In vitro modulation of epileptiform activity in the hippocampal formation of immature rodents by GABAergic antagonists, dopamine and methylxanthines

Während des frühen Lebens stellen epileptische Anfälle schwere neurologische Zustände dar, weil sie ein großer Risikofaktor für die Manifestation der Epilepsie sind und eine hohe pharmakologische Resistenz zeigen. In meiner Doktorarbeit konzentrierte ich mich auf die Frage, wie verschiedene Neurotransmitter-Systeme und klinisch verwendete Medikamente epileptiforme Entladungen im perinatalen Hippocampus beeinflussen. rnIm ersten Teil meines Projektes untersuchte ich die Wirkung von GABA-Antagonisten und Modulatoren, die zwischen phasischen und tonischen GABAergen Strömen differenzieren, auf Feldpotentialaktivität in Hippocampusschnitten. Diese Experimente zeigten, dass im unreifen Hippocampus synaptische GABAerge Aktivität benötigt wird, um die Erregbarkeit zu begrenzen, während tonische GABAerge Ströme die Erregbarkeit verstärken können. Dies könnte darauf hinweisen, dass Antiepileptika mit einer höheren Spezifität für synaptische GABAA-Rezeptoren wirksamer zur Behandlung von epileptischen Anfällen bei Neugeborenen sein können. rnUm den Einfluss von Dopamin auf die Erregbarkeit des unreifen Hippocampus herauszufinden, untersuchte ich im zweiten Teil meiner Arbeit die Wirkung von verschiedenen Dopaminkonzentrationen und spezifische Agonisten und Antagonisten der Dopamin-Rezeptor-Subtypen auf epileptiforme Entladungen. Diese Experimente zeigten, dass niedrige Dopamin Konzentrationen eine antikonvulsive Wirkung haben, welche vom D2-ähnliche-Rezeptor-Agonisten Quinpirol nachgeahmt werden kann, während höhere Dopamin-Konzentrationen eine prokonvulsive Wirkung über Aktivierung von D1-ähnlichen Rezeptoren hervorrufen. Obwohl unsere Untersuchungen eine mögliche Verwendung von D2-ähnlichen Rezeptor-Agonisten zur Kontrolle epileptischer Anfälle in Neugeborenen nahelegen, müssen mögliche negative Auswirkungen von DAergen Agonisten und Antagonisten auf die neuronale Entwicklung berücksichtigt werden.rnIm dritten Teil meiner Arbeit untersuchte ich welche Konzentrationen von Methylxanthinen epileptische Anfälle in Hippocampuspreparationen auslösen die synaptische Übertragungen verändern können. Diese Experimente zeigten, dass sowohl Theophyllin als auch Koffein in höheren Konzentrationen die basale synaptische Übertragungen in der CA1-Region des Hippocampus modifizieren und epileptiforme Entladungen provozieren. Die Auswirkungen auf die postsynaptischen Antworten und spontanen epileptiformen Entladungen durch Koffein waren weniger ausgeprägt, was darauf hindeutet, dass diese Substanz potentiell vorteilhafter für therapeutische Anwendungen bei Frühgeborenen sein kann. rnZusammenfassend bereichern die Ergebnisse meiner Studie erheblich unser Wissen über die zugrunde liegenden Mechanismen epileptiformer Aktivität im unreifen Hippocampus und den therapeutischen Einsatz von Methylxanthinen und Pharmaka, die auf das GABAerge und DArge System einwirken.rnrn

Modulation of network excitability and epileptiform activity in the hippocampus of immature rats by the activation of GlyRs

Epileptic seizures are the manifestations of epilepsy, which is a major neurological disorder and occurs with a high incidence during early childhood. A fundamental mechanism underlying epileptic seizures is loss of balance between neural excitation and inhibition toward overexcitation. Glycine receptor (GlyR) is ionotropic neurotransmitter receptor that upon binding of glycine opens an anion pore and mediates in the adult nervous system a consistent inhibitory action. While previously it was assumed that GlyRs mediate inhibition mainly in the brain stem and spinal cord, recent studies reported the abundant expression of GlyRs throughout the brain, in particular during neuronal development. But no information is available regarding whether activation of GlyRs modulates neural network excitability and epileptiform activities in the immature central nervous system (CNS). Therefore the study in this thesis addresses the role of GlyRs in the modulation of neuronal excitability and epileptiform activity in the immature rat brain. By using in vitro intact corticohippocampal formation (CHF) of rats at postnatal days 4-7 and electrophysiological methods, a series of pharmacological examinations reveal that GlyRs are directly implicated in the control of hippocampal excitation levels at this age. In this thesis I am able to show that GlyRs are functionally expressed in the immature hippocampus and exhibit the classical pharmacology of GlyR, which can be activated by both glycine and the presumed endogenous agonist taurine. This study also reveals that high concentration of taurine is anticonvulsive, but lower concentration of taurine is proconvulsive. A substantial fraction of both the pro- and anticonvulsive effects of taurine is mediated via GlyRs, although activation of GABAA receptors also considerably contributes to the taurine effects. Similarly, glycine exerts both pro- and anticonvulsive effects at low and high concentrations, respectively. The proconvulsive effects of taurine and glycine depend on NKCC1-mediated Cl- accumulation, as bath application of NKCC1 inhibitor bumetanide completely abolishes proconvulsive effects of low taurine and glycine concentrations. Inhibition of GlyRs with low concentration of strychnine triggers epileptiform activity in the CA3 region of immature CHF, indicating that intrinsically an inhibitory action of GlyRs overwhelms its depolarizing action in the immature hippocampus. Additionally, my study indicates that blocking taurine transporters to accumulate endogenous taurine reduces epileptiform activity via activation of GABAA receptors, but not GlyRs, while blocking glycine transporters has no observable effect on epileptiform activity. From the main results of this study it can be concluded that in the immature rat hippocampus, activation of GlyRs mediates both pro- and anticonvulsive effects, but that a persistent activation of GlyRs is required to prevent intrinic neuronal overexcitability. In summary, this study uncovers an important role of GlyRs in the modulation of neuronal excitability and epileptiform activity in the immature rat hippocampus, and indicates that glycinergic system can potentially be a new therapeutic target against epileptic seizures of children.

