Aspects of poriferan (Suberites domuncula) apoptosis and innate immune system and evolutionary implications

Survivin, a unique member of the family of inhibitors of apoptosis (IAP) proteins, orchestrates intracellular pathways during cell division and apoptosis. Its central regulatory function in vertebrate molecular pathways as mitotic regulator and inhibitor of apoptotic cell death has major implications for tumor cell proliferation and viability, and has inspired several approaches that target survivin for cancer therapy. Analyses in early-branching Metazoa so far propose an exclusive role of survivin as a chromosomal passenger protein, whereas only later during evolution the second, complementary antiapoptotic function might have arisen, concurrent with increased organismal complexity. To lift the veil on the ancestral function(s) of this key regulatory molecule, a survivin homologue of the phylogenetically oldest extant metazoan taxon (phylum Porifera) was identified and functionally characterized. SURVL of the demosponge Suberites domuncula shares significant similarities with its metazoan homologues, ranging from conserved exon/intron structures to the presence of localization signal and protein-interaction domains, characteristic of IAP proteins. Whereas sponge tissue displayed a very low steady-state level, SURVL expression was significantly up-regulated in rapidly proliferating primmorph cells. In addition, challenge of sponge tissue and primmorphs with cadmium and the lipopeptide Pam3Cys-Ser-(Lys)4 stimulated SURVL expression, concurrent with the expression of newly discovered poriferan caspases (CASL and CASL2). Complementary functional analyses in transfected HEK-293 revealed that heterologous expression of poriferan survivin in human cells not only promotes cell proliferation but also augments resistance to cadmium-induced cell death. Taken together, these results demonstrate both a deep evolutionary conserved and fundamental dual role of survivin, and an equally conserved central position of this key regulatory molecule in interconnected pathways of cell cycle and apoptosis. Additionally, SDCASL, SDCASL2, and SDTILRc (TIR-LRR containing protein) may represent new components of the innate defense sentinel in sponges. SDCASL and SDCASL2 are two new caspase-homolog proteins with a singular structure. In addition to their CASc domains, SDCASL and SDCASL2 feature a small prodomain NH2-terminal (effector caspases) and a remarkably long COOH-terminal domain containing one or several functional double stranded RNA binding domains (dsrm). This new caspase prototype can characterize a caspase specialization coupling pathogen sensing and apoptosis, and could represent a very efficient defense mechanism. SDTILRc encompasses also a unique combination of domains: several leucine rich repeats (LRR) and a Toll/IL-1 receptor (TIR) domain. This unusual domain association may correspond to a new family of intracellular sensing protein, forming a subclass of pattern recognition receptors (PRR).

RNA-Strukturen im Hepatitis-C-Virus und ihre Bedeutung für Translation und Replikation

