LRP1 modulates APP trafficking and APP metabolism within compartments of the secretory pathway. Increased AICD generation is ineffective in nuclear translocation and transcriptional activation

LRP1 modulates APP trafficking and metabolism within compartments of the secretory pathway The amyloid precursor protein (APP) is the parent protein to the amyloid beta peptide (Abeta) and is a central player in Alzheimer’s disease (AD) pathology. Abeta liberation depends on APP cleavage by beta- and gamma-secretases. To date, only a unilateral view of APP processing exists, excluding other proteins, which might be transported together and/or processed dependent on each other by the secretases described above. The low density lipoprotein receptor related protein 1 (LRP1) was shown to function as such a mediator of APP processing at multiple steps. Newly synthesized LRP1 can interact with APP, implying an interaction between these two proteins early in the secretory pathway. Therefore, we wanted to investigate whether LRP1 can mediate APP trafficking along the secretory pathway, and, if so, whether it affects APP processing. Indeed, we demonstrate that APP trafficking is strongly influenced by LRP1 transport through the endoplasmic reticulum (ER) and Golgi compartments. LRP1-constructs with ER- and Golgi-retention motifs (LRP-CT KKAA, LRP-CT KKFF) had the capacity to retard APP trafficking at the respective steps in the secretory pathway. Here, we provide evidence that APP metabolism occurs in close conjunction with LRP1 trafficking, highlighting a new role of lipoprotein receptors in neurodegenerative diseases. Increased AICD generation is ineffective in nuclear translocation and transcriptional activity A sequence of amyloid precursor protein (APP) cleavages gives rise to the APP intracellular domain (AICD) together with amyloid beta peptide (Abeta) and/or p3 fragment. One of the environmental factors identified favouring the accumulation of AICD appears to be a rise in intracellular pH. This accumulation is a result of an abrogated cleavage event and does not extend to other secretase substrates. AICD can activate the transcription of artificially expressed constructs and many downstream gene targets have been discussed. Here we further identified the metabolism and subcellular localization of the constructs used in this well documented gene reporter assay. We also co-examined the mechanistic lead up to the AICD accumulation and explored possible significances for its increased expression. We found that most of the AICD generated under pH neutralized conditions is likely that cleaved from C83. Furthermore, the AICD surplus is not transcriptionally active but rather remains membrane tethered and free in the cytosol where it interacts with Fe65. However, Fe65 is still essential in AICD mediated transcriptional transactivation although its exact role in this set of events is unclear.

Serumfreie Collagen-Monolayer- und Sandwich-Kulturen primärer Hepatozyten als ein wertvolles Modell zur Detektion von Toxizität und Arzneimittelwechselwirkungen in vitro