Surfactants and their aerobic degradation products

Die Ziele der vorliegenden Arbeit waren 1) die Entwicklung und Validierung von sensitiven und substanz-spezifischen Methoden für die quantitative Bestimmung von anionischen, nichtionischen und amphoteren Tensiden und deren Metaboliten in wässrigen Umweltproben unter Einsatz leistungsfähiger, massenspektrometrischer Analysengeräte,2) die Gewinnung von aeroben, polaren Abbauprodukten aus Tensiden in einem die realen Umweltbedingungen simulierenden Labor-Festbettbioreaktor (FBBR), dessen Biozönose oberflächenwasserbürtig war,3) zur Aufklärung des Abbaumechanismus von Tensiden neue, in 2) gewonnene Metabolite zu identifizieren und massenspektrometrisch zu charakterisieren ebenso wie den Primärabbau und den weiteren Abbau zu verfolgen,4) durch quantitative Untersuchungen von Tensiden und deren Abbauprodukten in Abwasser und Oberflächenwasser Informationen zu ihrem Eintrag und Verhalten bei unterschiedlichen hydrologischen und klimatischen Bedingungen zu erhalten,5) das Verhalten von persistenten Tensidmetaboliten in Wasserwerken, die belastetes Oberflächenwasser aufbereiten, zu untersuchen und deren Vorkommen im Trinkwasser zu bestimmen,6) mögliche Schadwirkungen von neu entdeckten Metabolite mittels ökotoxikologischer Biotests abzuschätzen,7) durch Vergleich der Felddaten mit den Ergebnissen der Laborversuche die Umweltrelevanz der Abbaustudien zu belegen. Die Auswahl der untersuchten Verbindungen erfolgte unter Berücksichtigung ihres Produktionsvolumens und der Neuheit auf dem Tensidmarkt. Sie umfasste die Waschmittelinhaltsstoffe lineare Alkylbenzol-sulfonate (LAS), welches das Tensid mit der höchsten Produktionsmenge darstellte, die beiden nichtionischen Tenside Alkylglucamide (AG) und Alkylpolyglucoside (APG), ebenso wie das amphotere Tensid Cocamidopropylbetain (CAPB). Außerdem wurde der polymere Farbübertragungsinhibitor Polyvinylpyrrolidon (PVP) untersucht.

Expression der pronozizeptiven Vanilloidrezeptoren TRPV1 und TRPV2 und des antinozizeptiven Cannabinoidrezeptors CB1 in Spinalganglienneuronen der Ratte

