Re-Entrance-Phasenbildung und elektronische Eigenschaften epitaxialer Schichten des Kondo-Halbmetalls CeSb

Durch das Anlegen eines elektrischen Feldes an eine Feldeffektanordung kann die Anzahl der freien Ladungstraeger im Kanalmaterial direkt moduliert und der Einfluá auf die Transporteigenschaften und den damit zusammenhaengenden typischen Energieskalen untersucht werden. Mit der Konzeption und dem Aufbau einer Praeparationsapparatur, sowie der Etablierung eines Praeparationsprozesses zur Herstellung duenner epitaktischer Schichten des Kondo-Halbmetalls CeSb sollte im Rahmen dieser Arbeit der Grundstein fuer die Realisierung einer dazu notwendigen Feldeffektanordnung gelegt werden. Mit dem Verfahren der Molekularstrahlepitaxie konnten sowohl (100)- als auch (111)-orientierte phasenreine CeSb-Schichten hergestellt werden. In Abhaengigkeit der Sb-Verdampfertemperatur wurden fuer das Schichtwachstum auf Saphir (1120) zwei voneinander getrennte Bereiche der Phasenbildung gefunden, in denen jeweils die (111)- respektive die (100)-Wachstumsrichtung dominiert. Das beobachtete Re-Entrance-Verhalten beruht auf dem Einfluss der Sb-Tiegeltemperatur auf Verdampfungsrate und Strahlzusammensetzung. Durch die Verwendung von Saphir (0001)-Substraten konnte das Wachstum (111)-orientierter Schichten massgeblich verbessert werden. Die Untersuchung der elektronischen Eigenschaften mittels Magnetotransportmessungen ergab eine weitreichende šbereinstimmung mit den bekannten Einkristallergebnissen. In Uebereinstimmung mit den Ergebnissen der an der ETH Zuerich durchgefuehrten MOKE-Untersuchungen laesst sich aus den Hallmessungen auf eine Reduktion der freien Ladungstraeger in den duennen Schichten schliessen.

Plasmons as sensors

“Plasmon” is a synonym for collective oscillations of the conduction electrons in a metal nanoparticle (excited by an incoming light wave), which cause strong optical responses like efficient light scattering. The scattering cross-section with respect to the light wavelength depends not only on material, size and shape of the nanoparticle, but also on the refractive index of the embedding medium. For this reason, plasmonic nanoparticles are interesting candidates for sensing applications. Here, two novel setups for rapid spectral investigations of single nanoparticles and different sensing experiments are presented.rnrnPrecisely, the novel setups are based on an optical microscope operated in darkfield modus. For the fast single particle spectroscopy (fastSPS) setup, the entrance pinhole of a coupled spectrometer is replaced by a liquid crystal device (LCD) acting as spatially addressable electronic shutter. This improvement allows the automatic and continuous investigation of several particles in parallel for the first time. The second novel setup (RotPOL) usesrna rotating wedge-shaped polarizer and encodes the full polarization information of each particle within one image, which reveals the symmetry of the particles and their plasmon modes. Both setups are used to observe nanoparticle growth in situ on a single-particle level to extract quantitative data on nanoparticle growth.rnrnUsing the fastSPS setup, I investigate the membrane coating of gold nanorods in aqueous solution and show unequivocally the subsequent detection of protein binding to the membrane. This binding process leads to a spectral shift of the particles resonance due to the higher refractive index of the protein compared to water. Hence, the nanosized addressable sensor platform allows for local analysis of protein interactions with biological membranes as a function of the lateral composition of phase separated membranes.rnrnThe sensitivity on changes in the environmental refractive index depends on the particles’ aspect ratio. On the basis of simulations and experiments, I could present the existence of an optimal aspect ratio range between 3 and 4 for gold nanorods for sensing applications. A further sensitivity increase can only be reached by chemical modifications of the gold nanorods. This can be achieved by synthesizing an additional porous gold cage around the nanorods, resulting in a plasmon sensitivity raise of up to 50 % for those “nanorattles” compared to gold nanorods with the same resonance wavelength. Another possibility isrnto coat the gold nanorods with a thin silver shell. This reduces the single particle’s resonance spectral linewidth about 30 %, which enlarges the resolution of the observable shift. rnrnThis silver coating evokes the interesting effect of reducing the ensemble plasmon linewidth by changing the relation connecting particle shape and plasmon resonance wavelength. This change, I term plasmonic focusing, leads to less variation of resonance wavelengths for the same particle size distribution, which I show experimentally and theoretically.rnrnIn a system of two coupled nanoparticles, the plasmon modes of the transversal and longitudinal axis depend on the refractive index of the environmental solution, but only the latter one is influenced by the interparticle distance. I show that monitoring both modes provides a self-calibrating system, where interparticle distance variations and changes of the environmental refractive index can be determined with high precision.

