Synaptic circuitry of ganglion cells in the mammalian retina

Before signals of the visual environment are transferred to higher brain areas via the optic nerve, they are processed and filtered in parallel pathways within the retina. In the past a plethora of functionally distinct ganglion cell types responding to certain aspects of the environment, such as direction of movement, contrast and colour have been described. Aim of this thesis was the anatomical investigation of the selectivity in retinal circuits underlying this diversity. For this purpose, mouse and macaque retinae were analysed. OFF-ganglion cells in the mouse retina received their excitatory drive unselectively from all bipolar cell types stratifying within the area of their dendritic trees. Only the input to direction-selective C6 ganglion cells and bistratified D2 ganglion cells appeared to be weighted. In primates the highly specialised midget-system forms a 1:1 connection from red- and green-sensitive cones onto midget bipolar- and ganglion cells, building the substrate for red/green colour vision. Here it was demonstrated that blue-sensitive (S-) cones also contact OFF-midget bipolars and are, thus, potential candidates to transfer blue-OFF signals to M1 intrinsically photosensitive ganglion cells (ipRGCs). M1 cells received glycinergic input from A8 amacrine cells and express GABAA receptors containing subunit alpha 3. M2 cells, in contrast, received less inhibitory input.

Elektrophysiologische Untersuchungen am experimentellen Autoimmun-Glaukom-Modell

Das Glaukom ist eine der führenden Erblindungsursachen weltweit. Trotzdem ist die Pathogenese, die zur Degeneration der retinalen Ganglienzellen führt, bisher nicht verstanden. In den letzten Jahren ergaben sich verschiedene Hinweise auf die Beteiligung einer immunologischen Komponente. Thema dieser Arbeit waren elektrophysiologische Untersuchungen, im Sinne von visuell evozierten Potentialen, am Tiermodell des Experimentellen Autoimmun Glaukoms und die Etablierung dieses Modells. Das Modell basiert auf einer Immunisierung von Lewisratten mit Pertussistoxin, inkompletten Freunds Adjuvant und potentiellen Antigenen, die zu einer Immunreaktion und einem Verlust von retinalen Ganglienzellen führen sollen. Zur Etablierung des Experimentellen Autoimmun Glaukom Modells wurde eine fünfwöchige Studie mit vier Gruppen durchgeführt. Als Antigene wurden Glia fibrilläres saures Protein (n= 10) und Myelin basisches Protein (n=10) verwendet, die beide in Studien zu Serum- und Kammerwasseranalysen bei Glaukompatienten eine Abweichung zur Kontrollgruppe gezeigt hatten. Außerdem wurde eine Gruppe mit selbst hergestelltem Sehnerv-Homogenat (n=12) immunisiert. Eine Gruppe erhielt keine Immunisierung und diente als Kontrolle (n=10). Zur Überprüfung der Effekte des Modells dienten verschiedene Untersuchungsmethoden, wie die Augeninnendruckmessung und die Untersuchung der Fundi. Des Weiteren wurden transiente und stationäre visuell evozierte Potentiale abgeleitet und die Latenzen, Amplituden und die Marker S (Steigung) und TR (Temporale Antworten) verglichen. Außerdem erfolgte nach Tötung der Tiere die Entnahme der Gehirne und Augen. Die Gehirne wurden nach Paraffineinbettung geschnitten, mit Luxol Fast Blue und Kresylviolett gefärbt und hinsichtlich etwaiger Entmarkungsherde oder anderer Pathologien unter dem Mikroskop bewertet. Der Verlauf des intraokulären Drucks zeigte sowohl zwischen den Gruppen als auch zwischen den verschiedenen Zeitpunkten keine signifikanten Unterschiede. Er bewegte sich im physiologischen Bereich mit durchschnittlich circa 12 mmHg. Die Funduskopien lieferten zu keinem Zeitpunkt krankhafte Veränderungen. Auch die visuell evozierten Potentiale lieferten zwischen den Gruppen keine signifikanten Unterschiede, sondern belegten normale visuelle Funktion bei allen Tieren. Die Auswertung der histologischen Untersuchung der Hirnschnitte zeigte keine Entmarkungsherde. Die erzielten Ergebnisse dieser Arbeit legen nahe, dass der retinale Ganglienzellverlust beim Experimentellen Autoimmun Glaukom Modell ohne eine Augeninnendruckerhöhung stattfindet. Die Fundusuntersuchung und die visuell evozierten Potentiale, wie in diesem Versuchsaufbau durchgeführt, scheinen nicht sensibel genug zu sein, diese Verluste nachzuweisen. In weiteren Arbeiten sollten andere Methoden zum Nachweis der retinalen Ganglienzellverluste erprobt werden. Neben elektrophysiologischen Methoden bieten sich für das weitere Vorgehen besonders immunhistologische Methoden an. Außerdem sollten die Mechanismen erforscht werden durch die es nach der Immunisierung zur Apoptose von retinalen Ganglienzellen kommt und welche Antikörper dazuführen können. Des Weiteren ist von Interesse, ob und wie eine zelluläre Komponente an der Pathogenese des Experimentellen Autoimmun Glaukoms beteiligt ist.