Das Hepatitis C Virus (HCV) ist ein umhülltes Virus aus der Familie der Flaviviridae. Es besitzt ein Plusstrang-RNA Genom von ca. 9600 Nukleotiden Länge, das nur ein kodierendes Leseraster besitzt. Das Genom wird am 5’ und 3’ Ende von nicht-translatierten Sequenzen (NTRs) flankiert, welche für die Translation und vermutlich auch Replikation von Bedeutung sind. Die 5’ NTR besitzt eine interne Ribosomeneintrittsstelle (IRES), die eine cap-unabhängige Translation des ca. 3000 Aminosäure langen viralen Polyproteins erlaubt. Dieses wird ko- und posttranslational von zellulären und viralen Proteasen in 10 funktionelle Komponenten gespalten. Inwieweit die 5’ NTR auch für die Replikation der HCV RNA benötigt wird, war zu Beginn der Arbeit nicht bekannt. Die 3’ NTR besitzt eine dreigeteilte Struktur, bestehend aus einer variablen Region, dem polyU/UC-Bereich und der sogenannten X-Sequenz, eine hochkonservierte 98 Nukleotide lange Region, die vermutlich für die RNA-Replikation und möglicherweise auch für die Translation benötigt wird. Die genuae Rolle der 3’ NTR für diese beiden Prozesse war zu Beginn der Arbeit jedoch nicht bekannt. Ziel der Dissertation war deshalb eine detaillierte genetische Untersuchung der NTRs hinsichtlich ihrer Bedeutung für die RNA-Translation und -Replikation. In die Analyse mit einbezogen wurden auch RNA-Strukturen innerhalb der kodierenden Region, die zwischen verschiedenen HCV-Genotypen hoch konserviert sind und die mit verschiedenen computer-basierten Modellen vorhergesagt wurden. Zur Kartierung der für RNA-Replikation benötigten Minimallänge der 5’ NTR wurde eine Reihe von Chimären hergestellt, in denen unterschiedlich lange Bereiche der HCV 5’ NTR 3’ terminal mit der IRES des Poliovirus fusioniert wurden. Mit diesem Ansatz konnten wir zeigen, dass die ersten 120 Nukleotide der HCV 5’ NTR als Minimaldomäne für Replikation ausreichen. Weiterhin ergab sich eine klare Korrelation zwischen der Länge der HCV 5’ NTR und der Replikationseffizienz. Mit steigender Länge der 5’ NTR nahm auch die Replikationseffizienz zu, die dann maximal war, wenn das vollständige 5’ Element mit der Poliovirus-IRES fusioniert wurde. Die hier gefundene Kopplung von Translation und Replikation in der HCV 5’ NTR könnte auf einen Mechanismus zur Regulation beider Funktionen hindeuten. Es konnte allerdings noch nicht geklärt werden, welche Bereiche innerhalb der Grenzen des IRES-Elements genau für die RNA-Replikation benötigt werden. Untersuchungen im Bereich der 3’ NTR ergaben, dass die variable Region für die Replikation entbehrlich, die X-Sequenz jedoch essentiell ist. Der polyU/UC-Bereich musste eine Länge von mindestens 11-30 Uridinen besitzen, wobei maximale Replikation ab einer Länge von 30-50 Uridinen beobachtet wurde. Die Addition von heterologen Sequenzen an das 3’ Ende der HCV-RNA führte zu einer starken Reduktion der Replikation. In den hier durchgeführten Untersuchungen zeigte keines der Elemente in der 3’ NTR einen signifikanten Einfluss auf die Translation. Ein weiteres cis aktives RNA-Element wurde im 3’ kodierenden Bereich für das NS5B Protein beschrieben. Wir fanden, dass Veränderungen dieser Struktur durch stille Punktmutationen die Replikation hemmten, welche durch die Insertion einer intakten Version dieses RNA-Elements in die variable Region der 3’ NTR wieder hergestellt werden konnte. Dieser Versuchsansatz erlaubte die genaue Untersuchung der für die Replikation kritischen Strukturelemente. Dadurch konnte gezeigt werden, dass die Struktur und die Primärsequenz der Loopbereiche essentiell sind. Darüber hinaus wurde eine Sequenzkomplementarität zwischen dem Element in der NS5B-kodierenden Region und einem RNA-Bereich in der X-Sequenz der 3’ NTR gefunden, die eine sog. „kissing loop“ Interaktion eingehen kann. Mit Hilfe von gezielten Mutationen konnten wir zeigen, dass diese RNA:RNA Interaktion zumindest transient stattfindet und für die Replikation des HCV essentiell ist.

First contact imaging of nanoparticular siRNA – From synthesis to application of a prodye concept

Delivery of therapeutic nucleic acid based drugs is still very demanding and difficult to manage and monitor. For this reason, a precise method for the monitoring of RNAi pathways is necessary. This thesis explores a new approach for sensing of potentially therapeutic nucleic acids, using the interaction of so called prodyes with intracellular enzymes in a prodrug manner. To realize this concept, some non-fluorescent, fluorescein based asymmetric dyes were synthesized and their spectroscopic characteristics were studied. Azide-alkyne Click chemistry was applied for conjugation purposes, using a new protocol at weak acidic pH to get intact prodye constructs. Both, an electrophoretic mobility shift assay with polyacrylamide gels and in-cuvette experiments showed remarkable OFF-to-ON behavior of these new siRNA constructs under physiological conditions. After salt-free purification, subsequent hybridization to double-stranded ribonucleic acids and nanoformulation to lipoplexes, the prodye conjugated siRNA was examined in cellular uptake studies for First Contact Imaging. The investigated siRNA-prodye conjugates showed strong sensitivity to esterases, being hydrolyzed at the biolabile function and developing a strong fluorescence which was verified in bulk. As an optimization, a new profluorescent molecule system was designed and synthesized, which has a carbonate as biolabile 6’ protecting group and a highly water soluble 3’ clickable linker. This new non-fluorescent but colored prodye showed 12 - 320 times increased fluorescence intensities between OFF- and ON- states, depending to the deprotection method. This is the first reported molecule model of an asymmetric profluorescent fluorescein, having the very favorable 3’ & 6’ functions.