Biochemische, strukturelle und funktionelle Untersuchungen der Tyrosinase aus Streptomyces castaneoglobisporus HUT6202

Die Tyrosinase aus Streptomyces castaneoglobisporus HUT6202 ist für biochemische und strukturelle Untersuchungen besonders gut geeignet, da sie als globuläres binäres Protein vorliegt. Als bakterielles Protein lässt sich die Tyrosinase aus Streptomyces in einen E.coli Expressionsstamm klonieren und exprimieren.rnIn dieser Arbeit wurde die Tyrosinase zusammen mit seinem Hilfsprotein (ORF378) polycistronisch in Escherichia coli BL21 (DE3)-Zellen heterolog exprimiert. Das Produkt der Expression ergab einen funktionellen binären Proteinkomplex, welcher mit einer Ausbeute von bis zu 0,8 mg/L über einen C-terminalen His-Tag sowie eine anschließende Größenausschlusschromatographie auf bis 95 % gereinigt werden konnte.rnDer gereinigte binäre Komplex aus Tyrosinase und Hilfsprotein wurde mit Hilfe isoelektrischer Fokussierung untersucht um die jeweiligen isoelektrischen Punkte der beiden Proteine zu bestimmen (pI 4,8 für die Tyrosinase sowie 4,9 für das Hilfsprotein), welche stark von den anhand der Aminosäuresequenz errechneten pIs abweichen (6,2 und 6,4). Des Weiteren wurde die Tyrosinase auf ihre Substratspezifität getestet, wobei sich ein bevorzugter Umsatz von Kaffeesäure (Km 1,4 mM; Vmax 21.5 µM min-1) und p-Cumarsäure zeigte. Es erfolgte keine Katalyse von Tyrosin und Tyramin sowie nur in geringem Maß von L-Dopa. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass ein enzymatischer Umsatz nur stattfindet, nachdem die Tyrosinase mit CuSO4 aktiviert wurde. Eine Aktivierung mit SDS konnte nicht beobachtet werden.rnZur Untersuchung der Aktivierung des binären Komplexes lässt sich mit Hilfe dynamischer Lichtstreuung und analytischer Ultrazentrifugation eine Dissoziation des Komplexes in seine monomeren Komponenten nach Aktivierung mit CuSO4 vermuten. Dies würde den bislang hypothetisch angenommenen Mechanismus der Aktivierung der Tyrosinase aus S.castaneoglobisporus bestätigen.rnIn silico-Arbeiten wurden durchgeführt um ein tieferes Verständnis der Substratspezifität zu bekommen. Substrat-Docking-Experimente bestätigten die im Labor erhaltenen Ergebnisse. Eine Strukturanalyse deutet auf eine sterische Hinderung der Substrataufnahme für Substrate mit sekundären Aminogruppen hin. rnAnalysen des Protein-Interface von Tyrosinase und Hilfsprotein konnten kupferfixierende Faltungsmotive an der Oberfläche des Hilfsproteins aufzeigen. Bei diesen handelt es meist um 3-4 polare Aminosäuren, welche in der Lage sind, ein Kupferatom zu fixieren. Durch die Bindung der Kupferatome an die fixierenden Motive werden wahrscheinlich zahlreiche Wasserstoff-brückenbindungen getrennt, welche den Komplex in seiner inaktiven Form stabilisieren.rn