Analyse immunologischer und proteomischer Aspekte im Rahmen der Glaukompathogenese

Das Glaukom stellt eine heterogene Gruppe von okularen Erkrankungen dar, deren Pathogenese sich durch einen langsamen, progradienten Untergang von retinalen Ganglienzellen und ihren Axonen auszeichnet. rnIn den letzten Jahren wurde im Kontext der Glaukompathogenese verstärkt die Beteiligung autoreaktiver Antikörper diskutiert. Ein Schwerpunkt dieser Arbeit bestand in dem Vergleich solcher Autoantikörper-Reaktionen in den Serum- und Kammerwasserproben einzelner Glaukompatienten. Hierdurch sollte geklärt werden, inwieweit die Immunreaktivitäten dieser beiden Körperflüssigkeiten miteinander übereinstimmen und ob sich Hinweise auf eine lokale Antikörperproduktion im immunprivilegierten Auge finden lassen. Mittels eines etablierten Protein-Microarray-Verfahrens wurden die Immunreaktionen gegen 40 verschiedene Antigene, wie z.B. Hitzeschock-Proteine oder neuronale Strukturproteine, untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass die detektierten Autoantikörper-Reaktionen gegen mehr als 80% der untersuchten Antigene in beiden Körperflüssigkeiten miteinander übereinstimmen. Verdeutlicht wird hierdurch, dass die Antikörper-basierenden immunologischen Vorgänge im Auge bzw. Kammerwasser, trotz dessen Abschottung vom Blutkreislauf durch die Blut-Retina-Schranke, denen des Serums stark ähneln. Nur vereinzelt lassen sich Hinweise auf eine lokale Antikörperproduktion im Auge finden, wodurch die Bedeutung der detektierten Serumantikörper-Reaktionen für die Glaukomerkrankung belegt wird. rnEin weiterer Schwerpunkt der Arbeit lag auf der Detektion möglicher veränderter Proteinexpressionen in den Retinae und Serumproben von Glaukompatienten, die potentiell zu den neurodegenerativen Prozessen der Glaukompathogenese beitragen. Um die Analyse spezifischer Proteinexpressionen zu ermöglichen, wurde das Verfahren des Antikörper-Microarrays etabliert und auf die Fragestellung angewendet. Untersucht wurden hierbei vor allem die Abundanzen von Komplementproteinen, Zytokinen und Hitzeschock-Proteinen, aber auch die von verschiedenen neuronalen Strukturproteinen. Als Probenmaterial dienten Serum- und Retinaproben von Glaukompatienten, die vergleichend denen von gesunden Probanden gegenübergestellt wurden. Die Analyse erbrachte die Erkenntnis, dass neben der verstärkten Expression von Komplementproteinen in der Retina (z.B. C3, C6) auch im Serum der Glaukompatienten eine erhöhte Konzentration dieser Proteine vorliegt, die im Rahmen der Glaukomerkrankung möglicherweise ebenfalls eine Rolle spielen. Ähnliches konnte für verschiedene Zytokine, wie z.B. TNF-α, IFN-γ oder IL1-β beobachtet werden, die in den untersuchten Retinae von Glaukomprobanden, teilweise auch in den Serumproben der Patienten, in verstärktem Maße detektiert werden konnten. Die erhöhte Produktion von Zytokinen in der Retina ist wahrscheinlich auf die Aktivierung von Gliazellen zurückzuführen, ein Ereignis für das in dieser Arbeit zahlreiche Hinweise gefunden werden konnten. Die Gliaaktivierung wird vermutlich durch apoptotische Prozesse in der Retina ausgelöst, eventuell aber auch durch eine erfolgte Komplementaktivierung. Darüber hinaus konnten mittels eines massenspektrometrischen Verfahrens weitere Expressionsunterschiede verschiedener retinaler Proteine bei Glaukompatienten festgestellt werden. Diese Veränderungen, wie z.B. geminderte Mengen von ROS-eliminierenden Proteinen, wie der Superoxid Dismutase und Peroxiredoxin-2, begünstigen bzw. verstärken sehr wahrscheinlich die neurodegenerativen Prozesse in der Retina von GlaukompatientenrnInwieweit die untersuchten Faktoren kausativ an den neurodegenerativen Prozessen beteiligt sind, bleibt ungeklärt, jedoch untermauert deren Vielzahl die Notwendigkeit, die Ursache der Glaukomerkrankung als komplexe Interaktion und Wechselwirkung verschiedener Komponenten zu betrachten und nicht als einen einzelnen fehlgesteuerten Mechanismus.rn

