Untersuchungen der Aktivierungs- und Effektorwege von T-Helferzellen in der Pathogenese vaskulärer inflammatorischer Prozesse

T-Zellen sind an der Induktion und Erhaltung chronischer Entzündungen maßgeblich beteiligt. Im Bereich kardiovaskulärer Erkrankungen konnte eine Beteiligung von T-Zellen an der Entstehung von Ateriosklerose, Bluthochdruck und arterieller Thrombose aufgezeigt werden. Allerdings sind sowohl die Mechanismen ihrer Aktivierung, als auch die für die Entstehung und Persistenz vaskulärer Entzündung relevanten Effektorfunktionen weitgehend unbekannt. rnIn der vorliegenden Arbeit konnte erstmals in zwei Mausmodellen gezeigt werden, dass sowohl die dem Bluthochdruck zugrundeliegende Entzündung der Arterienwände als auch die durch venöse Thrombose ausgelöste Entzündung der Venenwand zu einer selektiven Einwanderung von CD4+ und CD8+ T-Zellen mit einem Effektor-Gedächtniszell-Phänotyp führt. Mit Hilfe von Nur77-GFP-transgenen Mäusen konnte gezeigt werden, dass die in die entzündeten Gefäßwände eingewanderten T-Zellen lokal T-Zell-Rezeptor-unabhängig aktiviert werden.rnBluthochdruck und venöse Thrombose sind durch eine verstärkte Expression eines ähnlichen Musters an Zytokinen und Chemokinen in den Gefäßwänden begleitet, das in rekombinanter Form in einem Teil der Effektor-T-Gedächtniszellen die Bildung von IFN-γ auslöst. Die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse weisen erstmals eine Beteiligung von T-Zellen an der Entzündung der Venenwand im Rahmen einer venösen Thrombose nach. Des Weiteren konnten erstmals Hinweise darauf gefunden werden, dass T-Zellen Gefäßentzündungen durch eine Zytokin-induzierte IFN-γ-Bildung erhalten und verstärken.rn

Transgene Mausmodelle zur Untersuchung von Nervenzellwanderungen

Im Rahmen dieser Arbeit wurden transgene Mausmodelle hergestellt, die eine weitere Aufklärung der Rolle des Transkriptionsfaktors Pax6 bei der Wanderung von Nervenzellen ermöglichen, sowie ein Kultursystem zur Darstellung embryonaler Wanderungen außerhalb des Mutterleibs entwickelt.Bei der YAC-transgenen Mäuselinie PhPax6-taulacZ wird das Reportergen taulacZ unter der Kontrolle des Pax6-Promotors exprimiert. Dadurch ist dort, wo Pax6 im Zellkern vorliegt, der Rest der Zelle über seine gesamte Ausdehnung mit der vom taulacZ-Transgen kodierten tau-b-Galactosidase markiert. Das räumlich-zeitliche Expressionsmuster von Pax6 und dem Transgen taulacZ wurde detailliert untersucht. Dabei wurde eine hohe Übereinstimmung festgestellt. Basierend auf der Darstellung der Zellen in ihrer gesamten Ausdehnung, die durch das taulacZ-Transgen erstmals möglich ist, wurde eine Klassifizierung Pax6-positiver Zelltypen vorgenommen. Zunächst wird Pax6 in Neuroepithelzellen, später in radialen Gliazellen exprimiert.Mit der zweiten transgenen Mäuselinie, PhPax6-tTA, wurde ein Werkzeug hergestellt, das die gezielte und hoch spezifische Expression von beliebigen Transgenen in Pax6-exprimierenden Zellen ermöglicht. In Pax6-positive Zellen der Medulla wurde das Grün Fluoreszierende Protein (GFP) eingeführt und das Wanderungsverhalten in vitro über mehrere Tage dargestellt. Erstmals können mit dieser Linie beliebige Expressionskonstrukte gezielt, hocheffizient und schnell in wandernde Neurone eingebracht werden, ohne störende Hinter-grundexpression in anderen Zellen.