Plasmoscope: Automated spectroscopy of single nanoparticles

Plasmonen sind die kollektive resonante Anregung von Leitungselektronen. Vom Licht angeregternPlasmonen in subwellenlängen-grossen Nanopartikeln heissen Partikelplasmonen und sind vielversprechende Kandidaten für zukünftige Mikrosensoren wegen der starken Abhängigkeit der Resonanz an extern steuerbaren Parametern, wie die optischen Eigenschaften des umgebenden Mediums und die elektrische Ladung der Nanopartikel. Die extrem hohe Streue_zienz von Partikelplasmonen erlaubt eine einfache Beobachtung einzelner Nanopartikel in einem Mikroskop.rnDie Anforderung, schnell eine statistisch relevante Anzahl von Datenpunkten sammeln zu können,rnund die wachsende Bedeutung von plasmonischen (vor allem Gold-) Nanopartikeln für Anwendungenrnin der Medizin, hat nach der Entwicklung von automatisierten Mikroskopen gedrängt, die im bis dahin nur teilweise abgedeckten spektralen Fenster der biologischen Gewebe (biologisches Fenster) von 650 bis 900nm messen können. Ich stelle in dieser Arbeit das Plasmoscope vor, das genau unter Beobachtung der genannten Anforderungen entworfen wurde, in dem (1) ein einstellbarer Spalt in die Eingangsö_nung des Spektrometers, die mit der Bildebene des Mikroskops zusammenfällt, gesetzt wurde, und (2) einem Piezo Scantisch, der es ermöglicht, die Probe durch diesen schmalen Spalt abzurastern. Diese Verwirklichung vermeidet optische Elemente, die im nahen Infra-Rot absorbieren.rnMit dem Plasmoscope untersuche ich die plasmonische Sensitivität von Gold- und Silbernanostrnäbchen, d.h. die Plasmon-Resonanzverschiebung in Abhängigkeit mit der Änderung des umgebendenrnMediums. Die Sensitivität ist das Mass dafür, wie gut die Nanopartikeln Materialänderungenrnin ihrer Umgebung detektieren können, und damit ist es immens wichtig zu wissen, welche Parameterrndie Sensitivität beein_ussen. Ich zeige hier, dass Silbernanostäbchen eine höhere Sensitivität alsrnGoldnanostäbchen innerhalb des biologischen Fensters besitzen, und darüberhinaus, dass die Sensitivität mit der Dicke der Stäbchen wächst. Ich stelle eine theoretische Diskussion der Sensitivitätrnvor, indenti_ziere die Materialparameter, die die Sensitivität bein_ussen und leite die entsprechendenrnFormeln her. In einer weiteren Annäherung präsentiere ich experimentelle Daten, die die theoretische Erkenntnis unterstützen, dass für Sensitivitätsmessschemata, die auch die Linienbreite mitberücksichtigen, Goldnanostäbchen mit einem Aspektverhältnis von 3 bis 4 das optimalste Ergebnis liefern. Verlässliche Sensoren müssen eine robuste Wiederholbarkeit aufweisen, die ich mit Gold- und Silbernanostäbchen untersuche.rnDie Plasmonen-resonanzwellenlänge hängt von folgenden intrinsischen Materialparametern ab:rnElektrondichte, Hintergrundpolarisierbarkeit und Relaxationszeit. Basierend auf meinen experimentellen Ergebnissen zeige ich, dass Nanostäbchen aus Kupfer-Gold-Legierung im Vergleich zu ähnlich geformten Goldnanostäbchen eine rotverschobene Resonanz haben, und in welcher Weiserndie Linienbreite mit der stochimetrischen Zusammensetzung der legierten Nanopartikeln variiert.rnDie Abhängigkeit der Linienbreite von der Materialzusammensetzung wird auch anhand von silberbeschichteten und unbeschichteten Goldnanostäbchen untersucht.rnHalbleiternanopartikeln sind Kandidaten für e_ziente photovoltaische Einrichtungen. Die Energieumwandlung erfordert eine Ladungstrennung, die mit dem Plasmoscope experimentell vermessen wird, in dem ich die lichtinduzierte Wachstumsdynamik von Goldsphären auf Halbleiternanost äbchen in einer Goldionenlösung durch die Messung der gestreuten Intensität verfolge.rn

Dynamics of small interfering RNA - FRET based integrity measurements of siRNA in the cuvette & inside cells

