Vorkommen und Charakterisierung von Ecdysiotropinen bei männlichen Imagines der Mittelmeerfeldgrille Gryllus bimaculatus de Geer

Das Vorkommen von Häutungshormonen in adulten Insekten, insbesondere solcher, die eine lange Imaginalphase durchlaufen, wirft die Frage nach der Regulation der Ecdysteroidsynthese außerhalb der Prothorakaldrüse auf. Unter diesem Gesichtspunkt kann Gryllus bimaculatus mit einem ausgesprochen langen Adultstadium und rapiden zeitlichen Veränderungen des Ecdysontiters als ein geeignetes Versuchsobjekt angesehen werden.Der vorliegenden Dissertation liegt die Arbeitshypothese zugrunde, daß die Ecdysteroid-Synthese bzw. Sekretion von Adultgeweben in männlichen Imagines der Mittelmeerfeldgrille durch Neuropeptide hormonell reguliert wird. Als Quelle für die Ecdysteroidsynthese wurde auf Grund immunohistochemischer Befunde sowie der Ergebnisse von Sekretionsprofil-Analysen unter anderem die Oenocyten in Betracht gezogen.Zur Überprüfung dieser Hypothese wurde ein in vitro Bioassay entwickelt, der es ermöglichte, die Wirkung von extrahierten Substanzen auf die Hormonsynthese mittels RIA/HPLC zu bestimmen. Aus Köpfen adulter G. bimaculatus ließen sich durch HP-SEC Faktoren isolieren, die die Ecdysteroidsekretion in Oenocyten und Tergiten stimulierten, die aber keinen Einfluß auf die Hormonsekretion von Fettgewebe sowie der Prothorakaldrüsen hatten. Die Wirkung des aufgereinigten Extraktes in Oenocyten war zeit- und dosis-abhängig. Die ecdysiotropen Faktoren besaßen ein Molekulargewicht zwischen 26,5 und 30 kDa. Die Größe der Molmasse der ecdysiotropen Faktoren entsprach somit bei adulten männlichen Grillen etwa dem des Neurohormons PTTH bei Lepidopteren. Dennoch zeigten Antikörper, die gegen PTTH von Bombyx mori gerichtet waren im Western-Blot keine Bindung an Gryllus bimaculatus Kopfextrakte. Die Sekretionsprodukte von Oenocyten, die mit Ecdysiotropinen behandelt waren, wurden durch RP- und NP-HPLC identifiziert. Es konnten zwei zusätzliche Peaks neben einem deutlichen Anstieg von 20-Hydroxyecdyson nachgewiesen werden. Auf Grund identischer Retentionszeiten mit Referenzsubstanzen handelt es sich bei einem Peak vermutlich um Makisteron A.Obwohl die Applikation von Azadirachtin in G. bimaculatus zu einer Senkung des Hämolymph-Ecdysteroidgehalts führte, konnte keine Anreicherung von Ecdysiotropinen erzielt werden.Die die Ecdysteroidsekretion-beeinflussenden Faktoren waren resistent gegen Kochen und Alkylierung aber nicht stabil gegen Reduzierung durch DTT und Behandlung mit Neuramidase. Damit konnte gezeigt werden, daß das Vorhandensein von Disulfidbrücken und Oligosaccharidketten für die biologische Aktivität notwendig ist.Die Aminosäuresequenz-Analyse und der enzymatische Verdau der stimulierenden Faktoren durch Exopeptidasen wiesen auf geschützte N- und C-Termini hin. Ferner wurden einige interne Peptidfragmente von fünf Proteinbanden sequenziert, die keine Homologie zu bereits bekannten regulatorischen Neuropeptiden zeigten. Als einziges bekanntes Protein aus diesem Bereich konnte das „14-3-3-like Protein“ mit Hilfe MALDI-MS identifiziert werden.Die Stimulierung der Ecdysteroidsekretion in Oenocyten von G. bimaculatus durch Oenocyten-stimulierende Faktoren (OSF) aus Kopfextrakten konnte mittels Signalstoff-Effektoren in vitro nachgeahmt werden. Außerdem wurde mit Hilfe eines RRA nachgewiesen, daß der intrazelluläre cAMP-Spiegel von Oenocyten durch OSF erhöht wird. Daraus kann geschlossen werden, daß cAMP als „Second Messenger“ an der Wirkung der OSF beteiligt ist. Calcium-Ionen schienen für die Ecdysteroidsekretion notwendig zu sein. Allerdings führte eine artifizielle Erhöhung der intrazellulären Calcium-Konzentration durch das Ionophor Ionomycin zu einer Hemmung der Sekretion. Schließlich wird ein Modell zur Erklärung des Wirkmechanismus von OSF in Gryllus bimaculatus postuliert und diskutiert.