Production, purification, properties and application of the cellulases from a wild type strain of a yeast isolate

Kurzzusammenfassung Produktion, Reinigung, Eigenschaften und Anwendung von Cellulasen eines Wildtyp-Hefeisolates. Die effiziente Verwendung von Cellulose wird in naher Zukonft ein wichtiges Instrument zur Vermeidung einer Nahrungsmittel- und Energieknappheit werden. Deshalb haben wir uns intensiv mit Cellulasen befaßt, die aus Hefestämmen isoliert wurden. Die Fähigkeit der Cellulase-produktion eines Hefe-Stammes der Feuerwanze Pyrrhocoris apterus wurde genauer untersucht. Die systematische Stellung des Hefe-Isolates PAG1 wurde durch Sequenzierung der 18S rDNA bestimmt. Es zeigte eine nahe Verwandtschaft zu einem bereits beschriebenen Stämme der Gattung Trichosporon. Außerdem wurden die Wachstums-bedingungen für eine optimale Cellulase–Produktion bestimmt. Anschließend konnte eine der produzierten Cellulasen mit FPLC aufgereinigt und deren biochemische Eigenschaften (z.B. Substratspezifität, Temperatur optimum, optimaler pH-Wert, Einfluß von Chemikalien) untersucht werden. Eine Analyse der Abbau-Produkte zeigte, daß kristalline Cellulose und CMC zu Cellobiose, Cellulotriose, Cellulotetraose und Cellulopentaose in einem molaren Verhältnis von 32:16:8:1 umgesetezt wurden. Bei Zusatz von ?-Glykosidase aus demselben Hefestamm entstand nur Glucose und Cellobiose in einem molaren Verhältnis von 1:10. Da bisher nur eine Publikation über Cellulase-produzierende Hefe-Stämme erschienen ist, zeigen auch unsere Untersuchungen, daß Wildtyp-Hefestämme Cellulasen mit interessanten Eigenschaften produzieren können.