Entwicklung einer Online-Kopplung der Gelelektrophorese mit der induktiv gekoppelten Plasma-Massenspektrometrie und deren Anwendung in der Bioanalytik

Die Elementmassenspektrometrie wurde in den letzten Jahren sehr erfolgreich zur Aufklärung verschiedener Fragestellungen in der Bioanalytik eingesetzt. Hierbei spielen vor allem Kopplungstechniken von Trennmethoden wie der Flüssigchromatographie (LC) oder der Kapillarelektrophorese (CE) mit der induktiv gekoppelten Plasma-Massenspektrometrie (ICP-MS) als Multielementdetektor mit hervorragenden Quantifizierungseigenschaften eine entscheidende Rolle bei der Untersuchung von Biopolymeren und deren Wechselwirkung mit verschiedenen Metallen. So wurden beispielsweise verschiedene Methoden für die Trennung und Detektion von Metalloproteinen oder DNA-Metall-Addukten in unterschiedlichen Probenmaterialien entwickelt. Die traditionelle und leistungsstärkste Trennmethode für Biopolymere aller Art, die Gelelektrophorese, wurde jedoch bislang nicht in einem Online-Verfahren an die ICP-MS gekoppelt, um solche Fragestellungen zu bearbeiten. Verschiedene Versuche auf der Basis der Laserablation wurden in diese Richtung unternommen, wobei diese Techniken als sehr umständlich und zeitaufwändig anzusehen sind. In dieser Arbeit wird erstmals die technische Realisierung einer Online-Kopplung der Gelelektrophorese mit der ICP-MS beschrieben. Das System basiert auf einem Prinzip aus der präparativen Gelelektrophorese, in welcher eine kontinuierliche Elution der getrennten Komponenten aus dem Gel während der laufenden Elektrophorese durchgeführt wird. Die eluierten Komponenten werden mit dem Elutionspuffer direkt in das Zerstäubersystem des ICP-MS geführt. Die ersten Untersuchungen wurden am Beispiel der Fragemente von doppelsträngiger DNA (dsDNA) durchgeführt. Kommerziell erhältliche Standardlösungen wurden mit der Online-GE-ICP-MS mittels Detektion von 31P an einem hochauflösenden Massenspektrometer mit einer Massenauflösung von 4000 analysiert. Die Trennbedingungen (z.B. pH-Wert oder Ionenstärke der Pufferlösungen) wurden für die Trennung von dsDNA-Fragementen in Agarosegelen optimiert und auf verschiedene dsDNA-Fragmente angewandt. In einem nächsten Schritt wurden die Quantifizierungsmöglichkeiten für Biopolymere untersucht. Sehr kleine Mengen an dsDNA konnten mit einer Präzision von weniger als 3% quantifiziert werden. Hierfür kamen verschiedene Möglichkeiten der externen Kalibration zum Einsatz, wie der Kalibration mit einem Phosphat-Standard oder einem kommerziell erhältlichen quantitativen dsDNA-Standard. Um das Potenzial der entwickelten Methode für die Untersuchung von Biopolymer-Metall-Wechselwirkungen zu demonstrieren, wurden Oligonukleotide mit Cisplatin unter physiologischen Bedingungen inkubiert und die Reaktionsprodukte mit der Online-GE-ICP-MS mittels 31P- und 195Pt-Detektion untersucht. Verschiedene Cisplatin-Oligonukleotid-Addukte konnten auf diese Weise beobachtet werden, was zur Identifizierung die Anwendung der MALDI-TOF-MS als komplementärer Form der Massenspektrometrie notwendig machte. Abschließend wurde die Isotopenverdünnungsanalyse zum Zweck der Quantifizierung herangezogen.