RNAi ist ein bedeutendes Werkzeug zur Funktionsanalyse von Genen und hat großes Potential für den Einsatz in der Therapie. Obwohl effiziente Knockdowns in der Zellkultur erzielt werden, erweist sich eine in vivo Anwendung als schwierig. Die großen Hürden sind dabei der Transport der siRNA ins Zielgewebe und deren voranschreitende Degradierung.rnMarkierte siRNA kann sowohl zur eigenen Integritätsmessung als auch zur Lokalisierung verwendet werden. Zwei Farbstoffe an den jeweiligen 3’- bzw. -5’-Enden des Sense- bzw. Antisense-Stranges erzeugen ein robustes FRET-System (Hirsch et al. 2012). Das Verhältnis von FRET- zu Donor-Signal, das R/G-Ratio, dient zur sensitiven Klassifizierung des Integritätslevels einer siRNA Probe (Järve et al. 2007; Hirsch et al. 2011; Kim et al. 2010). Mit diesem System kann eine Degradierung von weniger als 5 % in der Küvette und in Zellen nachgewiesen werden.rnDie vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Evaluierung von potentiellen FRET Farbstoffpaaren hinsichtlich deren Eignung für in vitro und in vivo Anwendung. Verschiedenste FRET-Paare, die das gesamte sichtbare Spektrum abdecken, wurden evaluiert und ermöglichen nun die Auswahl eines geeigneten Paares für die jeweilige Anwendung oder Kombination mit anderen Farbstoffen.rnMit Hilfe von Alexa555/Atto647N siRNA wurde ein erfolgreicher Einschluss von siRNA in Liposomen beobachtet. Eine anschließende Evaluierung der RNase-Protektion ergab für Liposomen, Nanohydrogele und kationische Peptide hervorragende protektive Eigenschaften. Basierend auf den Ergebnisse können diese und andere Transportsysteme nun für eine zelluläre Aufnahme optimiert werden.rnAtto488/Atto590 zeigte die besten Eigenschaften für Echtzeit-Integritätsmessungen in der Lebendzellmikroskopie. Verringerte Bleicheigenschaften und minimaler spektraler “Cross-Talk” ermöglichten es, transfizierte Zellen über einen Zeitraum von bis zu 8 Stunden zu beobachten. Mittels Atto488/Atto590 siRNA wurde die Einschleusung und Freisetzung in Zellen in Echtzeit untersucht. Dabei konnten Freisetzung und Verteilung in einzelnen Zellen beobachtet und analysiert werden. rnAuf eine anfängliche Phase mit hoher Freisetzungsrate folgte eine Phase mit geringerer Rate für den restlichen Beobachtungszeitraum. Die durchschnittliche Verweildauer im Zytosol betrug 24 und 58 Minuten, wobei zwischen lang- und kurzanhaltenden Ereignissen unterschieden werden konnte. Obwohl ein Import von siRNA in den Zellkern beobachtet wurde, konnte kein Schema bzw. genauer Zeitpunkt, in Bezug auf den Transfektionszeitraum für diese Ereignisse bestimmt werden. Die beobachteten Freisetzungsprozesse fanden sporadisch statt und Änderungen in der zellulären Verteilung geschahen innerhalb von wenigen Minuten. Einmal freigesetzte siRNA verschwand mit der Zeit wieder aus dem Zytosol und es blieben nur kleine Aggregate von siRNA mit immer noch geringer Integrität zurück.rn