Differential cell type-specific transcriptional regulation of the CYP1A1 gene

Cytochrome P450 1A1 (CYP1A1) monooxygenase plays an important role in the metabolism of environmental pollutants such as polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) and halogenated polycyclic aromatic hydrocarbons (HAHs). Oxidation of these compounds converts them to the metabolites that subsequently can be conjugated to hydrophilic endogenous entities e.g. glutathione. Derivates generated in this way are water soluble and can be excreted in bile or urine, which is a defense mechanism. Besides detoxification, metabolism by CYP1A1 may lead to deleterious effects since the highly reactive intermediate metabolites are able to react with DNA and thus cause mutagenic effects, as it is in the case of benzo(a) pyrene (B[a]P). CYP1A1 is normally not expressed or expressed at a very low level in the cells but it is inducible by many PAHs and HAHs e.g. by B[a]P or 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD). Transcriptional activation of the CYP1A1 gene is mediated by aryl hydrocarbon receptor (AHR), a basic-helix-loop-helix (bHLH) transcription factor. In the absence of a ligand AHR stays predominantly in the cytoplasm. Ligand binding causes translocation of AHR to the nuclear compartment, its heterodimerization with another bHLH protein, the aryl hydrocarbon nuclear translocator (ARNT) and binding of the AHR/ARNT heterodimer to a DNA motif designated dioxin responsive element (DRE). This process leads to the transcriptional activation of the responsive genes containing DREs in their regulatory regions, e.g. that coding for CYP1A1. TCDD is the most potent known agonist of AHR. Since it is not metabolized by the activated enzymes, exposure to this compound leads to a persisting activation of AHR resulting in diverse toxic effects in the organism. To enlighten the molecular mechanisms that mediate the toxicity of xenobiotics like TCDD and related compounds, the AHR-dependent regulation of the CYP1A1 gene was investigated in two cell lines: human cervix carcinoma (HeLa) and mouse hepatoma (Hepa). Study of AHR activation and its consequence concerning expression of the CYP1A1 enzyme confirmed the TCDD-dependent formation of the AHR/ARNT complex on DRE leading to an increase of the CYP1A1 transcription in Hepa cells. In contrast, in HeLa cells formation of the AHR/ARNT heterodimer and binding of a protein complex containing AHR and ARNT to DRE occurred naturally in the absence of TCDD. Moreover, treatment with TCDD did not affect the AHR/ARNT dimer formation and binding of these proteins to DRE in these cells. Even though the constitutive complex on DRE exists in HeLa, transcription of the CYP1A1 gene was not increased. Furthermore, the CYP1A1 level in HeLa cells remained unchanged in the presence of TCDD suggesting repressional mechanism of the AHR complex function which may hinder the TCDD-dependent mechanisms in these cells. Similar to the native, the mouse CYP1A1-driven reporter constructs containing different regulatory elements were not inducible by TCDD in HeLa cells, which supported a presence of cell type specific trans-acting factor in HeLa cells able to repress both the native CYP1A1 and CYP1A1-driven reporter genes rather than species specific differences between CYP1A1 genes of human and rodent origin. The different regulation of the AHR-mediated transcription of CYP1A1 gene in Hepa and HeLa cells was further explored in order to elucidate two aspects of the AHR function: (I) mechanism involved in the activation of AHR in the absence of exogenous ligand and (II) factor that repress function of the exogenous ligand-independent AHR/ARNT complex. Since preliminary studies revealed that the activation of PKA causes an activation of AHR in Hepa cells in the absence of TCDD, the PKA-dependent signalling pathway was the proposed endogenous mechanism leading to the TCDD-independent activation of AHR in HeLa cells. Activation of PKA by forskolin or db-cAMP as well as inhibition of the kinase by H89 in both HeLa and Hepa cells did not lead to alterations in the AHR interaction with ARNT in the absence of TCDD and had no effect on binding of these proteins to DRE. Moreover, the modulators of PKA did not influence the CYP1A1 activity in these cells in the presence and in the absence of TCDD. Thus, an involvement of PKA in the regulation of the CYP1A1 Gen in HeLa cells was not evaluated in the course of this study. Repression of genes by transcription factors bound to their responsive elements in the absence of ligands has been described for nuclear receptors. These receptors interact with protein complex containing histone deacetylase (HDAC), enzyme responsible for the repressional effect. Thus, a participation of histone deacetylase in the transcriptional modulation of CYP1A1 gene by the constitutively DNA-bound AHR/ARNT complex was supposed. Inhibition of the HDAC activity by trichostatin A (TSA) or sodium butyrate (NaBu) led to an increase of the CYP1A1 transcription in the presence but not in the absence of TCDD in Hepa and HeLa cells. Since amount of the AHR and ARNT proteins remained unchanged upon treatment of the cells with TSA or NaBu, the transcriptional upregulation of CYP1A1 gene was not due to an increased expression of the regulatory proteins. These findings strongly suggest an involvement of HDAC in the repression of the CYP1A1 gene. Similar to the native human CYP1A1 also the mouse CYP1A1-driven reporter gene transfected into HeLa cells was repressed by histone deacetylase since the presence of TSA or NaBu led to an increase in the reporter activity. Induction of reporter gene did not require a presence of the promoter or negative regulatory regions of the CYP1A1 gene. A promoter-distal fragment containing three DREs together with surrounding sequences was sufficient to mediate the effects of the HDAC inhibitors suggesting that the AHR/ARNT binding to its specific DNA recognition site may be important for the CYP1A1 repression. Histone deacetylase is recruited to the specific genes by corepressors, proteins that bind to the transcription factors and interact with other members of the HDAC complex. Western blot analyses revealed a presence of HDAC1 and the corepressors mSin3A (mammalian homolog of yeast Sin3) and SMRT (silencing mediator for retinoid and thyroid hormone receptor) in both cell types, while the corepressor NCoR (nuclear receptor corepressor) was expressed exclusively in HeLa cells. Thus the high inducibility of CYP1A1 in Hepa cells may be due to the absence of NCoR in these cells in contrast to the non-responsive HeLa cells, where the presence of NCoR would support repression of the gene by histone deacetylase. This hypothesis was verified in reporter gene experiments where expression constructs coding for the particular members of the HDAC complex were cotransfected in Hepa cells together with the TCDD-inducible reporter constructs containing the CYP1A1 regulatory sequences. An overexpression of NCoR however did not decrease but instead led to a slight increase of the reporter gene activity in the cells. The expected inhibition was observed solely in the case of SMRT that slightly reduced constitutive and TCDD-induced reporter gene activity. A simultaneous expression of NCoR and SMRT shown no further effects and coexpression of HDAC1 with the two corepressors did not alter this situation. Thus, additional factors that are likely involved in the repression of CYP1A1 gene by HDAC complex remained to be identified. Taking together, characterisation of an exogenous ligand independent AHR/ARNT complex on DRE in HeLa cells that repress transcription of the CYP1A1 gene creates a model system enabling investigation of endogenous processes involved in the regulation of AHR function. This study implicates HDAC-mediated repression of CYP1A1 gene that contributes to the xenobiotic-induced expression in a tissue specific manner. Elucidation of these processes gains an insight into mechanisms leading to deleterious effects of TCDD and related compounds.

