Immune escape durch Überexpression von HER-2/neu

In Tumoren und Onkogen-transformierten Zellen finden sich häufig Defizienzen in der Expression von Komponenten der MHC Klasse I-Antigenprozessierung, die mit einer verminderten MHC Klasse I-Oberflächenexpression und einer reduzierten Sensitivität der Zellen gegenüber einer ZTL-vermittelten Lyse gekoppelt sein können. Da in den meisten Fällen die reduzierten Expressionsmuster über Zytokine revertiert werden können, werden verschiedene Regulationsmechanismen als Ursache für die Defizienzen postuliert. Auch in Zellen, die den „human epidermal growth factor receptor 2“ (HER-2/neu) überexprimieren, wurden derartige „Immune escape“-Mechanismen identifiziert. Aufgrund der Amplifikation und/oder Überexpression dieses Onkogens in Tumoren, die mit einer schnellen Progression der Erkrankung und einer schlechten Heilungsprognose assoziiert ist, wurden zahlreiche Therapien entwickelt, die auf einer Mobilisierung des Immunsystems gegenüber HER-2/neu oder dessen Blockade durch spezifische Antikörper abzielen. Die bisher jedoch nur unzureichenden Erfolge dieser Therapien könnten ihre Ursache in einer verminderten Immunogenität der HER-2/neu+-Zellen aufgrund von Defizienzen in der MHC Klasse I-Antigenprozessierung haben, weshalb die Untersuchung der molekularen Ursachen dieser Suppression für die Therapie von HER-2/neu+-Tumoren von besonderer Bedeutung ist. In dieser Arbeit wurde anhand eines in vitro-Systems ein HER-2/neu-vermittelter „Immune escape“-Phänotyp charakterisiert und die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen untersucht. Hierzu wurden murine, HER-2/neu--NIH3T3-Zellen mit HER-2/neu-transfizierten NIH3T3-Zellen verglichen. Die Untersuchung zeigte, dass die Oberflächenexpression von MHC Klasse I-Antigenen bei einer HER-2/neu-Überexpression vermindert ist. Dies ist assoziiert mit reduzierten Expressionen von LMP2, LMP10, PA28a, PA28b, ERAAP, TAP1, TAP2, und Tapasin, einem blockiertem TAP-Transport und einer fehlenden Sensitivität gegenüber einer ZTL-vermittelten Lyse. Da die analysierten Defekte durch eine Stimulation mit IFN‑g wieder revertiert werden können, wird eine transkriptionelle oder translationelle Regulation der betroffenen Gene durch HER-2/neu postuliert. Aufgrund dieser Ergebnisse ist eine T-Zell-vermittelte Therapie von HER-2/neu+-Tumoren als kritisch anzusehen. Die Untersuchung der Promotoren von TAP1/LMP2, TAP2 und Tapasin ergab geringere und durch IFN‑g-induzierbare Promotoraktivitäten in den HER-2/neu+-Zellen im Vergleich zu den HER-2/neu—-Zellen. Mittels Mutagenese-PCR und Gelretardationsanalysen konnte die Bindung eines Komplexes an zwei E2F- und einer P300-Bindungsstelle im Tapasin-Promotor identifiziert werden, die für die HER-2/neu-vermittelte Hemmung der Tapasin-Promotor­aktivität essentiell ist. Eine Inaktivierung der E2F- und P300-Motve in den TAP1/LMP2- und TAP2-Promotoren hatte dagegen keinen Einfluss auf die HER-2/neu-vermittelte Blockade der Promotoraktivität. Ein Vergleich der Promotoraktivitäten der HER-2/neu+- mit Ras-transformierten Zellen ergab, dass die TAP1/LMP2- und TAP2-Promotoren in beiden Zellen supprimiert werden, während der Tapasin-Promotor bei Ras-Transformation nicht beein­trächtigt ist. Der Einsatz von Inhibitoren zeigte, dass die Suppression des Tapasin-Promotors vermutlich über die PLC-g-PKC-Kaskade erfolgt. Dagegen konnte mit Inhibitoren gegen MAPK und PI3Kinase kein vergleichbarer Effekt erzielt werden. Aufgrund dieser Daten wird postuliert, dass HER-2/neu über die Signalkaskade PLC-g–PKC–E2F/P300 die Tapasin-Promotoraktivität supprimiert, wohingegen noch bisher unbekannte Signalkaskaden von HER-2/neu und Ras zu einer Hemmung der TAP1/LMP2- und TAP2-Promotoraktivität führen. Da die Komplexbildung von E2F und P300 auch im Zellzyklus eine Rolle spielt, wird eine negative Korrelation zwischen Zell-Proliferation und MHC Klasse I-Antigenpräsentation postuliert, die Gegenstand künftiger Studien sein wird.