Strukturbildung durch Selbstorganisation von Oligonukleotiden

Die DNA-Doppelhelix ist eine relativ dicke (Ø ≈ 2 nm), kompakte und dadurch auf kurzen Längenskalen relativ steife Verbindung (lp[dsDNA] ≈ 50-60 nm), mit einer klar definierten Struktur, die durch biologische Methoden sehr präzise manipuliert werden kann. Die Auswirkungen der primären Sequenz auf die dreidimensionale Strukturbildung ist gut verstanden und exakt vorhersagbar. Des Weiteren kann DNA an verschiedenen Stellen mit anderen Molekülen verknüpft werden, ohne dass ihre Selbsterkennung gestört wird. Durch die helikale Struktur besteht außerdem ein Zusammenhang zwischen der Lage und der räumlichen Orientierung von eingeführten Modifikationen. Durch moderne Syntheseverfahren lassen sich beliebige Oligonukleotidsequenzen im Bereich bis etwa 150-200 Basen relativ preiswert im Milligrammmaßstab herstellen. Diese Eigenschaften machen die DNA zu einem idealen Kandidaten zur Erzeugung komplexer Strukturen, die durch Selbsterkennung der entsprechenden Sequenzen gebildet werden. In der hier vorgelegten Arbeit wurden einzelsträngige DNA-Abschnitte (ssDNA) als adressierbare Verknüpfungsstellen eingesetzt, um verschiedene molekulare Bausteine zu diskreten nicht periodischen Strukturen zu verbinden. Als Bausteine dienten flexible synthetische Polymerblöcke und semiflexible Doppelstrang-DNA-Abschnitte (dsDNA), die an beiden Enden mit unterschiedlichen Oligonukleotidsequenzen „funktionalisiert“ sind. Die zur Verknüpfung genutzten Oligonukleotidabschnitte wurden so gewählt (n > 20 Basen), dass ihre Hybridisierung zu einer bei Raumtemperatur stabilen Doppelstrangbildung führt. Durch Kombination der Phosphoramiditsynthese von DNA mit einer festkörpergestützten Blockkopplungsreaktion konnte am Beispiel von Polyethylenoxiden ein sehr effektiver Syntheseweg zur Herstellung von ssDNA1-PEO-ssDNA2-Triblockcopolymeren entwickelt werden, der sich problemlos auf andere Polymere übertragen lassen sollte. Die Längen und Basenabfolgen der beiden Oligonukleotidsequenzen können dabei unabhängig voneinander frei gewählt werden. Somit wurden die Voraussetzungen geschaffen, um die Selbsterkennung von Oligonukleotiden durch Kombination verschiedener Triblockcopolymere zur Erzeugung von Multiblockcopolymeren zu nutzen, die mit klassischen Synthesetechniken nicht zugänglich sind. Semiflexible Strukturelemente lassen sich durch die Synthese von Doppelstrangfragmenten mit langen überstehenden Enden (sticky-ends) realisieren. Die klassischen Ansätze der molekularen Genetik zur Erzeugung von sticky-ends sind in diesem Fall nicht praktikabel, da sie zu Einschränkungen im Bezug auf Länge und Sequenz der überhängenden Enden führen. Als Methode der Wahl haben sich zwei verschiedene Varianten der Polymerase Kettenreaktion (PCR) erwiesen, die auf der Verwendung von teilkomplementären Primern beruhen. Die eigentlichen Primersequenzen wurden am 5´-Ende entweder über ein 2´-Desoxyuridin oder über einen kurzen Polyethylenoxid-Spacer (n = 6) mit einer frei wählbaren „sticky-end-Sequenz“ verknüpft. Mit diesen Methoden sind sowohl 3´- als auch 5´-Überhänge zugänglich und die Länge der Doppelstrangabschnitte kann über einen breiten Molmassenbereich sehr exakt eingestellt werden. Durch Kombination derartiger Doppelstrangfragmente mit den biosynthetischen Triblockcopolymeren lassen sich Strukturen erzeugen, die als Modellsysteme zur Untersuchung verschiedener Biomoleküle genutzt werden können, die in Form eines mehrfach gebrochenen Stäbchens vorliegen. Im letzten Abschnitt wurde gezeigt, dass durch geeignete Wahl der überstehenden Enden bzw. durch Hybridisierung der Doppelstrangfragmente mit passenden Oligonukleotiden verzweigte DNA-Strukturen mit Armlängen von einigen hundert Nanometern zugänglich sind. Im Vergleich zu den bisher veröffentlichten Methoden bietet diese Herangehensweise zwei entscheidende Vorteile: Zum einen konnte der Syntheseaufwand auf ein Minimum reduziert werden, zum anderen ist es auf diesem Weg möglich die Längen der einzelnen Arme, unabhängig voneinander, über einen breiten Molmassenbereich zu variieren.