Cis- und trans-Regulation bei Drosophila-T-Box-Genen

Die räumliche und zeitliche Organisation von Genexpression ist für die Entwicklung und das Funktionieren eines jeden Lebewesens von immenser Bedeutung. Dazu laufen eine Vielzahl von Regulationsprozessen auf unterschiedlichen Ebenen ab. In dieser Arbeit wurden im ersten Teil Untersuchungen zur Genregulation des Drosophila optomotor-blind Genes und zur Funktion des Omb Proteins durchgeführt. Eine Mutante, der ein großer Teil der upstream regulatory region (URR) fehlt wurde erzeugt, aus einer Vielzahl von Linien isoliert und molekular charakterisiert. Die biologischen Auswirkungen dieser Deletion werden in Shen et al. (2008) beschrieben. Plasmide zur Erzeugung transgener Fliegen, mit deren Hilfe eine bereits von Sivasankaran et al. (2000) durchgeführte Enhancer-reporter-Analyse vervollständigt werden sollte, wurden hergestellt. Die bereits bekannte Inversion In(1)ombH31 wurde molekular kartiert. Eine Reihe von Konstrukten mit Punktmutationen in der Omb T-Domäne wurden generiert, die unter anderem über deren Funktion hinsichtlich DNA-Protein Interaktion und einer potentiellen Metallionenbindefähigkeit (ATCUN) hin Aufschluss geben sollen. Des Weiteren wurde eine Reihe von P-Element-Deletionslinien auf den Verlust eines alternativen omb Transkriptionsstartpunktes hin untersucht, mit dem Ziel eine vollständige Protein-Nullmutante zur Verfügung zu haben. Der zweite Abschnitt dieser Arbeit befasste sich mit der Erzeugung von Dpp-GFP-Fusionskonstrukten, mit deren Hilfe weitere Erkenntnisse über den Dpp-Langstreckentransport erhofft werden. Es wurde außerdem damit begonnen bei einem weitern Drosophila T-Box Transkriptionsfaktor, Optomotor-blind related gene-1 (Org-1), eine Reihe von Varianten mit homopolymeren polyAlanin und polyGlutamin Expansionen unterschiedlicher Länge herzustellen. Durch Experimente mit diesen Konstrukten soll Aufschluss darüber gewonnen werden, ob Glutamin-Expansionen, wie in der Literatur vorgeschlagen, aktivierend und Alanin-Expansionen in Transkriptionsfaktoren vielleicht reprimierend auf Genaktivität wirken. Letztlich wurden in dieser Arbeit im Rahmen des DROSDEL Projektes (Ryder et al., 2004, 2007) Deletionen in der distalen Hälfte des Chromosomenarms 3R hergestellt. Der DROSDEL Deletionskit, der durch eine Kooperation europäischer Labore entstand stellt der Drosophila Forschung einen umfassenden Satz molekular basengenau definierter Defizienzen zur Verfügung.