Identifizierung und Charakterisierung von Protein-Biomarkern beim Glaukom

Das Glaukom ist, nach dem Katarakt, die zweithäufigste Ursache für Erblindungen weltweit mit Milionen von Betroffenen, die von dieser zunächst weitgehend symptomfreien neurodegenerativen Erkrankung heimgesucht werden. Die Möglichkeiten auf dem Feld der Diagnose beschränken sich bislang weitestgehend auf die Messung des Augeninnendrucks und der Beurteilung des Augenhintergrundes durch einen erfahrenen Augenarzt. Eine labordiagnostische Prophylaxe ist bis heute nicht verfügbar, die Zahl unerkannter Erkrankungen dementsprechend hoch. Hierdurch geht wertvolle Zeit verloren, die man für eine effektive Therapie nutzen könnte.rnBezüglich der Pathogenese des Glaukoms geht man heute von mehreren, miteinander wechselwirkenden Pathomechanismen aus, zu denen neben mechanischen Einflüssen durch einen erhöhten IOD auch Hypoxie, verminderte Neutrophinversorgung, Exzitotoxizität, oxidativer Stress und eine Beteiligung autoimmuner Prozesse gezählt werden. Unabhängig vom Pathomechanismus folgt stets die Etablierung umfangreicher degenerativer Prozesse im Sehnervenkopf, den retinalen Ganglienzellen und den Axonen des Sehnerven, die letztlich im irreversiblen Untergang dieser Neuronen münden. Diese pathologischen Prozesse im ZNS hinterlassen auf Proteomebene Spuren, die mithilfe moderner massenspektrometrischer Methoden in Kombination mit multivariaten statistischen Methoden detektierbar und als sogenannte Biomarker-Kandidaten mit definiertem Molekulargewicht darstellbar sind. In dieser Arbeit wurde ein „Workflow“ entwickelt, der es ermöglicht, diese Biomarker-Kandidaten im Blutserum und in der Tränenflüssigkeit in einfachen, reproduzierbaren Schritten zu identifizieren und zu charakterisieren. Abweichend von der etablierten Methotik der Bottom-Up-Proteomics musste hierfür eine Methode entsprechend einer Top-Down-Philosophie entwickelt werden, die es erlaubt, die Spuren des Glaukoms im Proteom zu detektieren und zu charakterisieren.rnDies erfolgte in dieser Arbeit durch sowohl massenspektroskopischen Methoden wie SELDI-TOF® und MALDI-Tof-Tof als auch durch Bead-, Gel- und Flüssigkeits-chromatographisch-basierte Separations und Fraktionierungstechniken.rnDie erfolgreiche Kombination dieser Methoden führte zu Identifikationen einer ganzen Reihe von Biomarker-Kandidaten. Unter den identifizierten Proteinen, die bezüglich ihres korrespondierenden SELDI-Peaks im Massenbereich von Biomarker-Kandidaten liegen, finden sich Zytokine und Effektormoleküle der angeborernen Immunität, stressinduzierbare Kinasen, Faktoren, die zum Schutz der Telomeren dienen, Proliferationsmarker, neuronale Antigene und Transportproteine. Darüber hinaus wurden Komponenten identifiziert, die an der neuronalen Neutrophinversorgung beteiligt sind, neuronale Rezeptoren und Antigene, Komponenten des Komplementsystems und des MHC-I-Komplexes. All diese identifizierten Proteine sind bezüglich ihrer Funktion und möglichen Rolle innerhalb der Pathogenese des Glaukoms detailliert beschrieben und charakterisiert. Dies erlaubt einen umfassenden Einblick in alle Pathomechanismen, denen nach heutigem Kenntnisstand, eine Rolle an der Pathogenese des Glaukoms unterstellt wird.rn