DNA-Polymer-Hybride als molekulare Bausteine

Die DNA hat sich durch die herausstechende Eigenschaft zur Selbstorganisation in den Naturwissenschaften zu einem beliebten Werkzeug entwickelt. In dieser Arbeit wurde die Oligonukleotidselbsterkennung zum Aufbau komplexer Multiblockcopolymere genutzt. Dabei dienten komplementäre einzelsträngige Oligonukleotidsequenzen (ssDNA) als adressierbare Verbindungsstücke zwischen synthetischen Blöcken. Als Bausteine wurden asymmetrische Dreiblockcopolymere der Form DNA1-Polymer-DNA2 aus einer flexiblen Polymereinheit (PEO bzw. PPO) die an beiden Enden mit unterschiedlichen Oligonukleotidsequenzen „funktionalisiert“ ist, verwendet. Diese Bausteine konnten durch die Kombination von Festphasensynthese der Oligonukleotide und Blockkopplung dargestellt werden. Die Oligonukleotidsequenzen wurden so gewählt, dass deren Hybridisierung zu einer bei Raumtemperatur stabilen Verbindung führt. Durch die Verwendung dieser Bausteine erhält man ein modulares System, dass sich durch seine hohe Flexibilität auszeichnet. Aus den dargestellten Dreiblockcopolymeren konnten verschiedene alternierende Multiblockcopolymere aufgebaut werden, wobei die Anzahl der Blöcke (von 11 bis 15) und das PEO / PPO- Verhältnis variiert wurden. Derartige Strukturen sind auf der Grundlage chemischer Synthesen unerreichbar. Die Flexibilität dieses modularen Systems konnte gezeigt werden, indem einzelne Blockbausteine zur Strukturaufklärung einfach ausgetauscht oder weggelassen werden konnten. Durch geeignete Wahl der DNA-Sequenzen konnte zusätzlich das Polymerisationsverhalten dieser Bauelemente untersucht werden. Die Integration längerer kettensteifer DNA-Abschnitte in die Multiblockstrukturen erfolgte durch die Verwendung teilkomplementärer Oligonukleotide. Diese bieten den Vorteil, dass bis zu einer Größe von etwa 150 bp sowohl die Länge als auch die Sequenz der Doppelstrangabschnitte und sticky-ends frei variiert werden können. Die biosynthetischen Dreiblockcopolymere dienten hier als Linkermoleküle zwischen den einzelnen dsDNA-Blöcken. Nach diesem Konzept wurde ein Nonamer als Modellsystem eines mehrfach gebrochenen Stäbchens synthetisiert. Außerdem wurden mit Hilfe der Polymerase Kettenreaktion (PCR) semiflexible DNA Abschnitte erzeugt. Durch die Wahl des Synthesewegs konnte sowohl die Länge der semiflexiblen Einheit als auch die Länge und die Sequenz des sticky-ends variiert werden. Anhand dieser Modellverbindungen wurde dann das Hybridisierungsverhalten in Abhängigkeit der Linker- und Segmentlängen untersucht.

Synthese, Charakterisierung und Testung von Phenylacrylsäure-Derivaten, Benzothiazolen und Diarylthioethern als potentielle Inhibitoren der Dengue-Virus-Typ-2-NS2B-NS3-Protease