Nozizeptive Spinalganglienneurone detektieren mit einer Vielzahl liganden- und spannungsgesteuerter Ionenkanäle noxische Reize, d.h. Reize, die eine Gewebeschädigung bewirken können, wandeln sie in Aktionspotenzialentladungen um und leiten sie über das Rückenmark zum Gehirn weiter, wo eine Schmerzempfindung ausgelöst wird. Die pronozizeptiven transienten Rezeptor-Potenzial-Kanäle der Vanilloidrezeptorfamilie, TRPV1 und TRPV2, sind die klassischen Transduktionsmoleküle für noxische Hitzereize in den Spinalganglien und werden von Reiztemperaturen über 43°C bzw. 52°C aktiviert. Daneben finden sich auch antinozizeptive Membranproteine, wie z.B. der metabotrope Cannabinoidrezeptor CB1. Er koppelt an spannungsgesteuerte Kaliumkanäle, die neben Natrium- und Kalziumkanälen ebenfalls an der neuronalen Erregbarkeit beteiligt sind. Von den spannungsgesteuerten Kaliumkanälen könnte der Kv1.4, der einen schnell inaktivierenden A-Strom vermittelt, an antinozizeptiven Signalwegen beteiligt sein. Um die molekulare Physiologie der Regulation von Nozizeption und Antinozizeption zu charakterisieren, wurde die Expression bzw. Ko-Expression dieser Membranproteine auf der einen als auch die funktionelle Charakterisierung von TRPV1 auf der anderen Seite im Soma der Spinalganglienneurone und im heterologen Expressionssystem untersucht. TRPV1 wurde in je einem Drittel und TRPV2 in je einem Zehntel aller Spinalganglienneurone nachgewiesen. Das Expressionsmuster veränderte sich nicht zwischen verschiedenen Präparationsmethoden, die zur Aufarbeitung der Zellen für unterschiedliche experimentelle Ansätze notwendig sind. Somit können die aus Expressionsanalysen und funktionellen Untersuchungen gewonnenen Ergebnisse miteinander verglichen werden. Obwohl TRPV1 und TRPV2 in unterschiedlich großen Zellen exprimiert werden, überlappen dennoch ihre Größenverteilungen. Durch Ko-Expressionsanalysen konnten hier erstmalig TRPV1-TRPV2-ko-exprimierende Neurone detektiert werden. Mit dem neu entwickelten N-terminalen Antikörper gegen TRPV1 (3C11) konnte gezeigt werden, dass für TRPV1 verschiedene Splice-Varianten existieren. Neben den bereits bekannten Splice-Varianten wurde hier die neue Variante Vr.3’sv isoliert. Diese besitzt zwischen Exon 15 und 16 eine Insertion aus 104 Basen und exprimiert daher einen veränderten C-Terminus. Trotz dieser Veränderung bildeten sich im heterologen Expressionssystem funktionelle Kanäle aus, die im Gegensatz zu den anderen Varianten immer noch durch Capsaicin aktivierbar waren. Vr.3’sv könnte als Homo- oder Heterotetramer die Eigenschaften TRPV1-positiver Neurone beeinflussen. Bei der Bestimmung der Häufigkeit von TRPV1 in einem Gewebe ist somit die Wahl des Antikörpers von entscheidender Bedeutung. Für TRPV2 dagegen gibt es hier keine Hinweise auf Splice-Varianten. TRPV1 wird durch das Vanilloid Capsaicin aktiviert, wobei diese Substanz neurotoxisch ist und eine Degeneration von Neuronen und epidermalen Nervenfasern bewirkt. Hier wurde nun gezeigt, dass unabhängig von den Splice-Varianten nicht alle TRPV1-positiven Neurone bei langer Inkubationszeit absterben. Funktionelle Untersuchungen belegten, dass auch Capsaicin-sensitive Zellen unter dem Einfluss des Agonisten überleben können. Dieser Schutzmechanismus wird möglicherweise von den verschiedenen Splice-Varianten vermittelt. Ko-Expressionsanalysen zeigten, dass der spannungsgesteuerte Kaliumkanal Kv1.4 in nahezu allen TRPV1- aber nicht TRPV2-positiven Neuronen exprimiert wird. Desweiteren ko-exprimierten nahezu alle TRPV1-positiven Neurone auch den Cannabinoidrezeptor CB1. Diese fast vollständige Ko-Lokalisation von CB1 und Kv1.4 in nozizeptiven Spinalganglienneuronen spricht für eine funktionell synergistische Aktivität. Der Kaliumkanal kann unter der regulativen Kontrolle von CB1 als Vermittler von A-Typ-Kaliumströmen an der Kontrolle der repetitiven Entladungen in der Peripherie und der Transmitterausschüttung zentral beteiligt sein. Es ergeben sich daraus Ansatzpunkte für die Entwicklung neuer Medikamente. Mit Kv1.4-Aktivatoren und/oder peripher wirkenden Cannabinoiden könnten die Nebenwirkungen der Cannabinoide im zentralen Nervensystem umgangen werden.

Neural network activity in the neonatal acute slice, slice culture and cell culture

Information processing and storage in the brain may be presented by the oscillations and cell assemblies. Here we address the question of how individual neurons associate together to assemble neural networks and present spontaneous electrical activity. Therefore, we dissected the neonatal brain at three different levels: acute 1-mm thick brain slice, cultured organotypic 350-µm thick brain slice and dissociated neuronal cultures. The spatio-temporal properties of neural activity were investigated by using a 60-channel Micro-electrode arrays (MEA), and the cell assemblies were studied by using a template-matching method. We find local on-propagating as well as large- scale propagating spontaneous oscillatory activity in acute slices, spontaneous network activity characterized by synchronized burst discharges in organotypic cultured slices, and autonomous bursting behaviour in dissociated neuronal cultures. Furthermore, repetitive spike patterns emerge after one week of dissociated neuronal culture and dramatically increase their numbers as well as their complexity and occurrence in the second week. Our data indicate that neurons can self-organize themselves, assembly to a neural network, present spontaneous oscillations, and emerge spatio-temporal activation patterns. The spontaneous oscillations and repetitive spike patterns may serve fundamental functions for information processing and storage in the brain.