Charakterisierung spezieller pflanzlicher Gamma-Tubulin-Sequenzbereiche und Detektion potentieller Interaktionspartner mittels Yeast-two-Hybrid-System

Mitotische und postmitotische Vorgänge pflanzlicher Zellen basieren auf der Funktion von Mikrotubuli. Es liegen nur wenige gesicherte Erkenntnisse zur Organisation dieser Multifunktionalität vor. Eine zentrale Bedeutung wird bei der Nukleation der Mikrotubuli an MTOCs durch γ-Tubulin zugeschrieben. Deren Zusammenlagerung an MTOCs ist jedoch noch nicht richtig verstanden. Domänen, die an der Proteinoberfläche exponiert werden, könnten in Interaktionen involviert sein. Hier werden im Besonderen der γ-A und γ-B-Peptivmotiv diskutiert. Es wurde das γ-A- und γ-B-Peptidmotiv des γ-Tubulins hinsichtlich einer Konservierung innerhalb des Pflanzenreiches untersucht. Die beiden Bereiche sind bei den grünen Landpflanzen stark konserviert. Sie divergieren stark zu den einzelligen Grünalgen Chlamydomonas reinhardtii und Chlorella spec. Es wurden daher in der bestehenden phylogentischen Lücke weitere Organismen hinsichtlich des γ-A und γ-B Peptidmotivs untersucht. Auswahlkriterien der Organismen waren Ein-/Mehrzelligkeit, Besitz/Abwesenheit von Centriolen und Besitz/Abwesenheit von Geißeln. Des weiteren wurde mit verschiedenen γ-Tubulin-Konstrukten um das γ-A- und γ-B-Peptidmotiv, gewonnen aus Nicotiana tabacum (BY2) mittels Y2H-System nach Interaktionspartnern gesucht. Bei den Sequenzuntersuchungen des γ-A- und γ-B-Peptidmotivs konnte festgestellt werden, dass die Konservierung innerhalb der Streptophytenlinie erfolgt. Interessant erweist sich die Tatsache, dass dieses Motiv bei den Jochalgen, welche ebenfalls den Streptophyten angehören, nur im γ-A-Peptidmotiv auftritt. Es besteht die Möglichkeit, dass die beiden potentiellen Interaktionspartner verschiedene Proteine als Interaktions-partner besitzen. Durch eine Anwendung eines auf dem GAL4-Protein basierenden Y2H-Systems mit vier unterschiedlichen Konstrukten des γ-Tubulin-A/B-Peptidbereichs als Köder-konstrukt und einer cDNA-Bibliothek als Beutekonstrukt, wurden diverse Sequenzen identifiziert. Identifiziert wurden das Poly(A)-Bindeprotein, Glycerin-aldehyd-3-phosphatdehydrogenase, die S-adenosyl-L-methionine-Synthetase, diverse Proteasom-Untereinheiten, eine sekretorische Peroxidase, eine Ascorbat-Peroxidase, die NtPOX1-Peroxidase und verschiedene Peroxidasen aus Nicotiana tabacum, Sequenzen des Chloroplastengenoms, ein Myosin-ähnliches Protein und eine Sequenz auf dem 5. Chromosom des Medicago truncatula-Klons mth2-16f8 und diverse humane Sequenzen der Proteine DKFZp68 und DKFZp77. Die Ergebnisse weisen auf eine komplexe Funktionsweise der unterschiedlichen Komponenten des pflanzlichen Cytoskeletts und des γ-Tubulins hin. Zur Aufklärung müsste dies in Zukunft mittels anderer genetischer, biochemischer oder funktioneller Methoden untersucht werden. Hypothesen über Interaktionen der Cytoskelettkomponenten können wahrscheinlich nicht allein durch die Anwendung des Y2H-Systems aufgeklärt werden.