Dengue-Fieber ist eine durch Stechmücken der Gattungen Aedes aegypti und Aedes albopticus übertragene, virale Infektionskrankheit des Menschen, welche eine zunehmende Bedrohung für die Weltbevölkerung darstellt; das Infektionsrisiko betrifft vorwiegend Menschen, die in tropischen und subtropischen Gebieten der Erde (Asien, Afrika, Amerika) leben. Bei dem Erreger handelt es sich um ein Flavivirus, bestehend aus einer positiv polarisierten Einzelstrang-RNA, welches in vier verschiedenen Serotypen existiert. Eine Infektion mit Dengue-Viren zeigt sich durch drei mögliche Krankheitsbilder: Klassisches Dengue-Fieber (DF), hämorrhagisches Dengue-Fieber (DHF) oder Dengue-Schock-Syndrom (DSS). Das Dengue-Virus-Genom codiert eine Serin-Protease mit einer klassischen katalytischen Triade, bestehend aus den Aminosäuren His51, Asp75 und Ser135. Die Funktion der Dengue-Virus-Protease besteht in der post-translationalen, proteolytischen Prozessierung des viralen Polyprotein-Vorläufers, womit sie essentiell für die Virus-Replikation ist und damit einen wichtigen therapeutischen Ansatz für die Entwicklung neuer Wirkstoffe gegen Dengue-Fieber darstellt. Die Ziele der vorliegenden Arbeit bestanden darin, neue potentielle Inhibitoren der Dengue-Virus Typ 2 NS2B-NS3 Protease (DEN-2 NS2B-NS3pro) zu synthetisieren, deren Hemmwirkung sowie den Inhibitionstyp mithilfe fluorimetrischer Enzym-Assays zu bestimmen, Struktur-Wirkungs-Beziehungen (u.a. mithilfe von Molecular Docking-Rechnungen) zu analysieren und die erhaltenen Leitstrukturen zu optimieren. In der vorliegenden Arbeit wurden zwei Substanzklassen und damit zwei Teilprojekte behandelt: Phenylacrylsäureamide im ersten Teilprojekt, Benzothiazole und Diarylthioether zusammen im zweiten Teilprojekt. Im ersten Teilprojekt zeigten einige Phenylacrylsäureamide eine schwache Hemmung der DEN-2 NS2B-NS3pro zwischen ca. 50 und 61 % bei einer Inhibitorkonzentration von 50 µM sowie eine nicht-kompetitive Hemmung, welche jedoch durch vielfältige Derivatisierung kaum verändert oder verbessert werden konnte. Darüber hinaus wurden die endogenen Serin-Proteasen alpha-Chymotrypsin und Trypsin durch einige Phenylacrylsäureamide erheblich stärker gehemmt als die DEN-2 NS2B-NS3pro. Das zweite Teilprojekt befasste sich mit der Synthese und Testung von Diarylthioethern mit hydroxy-substituierten Benzothiazol-Bausteinen sowie der Testung einiger methoxy-substituierter Synthese-Vorstufen der Endverbindungen, um die Relevanz und den Einfluss der einzelnen Bausteine auf die Hemmung der DEN-2 NS2B-NS3pro zu untersuchen. Der in der vorliegenden Arbeit synthetisierte, potenteste Inhibitor der DEN-2 NS2B-NS3pro (Hemmung: 90 % [50 µM]; IC50 = 3.6 +/- 0.11 µM) und der DEN-3 NS2B-NS3pro (Hemmung: >99 % [100 µM]; IC50 = 9.1 +/- 1.02 µM), SH65, ein Diarylthioether-Benzothiazol-Derivat, entstand aufgrund der Vorhersage zweier möglicher Bindungsmodi (kompetitiv und nicht-kompetitiv) mithilfe von Molecular Docking-Experimenten an der Röntgen-Kristall-struktur der DEN-3 NS2B-NS3pro (PDB-Code: 3U1I). Nach experimenteller Bestimmung der IC50-Werte bei unterschiedlichen Substratkonzentrationen erwies sich SH65 jedoch als nicht-kompetitiver Inhibitor der DEN-2 NS2B-NS3pro. Trypsin wurde von SH65 vergleichbar stark gehemmt (96% [50 µM]; IC50 = 6.27 +/- 0.68 µM) wie die beiden getesteten Dengue-Virus-Proteasen, nicht jedoch alpha-Chymotrypsin (nur 21% Hemmung bei 50 µM), wodurch diesem Inhibitor zumindest eine relative Selektivität gegenüber Serin-Proteasen zugeschrieben werden kann. SH65 zeigte lediglich Protease-Hemmung in den Enzym-Assays, jedoch keine antivirale Aktivität bei der Testung an Dengue-Virus-infizierten Zellen, was aber wiederum bei der synthetisierten Vorstufe von SH65, welche anstelle der beiden Hydroxy-Gruppen über Methoxy-Gruppen verfügt, der Fall war. Diarylthioether mit mehrfach hydroxy-substituiertem Benzothiazol-Baustein stellen hiermit eine neue, vielversprechende Wirkstoffgruppe zur Hemmung sowohl der Dengue-Virus Typ 2- als auch der Dengue-Virus Typ 3 NS2B-NS3 Protease dar.