DNA methylation, histone modification and the transcription factor dE2F1 in Drosophila

Drosophila melanogaster enthält eine geringe Menge an 5-methyl-Cytosin. Die von mir untersuchte männliche Keimbahn von Drosophila weist jedoch keine nachweisbaren Mengen an DNA-Methylierung auf. Eine künstliche Expression der murinen de novo Methyltransferasen, DNMT3A und DNMT3B1, in den Fliegenhoden, führte nicht zu der erwarteten Methylierungszunahme und hatte keinen Effekt auf die Fruchtbarkeit der Männchen. Auch die gewebespezifische Expression unter der Verwendung des UAS/GAL4-Systems zeigte keine phenotypischen Veränderungen. Hingegen fanden wir auf Protein-Ebene des Chromatins von D. melanogaster und D. hydei spezifische Modifikationsmuster der Histone H3 und H4 in der Keimbahn, wie auch in den somatischen Zellen des Hodenschlauches. Die Modifikationsmuster der beiden Zelltypen unterscheiden sich grundlegend und weichen zudem von dem für Eu- und Heterochromatin erwarteten ab, was auf eine größere Komplexität des „Histon-Codes“ als angenommen hindeutet. Folglich liegt die epigenetische Information in Drosophila wahrscheinlich anstatt auf DNA- auf Protein-Ebene, wodurch Genexpression über die Chromatinstruktur reguliert wird. Es wurde gezeigt, dass der Transkriptionsfaktor E2F, der eine Schlüsselfunktion im Zellzyklus hat, durch unterschiedliche Transkripte offenbar quantitativ reguliert wird. Unsere Nachforschungen ergaben, dass die drei E2F1 Genprodukte in Drosophila neben ihrer Zellspezifität auch in unterschiedlichen Expressionsniveaus auftreten, was die Annahme einer quantitativen Expression unterstützt. Die verschiedenen Funktionen der multiplen Gene in Säugern, könnten so funktionell kompensiert werden. Die durch die Expression dreier dE2F1-Transkripte vermutete Synthese verschiedener Proteine konnte nicht bewiesen werden.

Untersuchungen zum Mechanismus der Zytotoxizität von alkylierenden Agenzien in malignen Melanomzellen