Mechanistic study of the effects of 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) on reporter gene expression in mammalian cells

DNA damage causes replication errors, leading to genetic instability or cell death. Besides that, many types of DNA base modifications have been shown to interfere with transcriptional elongation if they are located in the transcribed DNA strand of active genes, acting as roadblocks for RNA polymerases. It is widely assumed that transcription blockage by endogenous DNA damage is responsible for the early cell senescence in organs and accelerated ageing observed in individuals with compromised nucleotide excision repair.rnThe aims of this work were to design new experimental systems for testing transcription blocking potentials of DNA base modifications in an individual gene and to apply these test systems to the investigation of the effects of a frequent endogenously generated base modification, namely 8-oxo-7,8-hydroxyguanine (8-oxoG), on the gene transcription in cells. Several experimental strategies were employed for this purpose. First, I constructed an episomal vector encoding for a short-lived EGFP-ODC fusion protein and measured expression of the reporter gene in permanently transfected clonal cell lines exposed to DNA damaging agents. Second, the expression of plasmid-borne EGFP gene damaged with photosensitisers to obtain one or several oxidative purine modifications per plasmid molecule was determined in transiently transfected human and mouse host cells in an approach known as “host cell reactivation”. As a prerequisite for these experiments, a robust method of precise quantitative measurement of the EGFP gene expression in transiently transfected cells by flow cytometry was developed and validated. Third, I elaborated a very efficient procedure for insertion of synthetic oligonucleotides carrying 8-oxoG into plasmid DNA, avoiding any unwanted base damage and strand breaks. The consequences of 8-oxoG placed in defined positions in opposing DNA strands of the EGFP gene for transcription were measured by host cell reactivation in cells with functional 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) gene and in OGG1 null cells.rnThe results obtained in Ogg1-/- cells demonstrated that unrepaired 8-oxoG, even if situated in the transcribed DNA strand, does not have any negative effect on the reporter gene transcription. On the other hand, as few as one 8-oxoG was sufficient to cause a significant decrease of the gene expression in OGG1-proficient cell lines, i.e. in the presence of base excision repair. For two analysed positions of 8-oxoG in the plasmid DNA, the inhibition of gene transcription by the base modification correlated with the efficiency of its excision by purified OGG1 protein under cell-free conditions. Based on these findings, it has to be concluded that the observed decrease of transcription is mediated by excision of the base modification by OGG1 and probably caused by the repair-induced single-strand breaks. The mechanism of transcription inhibition by 8-oxoG is therefore clearly distinct from stalling of elongating RNA polymerase II complexes at the modified base.

Charakterisierung einer pflanzlichen Variante des Cytoskelettproteins gamma-Tubulin durch Strukturmodellierung, Überexpression und Analyse der Interaktionspartner