Controlled wetting on silica-based nano- and microstructured surfaces

Der Fokus dieser Doktorarbeit liegt auf der kontrollierten Benetzung von festen Oberflächen, die in vielen Bereichen, wie zum Beispiel in der Mikrofluidik, für Beschichtungen und in biologischen Studien von Zellen oder Bakterien, von großer Bedeutung ist.rnDer erste Teil dieser Arbeit widmet sich der Frage, wie Nanorauigkeit das Benetzungsverhalten, d.h. die Kontaktwinkel und die Pinningstärke, von hydrophoben und superhydrophoben Beschichtungen beeinflusst. Hierfür wird eine neue Methode entwickelt, um eine nanoraue Silika-Beschichtung über die Gasphase auf eine superhydrophobe Oberfläche, die aus rauen Polystyrol-Silika-Kern-Schale-Partikeln besteht, aufzubringen. Es wird gezeigt, dass die Topographie und Dichte der Nanorauigkeiten bestimmt, ob sich die Superhydrophobizität verringert oder erhöht, d.h. ob sich ein Flüssigkeitstropfen im Nano-Wenzel- oder Nano-Cassie-Zustand befindet. Das verstärkte Pinning im Nano-Wenzel-Zustand beruht auf dem Eindringen von Flüssigkeitsmolekülen in die Nanoporen der Beschichtung. Im Nano-Cassie-Zustand dagegen sitzt der Tropfen auf den Nanorauigkeiten, was das Pinning vermindert. Die experimentellen Ergebnisse werden mit molekulardynamischen Simulationen in Bezug gesetzt, die den Einfluss der Oberflächenbeschichtungsdichte und der Länge von fluorinierten Silanen auf die Hydrophobizität einer Oberfläche untersuchen. rnEs wurden bereits verschiedenste Techniken zur Herstellung von transparenten superhydrophoben, d.h. extrem flüssigkeitsabweisenden, Oberflächen entwickelt. Eine aktuelle Herausforderung liegt darin, Funktionalitäten einzuführen, ohne die superhydrophoben Eigenschaften einer Oberfläche zu verändern. Dies ist extrem anspruchsvoll, da funktionelle Gruppen in der Regel hydrophil sind. In dieser Arbeit wird eine innovative Methode zur Herstellung von transparenten superhydrophoben Oberflächen aus Janus-Mikrosäulen mit variierenden Dimensionen und Topographien entwickelt. Die Janus-Säulen haben hydrophobe Seitenwände und hydrophile Silika-Oberseiten, die anschließend selektiv und ohne Verlust der superhydrophoben Eigenschaften der Oberfläche funktionalisiert werden können. Diese selektive Oberflächenfunktionalisierung wird mittels konfokaler Mikroskopie und durch das chemische Anbinden von fluoreszenten Molekülen an die Säulenoberseiten sichtbar gemacht. Außerdem wird gezeigt, dass das Benetzungsverhalten durch Wechselwirkungen zwischen Flüssigkeit und Festkörper in der Nähe der Benetzungslinie bestimmt wird. Diese Beobachtung widerlegt das allgemein akzeptierte Modell von Cassie und Baxter und beinhaltet, dass hydrophile Flächen, die durch mechanischen Abrieb freigelegt werden, nicht zu einem Verlust der Superhydrophobizität führen müssen, wie allgemein angenommen.rnBenetzung kann auch durch eine räumliche Beschränkung von Flüssigkeiten kontrolliert werden, z.B. in mikrofluidischen Systemen. Hier wird eine modifizierte Stöber-Synthese verwendet, um künstliche und natürliche Faser-Template mit einer Silika-Schicht zu ummanteln. Nach der thermischen Zersetzung des organischen Templat-Materials entstehen wohldefinierte Silika-Kanäle und Kanalkreuzungen mit gleichmäßigen Durchmessern im Nano- und Mikrometerbereich. Auf Grund ihrer Transparenz, mechanischen Stabilität und des großen Länge-zu-Durchmesser-Verhältnisses sind die Kanäle sehr gut geeignet, um die Füllgeschwindigkeiten von Flüssigkeiten mit variierenden Oberflächenspannungen und Viskositäten zu untersuchen. Konfokale Mikroskopie ermöglicht es hierbei, die Füllgeschwindigkeiten über eine Länge von mehreren Millimetern, sowie direkt am Kanaleingang zu messen. Das späte Füllstadium kann sehr gut mit der Lucas-Washburn-Gleichung beschrieben werden. Die anfänglichen Füllgeschwindigkeiten sind jedoch niedriger als theoretisch vorhergesagt. Wohingegen die vorhergehenden Abschnitte dieser Arbeit sich mit der quasistatischen Benetzung beschäftigen, spielt hier die Dynamik der Benetzung eine wichtige Rolle. Tatsächlich lassen sich die beobachteten Abweichungen durch einen geschwindigkeitsabhängigen Fortschreitkontaktwinkel erklären und durch dynamische Benetzungstheorien modellieren. Somit löst diese Arbeit das seit langem diskutierte Problem der Abweichungen von der Lucas-Washburn-Gleichung bei kleinen Füllgeschwindigkeiten.