In dieser Arbeit wurden Zellkulturen primärer Hepatozyten von Ratte und Mensch hinsichtlich ihrer Eignung untersucht Speziesunterschiede der toxischen Wirkung und des Metabolismus von Substanzen darzustellen und inwieweit die in vitro-Ergebnisse in vivo vergleichbar bzw. übertragbar sind. Des Weiteren wurde ein Zellkulturmodell entwickelt, das eine Kultivierung von primären Hepatozyten aus Ratte, Mensch und Maus über einen Zeitraum von mindestens einer bis zwei Wochen erlaubt.rnrnDie Zellkulturen primärer Hepatozyten von Ratte und Mensch zeigten deutliche Unterschiede in der substanzinduzierten Veränderung der Genexpression nach Behandlung mit den, vor allem für den Menschen, lebertoxischen Substanzen Diclofenac und Troglitazon. Diese Unterschiede traten hauptsächlich in der Induktion fremdstoffmetabolisierender Enzyme sowie deren transkriptionsregulierenden Kernrezeptoren in den humanen Hepatozyten auf. Ebenso war eine verstärkte Stressantwort zu beobachten.rnDeutliche Speziesunterschiede konnten ebenso in der Wirkung der Arzneimittelentwicklungssubstanz EMD 392949 auf die Aktivität bzw. Genexpression von Cytochrom P450 Enzymen sowie deren Regulatoren nachgewiesen werden. Des Weiteren konnte hier eine sehr gute Übereinstimmung der Ergebnisse aus den Zellkulturen primärer Ratten- bzw. Humanhepatozyten mit jenen aus in vivo-Experimenten mit Ratten bzw. Affen (Macaca fascicularis) beobachtet werden, was die Aussagekraft der Primärkulturen verdeutlichte.rnDie große Übereinstimmung zwischen Enzymaktivität und Genexpression in der Induktion fremdstoffmetabolisierender Enzyme konnte durch die Behandlung mit einer Reihe speziesspezifischer Induktoren in Zellkulturen primärer Ratten- bzw. Humanhepatozyten bestätigt werden; vor allem nach dem von der amerikanischen Arzneimittelzulassungsbehörde (FDA, Food and Drug Administartion) vorgeschlagenen Bewertungsschema zur Untersuchung der CYP-Induktion.rnrnDie Lebensdauer sowie der Differenzierungsgrad von primären Hepatozyten in Kultur sind stark abhängig von den Zellkulturbedingungen. Durch diese Arbeit konnte gezeigt werden, dass spezifische Eigenschaften von Rattenleberzellen durch Kultivierung in einem Sandwich aus zwei hydratisierten Collagengelschichten und unter serumfreien Bedingungen für einen Zeitraum von mindestens zwei Wochen aufrechterhalten werden können. Dieses Kulturmodel konnte auf Primärhepatozyten von Mensch und Maus übertragen werden und erweitert die möglichen Anwendungen hin zu einer Behandlung über einen längeren Zeitraum und der Untersuchung von subchronischen Effekten.rn

Untersuchungen zum Einfluss des HMG-CoA-Reduktase-Inhibitors Lovastatin auf die Toxizität ionisierender Strahlung sowie des Anthrazyklinderivats Doxorubicin im Mausmodell