Modulation of apoptosis by endogenously produced nitric oxide

Untersuchungen zur Expression der induzierbaren NO-Synthetase (NOS2) belegen eine häufige Expression dieses Enzyms in Tumoren unterschiedlicher Gewebe. Bislang ist jedoch ungeklärt, ob die Expression der NOS2 in Tumorzellen die apoptotische Eliminierung durch zytotoxische T-Zellen beeinflussen kann. In der vorliegenden Arbeit wurden die Folgen einer endogenen NO-Synthese auf die Apoptosesensitivität von HEK293-Zellen untersucht. Um primäre NO-Wirkungen von NO-induzierten, sekundären (kompensatorischen) Veränderungen zu trennen, wurde mit einem induzierbaren Vektorsystem gearbeitet. Die NOS2 wurde zunächst unter der Kontrolle eines Ecdyson-sensitiven Promoters in HEK293-Zellen kloniert. Es konnten regulierbare NOS2-Klone selektiert werden, die nach Ponasteronbehandlung dosisabhängig die NOS2 exprimieren und NO synthetisieren. Die NOS2-Expression wurde durch Western Blot Analyse und Immunfluoreszenzfärbung dargestellt und die NO-Produktion mit Hilfe der Griess-Reaktion gemessen. An den NOS2-induzierten Zellen wurde dann der Einfluss von NO auf die CD95-vermittelte Apoptose analysiert. Es zeigte sich nach Stimulation des CD95-Rezeptors eine deutliche Korrelation der Apoptoserate mit der NOS2-Expression. In Kokulturexperimenten mit Peptid-spezifischen zytotoxischen T-Zellen zeigte sich, dass NO-produzierende Zielzellen effektiver eliminiert werden konnten. Auch nach Behandlung der Zellen mit TRAIL ergab sich eine höhere Apoptoserate in NO-produzierenden Zellen. Die weitere Analyse der durch NO beeinflussten Signalwege ergab eine Beteiligung von ER-Stress-vermittelten Apoptosewegen. Dies zeigte sich an der Hochregulation des ER-Stress-Proteins Grp78 (BiP) nach NOS2-Expression und der Spaltung der am ER-lokalisierten Caspase-4. Darüber hinaus konnte der schnellere Verlust des mitochondrialen Membranpotentials in Abhängigkeit von der NOS2-Expression nachgewiesen werden. Weiterhin wurde die Wirkung einer dauerhaften NO-Exposition auf die Apoptosesensitivität der Zellen untersucht. Auch ohne zusätzliche CD95-Stimulation induzierte eine kontinuierliche NOS2-Expression nach wenigen Tagen in den EcR293-NOS2-Zellen Apoptose. Diese Dauerbehandlung führte zum nahezu vollständigen Absterben der Kulturen. Einige Zellen überlebten jedoch diese Behandlung und wuchsen zu Zellklonen. Diese NO-resistenten Klone konnten isoliert werden. Sie zeigten eine zusätzliche Resistenz für CD95-vermittelte Apoptosesignale und waren besser vor dem Angriff Peptid-spezifischer CTLs geschützt. Die Apoptoseresistenz blieb auch nach längerer Kultur erhalten und scheint auf NO-induzierter Genotoxizität zu beruhen. Anhand dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass allein durch chronische NO-Behandlung eine Selektion apoptoseresistenter Zellen stattfinden kann.