Wie alle Eukaryoten besitzen auch höhere Pflanzen ein mikrotubuläres Cytoskelett. Einige Funktionen dieses Cytoskeletts sind relativ stark konserviert, andere dagegen scheinen sehr pflanzenspezifisch zu sein. Dies betrifft insbesondere charakteristische mikrotubuläre Netzwerke, die bei der Neubildung und der Verstärkung der Zellwände wichtige Rollen übernehmen. Wie der Aufbau dieser Netzwerke kontrolliert wird, ist bisher relativ unklar. Typische Mikrotubuli organisierende Zentren (MTOC), insbesondere Centrosomen oder Spindelpolkörper, sind bei höheren Pflanzen nicht beobachtet worden. Von pilzlichen und tierischen Organismen weiß man, dass gamma-Tubulin (gTUB) mit seinen assoziierten Proteinen in den MTOC bei der Nukleation von Mikrotubuli eine Schlüsselfunktion hat. Dieses Mitglied der Tubulin-Superfamilie wird aber auch in Pflanzen gefunden, dessen genaue Funktion bisher unbekannt ist. Zu Beginn der Arbeit wurden mittels in silico Berechnungen Strukturmodelle des pflanzlichen gTUBs aus Nicotiana tabacum erarbeitet, da die Struktur, die zu einem Verständnis der pflanzlichen Wachstumsregulation beitragen könnte, bisher unbekannt ist. Auf Grundlage der bioinformatischen Daten konnte für weitere Studien eine notwendige gTUB-Deletionsmutante entwickelt werden. Für Röntgendiffraktionsstudien und gTUB-Interaktionspartneranalysen war die Verfügbarkeit verhältnismäßig großer Proteinmengen notwendig. Die Expression der gTUB-Volllängensequenz in gelöster und aktiver Form stellte einen immanent wichtigen Zwischenschritt dar. Das Escherichia coli T7/lacO-Expressionssystem lieferte, trotz vielversprechender Erfolge in der Vergangenheit, kein gelöstes rekombinantes gTUB. So wurden zwar verhältnismäßig hohe Expressionsraten erzielt, aber das rekombinante gTUB lag quantitativ als Inclusion bodies vor. Eine Variationen der Expressionsparameter sowie umfangreiche Versuche mittels verschiedenster Konstrukte sowie potentiell die Löslichkeit erhöhenden Tags gTUB in gelöster Form in E. coli zu exprimieren blieben erfolglos. Eine Denaturierung der Inclusion bodies und Rückfaltung wurde aufgrund der wohl bei der Tubulinfaltung notwendigen komplexeren Chaperone sowie thermodynamischer Überlegungen ausgeschlossen. Die höher evolvierte Chaperonausstattung war ein Hauptgrund für die Verwendung der eukaryotischen Hefe-Expressionssysteme K. lactis und des S. cerevisiae-Stammes FGY217 zur gTUB-Expression. So konnten nach der Selektion nur transgene Hefe-Zellen dokumentiert werden, die die gTUB-Expressionskassette nachweislich an der vorgesehenen Zielposition in ihrem Genom integrierten, aber keine dokumentierbare Expression zeigten. Die wahrscheinlichste Begründung hierfür ist, dass ein erhöhter intrazellulärer gTUB-Titer mit dem Zellwachstum und der Zellteilung dieser eukaryotischen Organismen interferierte und durch Rückkopplungen die rekombinante gTUB-CDS aus N. tabacum ausgeschaltet wurde. Der Versuch einer transienten gTUB-Überexpression in differenzierten Blattgeweben höherer Pflanzen war eine logische Konsequenz aus den vorherigen Ergebnissen und lieferte, wenn auch nicht die für eine Proteinkristallisation notwendigen Mengen, gelöstes gTUB. Bestrebungen einer stabilen Transfektion von A. thaliana oder BY-2-Zellkulturen mit einer gTUB-CDS lieferten keine transgenen Organismen, was starke Interferenzen der rekombinanten gTUB-CDS in den Zellen vermuten lies. Transfektionsversuche mit nur GFP tragenden Konstrukten ergaben hingegen eine hohe Anzahl an transgenen Organismen, die auch verhältnismäßig starke Expressionsraten zeigten. Die erzielten Proteinmengen bei der transienten gTUB-Überexpression in N. benthamiana Blattgeweben, in Co-Expression mit dem Posttransriptional Gene Silencing-Suppressorprotein p19, waren für einen Pull-Down sowie eine massenspektroskopische Analyse der Interaktionspartner ausreichend und ergaben Befunde. Eine abschließende Auswertung des erarbeiteten massenspektroskopischen Datensatzes wird jedoch erst dann möglich sein, wenn das Tabak-Proteom vollständig sequenziert ist. Die Erweiterung der bestehenden pflanzlichen Vergleichsdatenbanken um das bisher bekannte Tabak-Proteom vervielfachte die Anzahl der in dieser Studie identifizierten gTUB-Interaktionspartner. Interaktionen mit dem TCP1-Chaperon untermauern die Hypothese der zur Faltung pflanzlichen gTUBs notwendigen Chaperone. Beobachtete gTUB-Degradationsmuster in Verbindung mit Interaktionen des 26S-Proteasoms deuten auf eine Gegenregulationen bei erhöhtem gTUB-Titer auf Proteinebene hin. Da Blattgewebe selbst nur noch über eine sehr geringe und inhomogene Teilungsaktivität verfügen ist diese Regulation hoch spannend. Auch konnte durch Co-Expression des PTGS-Suppressorproteins p19 gezeigt werden, dass bei der gTUB-Expression eine Regulation auf RNA-Ebene erfolgt.