Hintergund: HMG-CoA-Reduktase-Inhibitoren (Statine) sind klinisch etablierte Cholesterinsenker. Über die Inhibition der intrinsischen Cholesterinbiosynthese hinaus zeigen sie sogenannte pleiotrope biologische Effekte. Ein Großteil dieser Wirkungen wird auf die Inhibition kleiner Ras homologer GTPasen (Rho GTPasen) zurückgeführt. In vitro schützt das Statinderivat Lovastatin (Lova) primäre humane Endothelzellen vor der Zytotoxizität von ionisierender Strahlung (IR) und dem Krebsmedikament Doxorubicin (Doxo). Zielsetzung: Die Relevanz dieser Befunde für ein in vivo Mausmodell sollte in der vorliegenden Arbeit überprüft werden. Dafür wurden BALB/c-Mäuse mit IR oder Doxo behandelt und der Einfluss einer Kobehandlung mit Lova auf verschiedene Toxizitätsendpunkte untersucht (24 h nach einer einzelnen hohen Dosis IR (i), 14 Tage nach zwei geringen Dosen IR (ii), 48 h nach einer einzelnen hohen Dosis Doxo (iii), sowie 8 Tage nach drei niedrigen Dosen Doxo (iv)). Eine mögliche gleichzeitige Protektion von Tumorzellen durch die Statingabe wurde in einem Xenotransplantationsexperiment überprüft (v), in dem das gleiche Behandlungsschema wie bei iv angewendet wurde. Ergebnisse: Es konnte gezeigt werden, dass eine Statinbehandlung Normalgewebe vor Doxo- und IR-induzierter Toxizität schützt, ohne gleichzeitig protektiv auf transformierte Zellen zu wirken. Dieser Effekt ist wahrscheinlich von einer Inhibition der kleinen GTPasen Rac1 und RhoA abhängig und einer daraus folgenden Modifizierung der DNA-Schadensantwort. i: Die Statinvorbehandlung der Mäuse hatte keinen Einfluss auf die Bildung von initialen IR-induzierten DNA-Doppelstrangbrüchen (DSB) in der Leber. Die Lova-Behandlung wirkte sich jedoch auf IR-induzierte Stressantworten aus, was sich in einer Minderung der Expression von Inflammations- und Fibrosesurrogatmarkern in Leber und Darm widerspiegelte. ii: In der Lunge der Tiere wurde ein Anstieg von molekularen Inflammations- und Fibrosesurrogatmarkern detektiert, der bei Statinkobehandlung ausblieb. Zudem verhinderte die Kobehandlung mit Lova eine IR-induzierte Abnahme der Thrombozytenzahl, ohne sich auf die durch IR verringerte Leukozytenzahl im Blut auszuwirken. iii: Die Verabreichung einer hohen Dosis Doxo induzierte DSB-Formation in der Leber. Die Statinvorbehandlung reduzierte deren Menge um ca. 50 %. Dieser genoprotektive Effekt war unabhängig von der Entstehung reaktiver Sauerstoffspezies sowie einer Änderung des Doxo-Imports oder Exports. Die Expression von proinflammatorischen und profibrotischen Genen fiel besonders in der Leber und im Herzen durch die Lova-Kobehandlung geringer aus, als in der nur mit Doxo behandelten Gruppe. Zudem verringerte Lova die durch Doxo induzierte Hochregulation von für den AP1-Komplex kodierenden Genen sowie von Zellzykluskontrollfaktoren. Die Lova-Vorbehandlung führte darüber hinaus im Herzen zu einem reduzierten mRNA-Spiegel der Topoisomerasen II α und β. iv: Es konnten schwere Herz- und Leberschäden detektiert werden (gemessen an Gldh-, Gpt- sowie cTn-I-Serumkonzentrationen), die bei einer Kobehandlung mit dem Statin nicht auftraten. Die Lova-Kobehandlung verhinderte außerdem eine durch die Doxo-Behandlung verringerte Leukozytenzahl. Molekulare Marker für frühe fibrotische Ereignisse, sowie für Inflammation und Hypertrophie waren in der Leber und im Herzen nach der Doxo-Behandlung erhöht. Das Statin war auch hier in der Lage, diese toxischen Wirkungen des Anthrazyklins zu mindern. Auch die Doxo-induzierte Expression von Surrogatmarkern für Zellantworten auf oxidativen Stress wurde in der Leber abgeschwächt. In der Leber und im Herzen wiesen die mit Doxo behandelten Tiere höhere mRNA Spiegel von an Zellzykluskontrolle beteiligten Faktoren sowie von DNA-Reparatur und Fremdstoffmetabolismus assoziierten Genen auf. Am stärksten wurde die Expression von Topoisomerase II alpha - ein molekularer Marker für Zellproliferation und bedeutsame Zielstruktur von Doxo - in der Leber hochreguliert. Die Statin-Kobehandlung verhinderte all diese Doxo-induzierten Expressionsänderungen. Im Gegensatz zur Leber wurde die Top2a-mRNA Menge im Herzen durch die Doxo-Applikation reduziert. Auch hier bewirkte die Kobehandlung mit dem Statin, dass die Expression nahe dem Kontrollniveau blieb. v: Die Kobehandlung mit Lova führte zu keinem Schutz der Tumorzellen vor Doxo, sondern erhöhte sogar dessen antineoplastisches Potential.rnFazit: Die Erkenntnisse aus vorhergegangenen in vitro Versuchen konnten zum großen Teil auf die in vivo Situation im Mausmodell übertragen werden. Sie stehen im Einklang mit Ergebnissen anderer Gruppen, welche die Inhibition kleiner GTPasen mit einer geringeren, durch zytotoxische Substanzen induzierten, Inflammation und Fibrose korrelieren konnten. Eine Kobehandlung mit Lova während einer Krebstherapie erscheint somit als vielversprechende Möglichkeit Doxo- oder IR-induzierte Nebenwirkungen auf Normalgewebe zu mildern.

