und detailgetreue Beschreibung des Neuroblasten-Musters und der postembryonalen männchenspezifischen Zellstammbäume hat zudem attraktive Modellsysteme für zukünftige Untersuchungen etabliert, an denen sich weitere Mechanismen der Musterbildung im Zentralnervensystem analysieren lassen.

Improving adoptive T cell therapies of cancer by ectopic expression of miR181a to repress inhibitory phosphatases

Adoptive T cell therapy using antigen-specific T lymphocytes is a powerful immunotherapeutic approach against cancer. Nevertheless, many T cells against tumor-antigens exhibit only weak anti-tumoral response. To overcome this barrier it is necessary to improve the potency and anti-tumoral efficacy of these T cells. Activation and activity of T cells are tightly controlled to inhibit unwanted T cell responses and to reduce the risk of autoimmunity. Both are regulated by extrinsic signals and intrinsic mechanisms which suppress T cell activation. The intrinsic mechanisms include the expression of phosphatases that counteract the activation-inducing kinases. Modifying the expression of these phosphatases allows the targeted modulation of T cell reactivity. MicroRNAs (miRNAs) are regulatory small noncoding RNA molecules that control gene expression by targeting messenger RNAs in a sequence specific manner. Gene-specific silencing plays a key role in diverse biological processes, such as development, differentiation, and functionality. miR181a has been shown to be highly expressed in immature T cells that recognize low-affinity antigens.rnThe present study successfully shows that ectopic expression of miR181a is able to enhance the sensitivity of both murine and human T cells. In CD4+ T helper cells as well as in CD8+ cytotoxic T cells the overexpression of miR181a leads to downregulation of multiple phosphatases involved in the T cell receptor signaling pathway. Overexpression of miR181a in human T cells achieves a co-stimulatory independent activation and has an anti-apoptotic effect on CD4+ T helper cells. Additionally, increasing the amount of miR181a enhances the cytolytic activity of murine CD8+ TCRtg T cells in an antigen-specific manner.rnTo test miR181a overexpressing T cells in vivo, a mouse tumor model using a B cell lymphoma cell line (A20-HA) expressing the Influenza hemagglutinin (Infl.-HA) antigen was established. The expression of model antigens in tumor cell lines enables targeted elimination of tumors using TCRtg T cells. The transfer of miR181a overexpressing Infl.-HA TCRtg CD8+ T cells alone has no positive effect neither on tumor control nor on survival of A20-HA tumor-bearing mice. In contrast, the co-transfer of miR181a overexpressing Infl.-HA TCRtg CD8+ and CD4+ T cells leads to improved tumor control and prolongs survival of A20-HA tumor-bearing mice. This effect is characterized by higher amounts of effector T cells and the expansion of Infl.-HA TCRtg CD8+ T cells.rnAll effects were achieved by changes in expression of several genes including molecules involved in T cell differentiation, activation, and regulation, cytotoxic effector molecules, and receptors important for the homing process of T cells in miR181a overexpressing T cells. The present study demonstrates that miR181a is able to enhance the anti-tumoral response of antigen-specific T cells and is a promising candidate for improving adoptive cell therapy.