RAB3GAP1 und RAB3GAP2 (RAB3 GTPase-activating Protein 1/2) beeinflussen die Autophagie in C. elegans und humanen Zellen

Die Proteinhomöostase wird in der Zelle von drei Stoffwechselwegen reguliert: den molekularen Chaperonen, dem Ubiquitin-Proteasom-System und dem autophagosomalen Abbauweg. Die (Makro)Autophagie verpackt und transportiert zytosolische Komponenten in Autophagosomen zu den Lysosomen, wo sie abgebaut werden. Eine Störung dieses Abbauwegs wirkt auf die Proteostase.rnIn dieser Dissertation wurde C. elegans als Modellorganismus zur Erforschung von Proteinstabilität genutzt. In einer RNAi-vermittelten Proteostase-Analyse von Chromosom I und ausgewählter zusätzlicher Gene wurde ein Wurmstamm, der ein Luc::GFP-Konstrukt im Muskel exprimiert, genutzt. Dieses Reporterprotein aggregiert unter Hitzestressbedingungen und diese Aggregation kann durch Modulatoren der Proteostase beeinflusst werden. Dabei wurden mögliche neue Faktoren der Proteinhomöostase entdeckt. Durch weitere Experimente bei denen die Aggregation von PolyQ35::YFP im AM140-System, der Paralyse-Phänotyp und die Akkumulation Thioflavin S-gefärbter Aggregate von Aβ42 im CL2006-Wurmstamm und die Effekte auf die Autophagie mittels eines GFP::LGG1-Konstrukt analysiert wurden, konnten rbg-1 und rbg-2 als neue Modulatoren der Proteinhomöostase, insbesondere der Autophagie, identifiziert werden.rnIm Säuger bilden beide Orthologe dieser Gene, RAB3GAP1 und RAB3GAP2 den heterodimeren RAB3GAP-Komplex, der bisher nur bekannt war für die Stimulation der Umwandlung der GTP-gebundenen aktiven Form zur GDP-gebundenen inaktiven Form der RAB GTPase RAB3. In Immunoblot-Analysen und mikroskopischen Darstellungen im Säugersystem konnte gezeigt werden, dass die Effekte auf die Proteostase über den autophagosomalen Abbauweg wirken. RAB3GAP1/2 wirken als positive Stimulatoren, wenn die Lipidierung von LC3-I und der autophagische Flux von LC3-II und p62/SQSTM1 betrachtet werden. Diese Effekte werden aber nicht über die RAB GTPase RAB3 vermittelt. Die Proteine FEZ1 und FEZ2 haben einen antagonistischen Effekt auf die Autophagie und wenn alle vier Komponenten RAB3GAP1, RAB3GAP2, FEZ1 und FEZ2 zusammen herunter- oder hochreguliert werden, heben sich diese Effekte auf. In Co-Immunopräzipitationen und proteomischen Analysen konnte keine direkte Interaktion zwischen dem RAB3GAP-Komplex und FEZ1/2 oder zu anderen Autophagie-Genen nachgewiesen werden.rnHier konnte der RAB3GAP-Komplex funktionell mit Proteostase und Autophagie in C. elegans und Säugerzellen assoziiert werden. Dieser Komplex zeigt Einflüsse auf die autophagosomale Biogenese indem sie die Proteostase und die Bildung von (prä)autophagosomalen Strukturen in C. elegans und die Lipidierung von LC3 und damit den autophagischen Flux der Autophagiesubstrate LC3-II und p62/SQSTM1 in Säugerzellen beeinflusst. Darüber hinaus wirkt RAB3GAP der komplexen Autophagie-Unterdrückung durch FEZ1 und FEZ2 entgegen. Somit konnte gezeigt werden, dass RAB3GAP als neuartiger Faktor auf die autophagosomale Biogenese und somit auf die Proteostase wirkt.rn