Signalerkennung und Signaltransduktion im DctA,DcuS-Sensor-Regulatorkomplex von Escherichia coli.

E. coli ist in der Lage unter aeroben sowie anaeroben Bedingungen C4-Dicarbonsäuren zur Energiekonservierung zu nutzen. Das DcuS/DcuR-Zweikomponentensystem detektiert diese und reguliert die Gene für den C4-Dicarboxylat-Transport und Metabolismus. Dabei hängt die Sensitivität der Sensorkinase DcuS für C4-Dicarbonsäuren von der Anwesenheit des aeroben Symporters DctA oder des anaeroben Antiporters DcuB ab. Diese bifunktionalen Transporter bilden mit DcuS über direkte Protein-Protein-Wechselwirkungen Sensoreinheiten. In dieser Arbeit wurden die Funktionen von DctA und DcuS im DctA/DcuS-Sensorkomplex analysiert. Mit DctA(S380D) wurde eine Variante des Transporters identifiziert, in der die regulatorische Eigenschaft von der katalytischen Funktion entkoppelt ist. Stämme von E. coli, die den DctA(S380D)/DcuS-Sensorkomplex enthielten, waren in der Lage C4-Dicarbonsäuren wahrzunehmen, obwohl die Transportfunktion von DctA inaktiviert war. Zudem wurden Unterschiede in den Substratspektren von DctA und DcuS festgestellt. Citrat, ein guter Effektor des DctA/DcuS-Sensorkomplexes, wurde durch DctA nicht gebunden oder transportiert. Anhand von Titrationsexperimenten mit variierenden DctA-Mengen wurde außerdem nachgewiesen, dass die Sensitivität von DcuS für seine Effektoren von der DctA-Konzentration abhängig ist. Es konnte gezeigt werden, dass DctA im DctA/DcuS-Sensorkomplex nicht an der Erkennung von C4-Dicarbonsäuren beteiligt ist. DcuS stellt die Signaleingangsstelle des Komplexes dar, während DctA durch seine Anwesenheit die Sensorkinase in eine funktionsbereite oder sensitive Form überführt, die auf Effektoren reagieren kann. Darüber hinaus wurde die Rolle der Transmembranhelices TM1 und TM2 von DcuS für die Funktion und Dimerisierung der Sensorkinase untersucht. Durch Sequenzanalysen wurden „SmallxxxSmall“-Motive, deren Relevanz als Dimerisierungsschnittstellen bereits in Transmembranhelices anderer Proteine nachgewiesen wurde, in TM1 sowie TM2 identifiziert. Die Homodimerisierung beider Transmembrandomänen wurde im GALLEX Two-Hybrid System nachgewiesen, wobei die TM2-TM2-Interaktion stärker war. Die Substitution G190A/G194A im SxxxGxxxG-Tandemmotiv von TM2 rief zudem einen deutlichen Funktionsverlust der Sensorkinase hervor. Dieser Aktivitätsverlust korrelierte mit Störungen der Homodimerisierung von TM2(G190A/G194A) sowie DcuS(G190A/G194A) bei bakteriellen Two-Hybrid Messungen im GALLEX- bzw. BACTH-System. Demzufolge agiert Transmembranhelix 2 mit seinem SxxxGxxxG-Sequenzmotiv als wesentliche Homodimerisierungsstelle in DcuS. Die Dimerisierung von DcuS ist essentiell für die Funktion der Histidinkinase. Zusätzlich wurde bei fluoreszenzmikroskopischen Studien durch Koexpression von DcuS bzw. DctA die zelluläre Kolokalisierung von DctA und DcuR mit DcuS sowie DauA mit DctA nachgewiesen. Die DctA/DcuS-Sensoreinheit kann demnach zum DauA/DctA/DcuS/DcuR-Komplex erweitert werden.