Maligne Melanome sind gegenüber Chemotherapeutika relativ resistent. Das methylierende Alkylanz Temozolomid sowie das chlorethylierende und DNA-Interstrand Crosslink (ICL) bildende Alkylanz Fotemustin kommen bei der Behandlung des malignen Melanoms als Mittel erster Wahl zum Einsatz. In der vorliegenden Arbeit konnte das erste Mal nachgewiesen werden, dass die zytotoxische Wirkung von Temozolomid und Fotemustin in Melanomzellen durch Apoptose vermittelt wird. Unter Verwendung klinisch relevanter Dosen der beiden Alkylantien konnte die Induktion von Apoptose durch vier unabhängige Methoden (Bestimmung der SubG1-Fraktion und der Apoptose- / Nekrose-Frequenz, Aktivierung der Effektorcaspasen-3 und -7 sowie Spaltung von PARP-1) nachgewiesen werden. Die Alkylierungen an der O6-Position des Guanins, welche durch beide Agenzien induziert werden, sind auch in Melanomzellen die wichtigsten Zytotoxizität-bewirkenden Läsionen in der DNA, und die O6-Methylguanin-DNA-Methyltransferase (MGMT) ist folglich ein herausragender Resistenzmarker. Eine der verwendeten Zelllinien (D05) exprimierte p53-Wildtypprotein. Diese Zelllinie war resistenter als alle anderen Zelllinien gegenüber Temozolomid und Fotemustin. Dies weist darauf hin, dass p53 nicht die Apoptoseinduktion in Melanomzellen verstärkt. Die Prozessierung des O6MeG erfolgt über die Mismatch-Reparatur (MMR) unter Generierung von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSBs). Die Untersuchung der durch Temozolomid induzierten DSBs, nachgewiesen durch gammaH2AX-Induktion, korrelierte direkt mit der apoptotischen Antwort von Melanomzelllinien und DSBs können somit als eine entscheidende apoptoseauslösende Größe angesehen werden. Eine Resistenz gegenüber dem methylierenden Temozolomid in der Zelllinie MZ7 konnte auf einen Defekt in der MMR-Schadenserkennung auf der Ebene des MutSalpha-Komplexes zurückgeführt werden. Dieser Defekt hatte keinen Einfluss auf die Fotemustin-vermittelte Apoptoseinduktion. Neben MGMT konnte somit die MMR als Resistenzfaktor gegenüber methylierenden Agenzien in Melanomen identifiziert werden. Die Fotemustin-induzierte Apoptose wurde in Melanomzelllinien im Detail untersucht. Es konnte erstmals gezeigt werden, dass Fotemustin-bedingte ICLs in Zellen einen G2/M-Arrest im Behandlungszyklus induzieren. Wie anhand G1-arretierter Zellen nachgewiesen werden konnte, war das Durchlaufen der DNA-Replikation vor Erreichen des Arrests für die Induktion der Apoptose notwendig. Die Prozessierung von ICLs ist im Vergleich zu Methylierungen der DNA deutlich komplexer. Dies könnte erklären, warum in Melanomzellen die durch gammaH2AX-Induktion repräsentierten DSBs nicht mit der Sensitivität der einzelnen Zelllinien korreliert. Die Untersuchung unterschiedlich sensitiver Zelllinien zeigte ein vergleichbares Schadensniveau an ICLs und eine ebenso vergleichbare initiale Prozessierung derselben unter Generierung von DSBs. Die Prozessierung dieser sekundären Läsionen, welche anhand der Abnahme von gammaH2AX-Foci untersucht wurde, war hingegen in der sensitiveren Melanomzelllinie deutlich weniger effektiv. Es konnte weiterhin nachgewiesen werden, dass eine uneffektive Prozessierung der sekundären Läsionen einhergeht mit einer verstärkten und länger anhaltenden Aktivierung der in der DSB-Detektion beteiligten Kinase ATM und der Checkpoint Kinase 1. Es wäre daher denkbar, dass eine verstärkte Aktivität dieser Kinasen proapoptotische Signale vermittelt. Unterschiede in der Prozessierung der sekundären Läsionen könnten somit ein wichtiger Marker der ICL-induzierten Apoptose darstellen. Des weitern konnte nachgewiesen werden, dass nach Fotemustingabe die mitochondrial-vermittelte Apoptose einen effektiven Exekutionsweg in Melanomen darstellt. Während Cytochrom C-Freigabe, Bcl-2-Abnahme an den Mitochondrien, Bax-Rekrutierung und Caspase-9 Aktivität nachgewiesen werden konnten, wurden keine Hinweise auf eine Fas-Rezeptor-vermittelte Apoptose gefunden. Die Unfähigkeit, Rezeptor-vermittelte Apoptose zu unterlaufen, könnte die Bedeutungslosigkeit des p53-Gens in Melanomen begründen, da gerade dieser Weg in der Alkylantien-induzierten Apoptose in anderen Zellsystemen eine große Relevanz besitzt. Bei der Suche nach einem alternativen proapoptotischen Signalweg konnten Hinweise für die Beteiligung des Rb/E2F-1-Wegs, welcher über p73 agiert, in einer p53-mutierten Melanomzelllinie gefunden werden. Einen Einfluss der Proteine Survivin und XIAP als Resistenzfaktoren auf die Fotemustin-induzierte Apoptose wurde hingegen nicht nachgewiesen.