Boron determination in biological samples - Intercomparison of three analytical methods to assist development of a treatment protocol for neoplastic diseases of the liver with Boron Neutron Capture Therapy

Die Bor-Neuroneneinfang-Therapie (engl.: Boron Neutron Capture Therapy, BNCT) ist eine indirekte Strahlentherapie, welche durch die gezielte Freisetzung von dicht ionisierender Strahlung Tumorzellen zerstört. Die freigesetzten Ionen sind Spaltfragmente einer Kernreaktion, bei welcher das Isotop 10B ein niederenergetisches (thermisches) Neutron einfängt. Das 10B wird durch ein spezielles Borpräparat in den Tumorzellen angereichert, welches selbst nicht radioaktiv ist. rnAn der Johannes Gutenberg-Universität Mainz wurde die Forschung für die Anwendung eines klinischen Behandlungsprotokolls durch zwei Heilversuche bei Patienten mit kolorektalen Lebermetastasen an der Universität Pavia, Italien, angeregt, bei denen die Leber außerhalb des Körpers in einem Forschungsreaktor bestrahlt wurde. Als erster Schritt wurde in Kooperation verschiedener universitärer Institute eine klinische Studie zur Bestimmung klinisch relevanter Parameter wie der Borverteilung in verschiedenen Geweben und dem pharmakokinetischen Aufnahmeverhalten des Borpräparates initiiert.rnDie Borkonzentration in den Gewebeproben wurde hinsichtlich ihrer räumlichen Verteilung in verschiedenen Zellarealen bestimmt, um mehr über das Aufnahmeverhalten der Zellen für das BPA im Hinblick auf ihre biologischen Charakteristika zu erfahren. Die Borbestimung wurde per Quantitative Neutron Capture Radiography, Prompt Gamma Activation Analysis und Inductively Coupled Plasma Mass Spectroscopy parallel zur histologischen Analyse des Gewebes durchgeführt. Es war möglich zu zeigen, dass in Proben aus Tumorgewebe und aus tumorfreiem Gewebe mit unterschiedlichen morphologischen Eigenschaften eine sehr heterogene Borverteilung vorliegt. Die Ergebnisse der Blutproben werden für die Erstellung eines pharmakokinetischen Modells verwendet und sind in Übereinstimmung mit existierenden pharmakokinetische Modellen. Zusätzlich wurden die Methoden zur Borbestimmung über speziell hergestellte Referenzstandards untereinander verglichen. Dabei wurde eine gute Übereinstimmung der Ergebnisse festgestellt, ferner wurde für alle biologischen Proben Standardanalyseprotokolle erstellt.rnDie bisher erhaltenen Ergebnisse der klinischen Studie sind vielversprechend, lassen aber noch keine endgültigen Schlussfolgerungen hinsichtlich der Wirksamkeit von BNCT für maligne Lebererkrankungen zu. rn

Diffusionsgewichtete Helium-3 Magnetresonanztomographie zur Untersuchung der Lunge

Die diffusionsgewichtete Magnetresonanztomographie (MRT) mit dem hyperpolarisierten Edelgas-Isotop 3He ist ein neues Verfahren zur Untersuchung von Erkrankungen der Atem-wege und der Lunge. Die Diffusionsbewegung der 3He-Atome in den Luftwegen der Lunge wird durch deren Wände begrenzt, wobei diese Einschränkung sowohl von den Dimensionen der Atemwege als auch von den Messparametern abhängt. Man misst daher einen scheinbaren Diffusionskoeffizienten (Apparent Diffusion Coefficient, ADC) der kleiner ist als der Diffusionskoeffizient bei freier Diffusion. Der ADC gestattet somit eine qualitative Abschät-zung der Größe der Luftwege und deren krankhafte Veränderung, ohne eine direkte Abbil-dung der Luftwege selbst. Eine dreidimensionale Abbildung der räumlichen Verteilung von Lungenschädigungen wird dadurch möglich. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, ein tieferes physikalisch fundiertes Verständnis der 3He-Diffusionsmessung zu ermöglichen und die Methode der diffusionsgewichteten 3He-MRT hin zur Erfassung des kompletten 3He-Diffusionstensors weiterzuentwickeln. Dazu wurde systematisch im Rahmen von Phantom- und tierexperimentellen Studien sowie Patientenmes-sungen untersucht, inwieweit unterschiedliche Einflussfaktoren das Ergebnis der ADC-Messung beeinflussen. So konnte beispielsweise nachgewiesen werden, dass residuale Luftströmungen am Ende der Einatmung keinen Einfluss auf den ADC-Wert haben. Durch Simulationsrechnungen konnte gezeigt werden, in welchem Maße sich die durch den Anregungspuls hervorgerufene Abnah-me der Polarisation des 3He-Gases auf den gemessenen ADC-Wert auswirkt. In einer Studie an lungengesunden Probanden und Patienten konnte die Wiederholbarkeit der ADC-Messung untersucht werden, aber auch der Einfluss von Gravitationseffekten. Diese Ergebnisse ermöglichen genauere Angaben über systematische und statistische Messfehler, sowie über Grenzwerte zwischen normalem und krankhaft verändertem Lungengewebe. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die bestehende diffusionsgewichtete Bildgebung methodisch zur Erfassung des kompletten Diffusionstensors von 3He in der Lunge weiterentwickelt. Dies war wichtig, da entlang der Luftwege weitestgehend freie Diffusion vorherrscht, während senkrecht zu den Luftwegen die Diffusion eingeschränkt ist. Mit Hilfe von Simulationsrech-nungen wurde der kritische Einfluss von Rauschen in den MRT-Bildern auf die Qualität der Messergebnisse untersucht. Diese neue Methodik wurde zunächst an einem Phantom beste-hend aus einem Bündel aus Glaskapillaren, deren innerer Durchmesser mit dem des mensch-lichen Azinus übereinstimmt, validiert. Es ergab sich eine gute Übereinstimmung zwischen theoretischen Berechnungen und experimentellen Ergebnissen. In ersten Messungen am Menschen konnten so unterschiedliche Anisotropiewerte zwischen lungengesunden Proban-den und Patienten gefunden werden. Es zeigte sich eine Tendenz zu isotroper Diffusion bei Patienten mit einem Lungenemphysem. Zusammenfassend tragen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zu einem besseren Ver-ständnis der ADC-Messmethode bei und helfen zukünftige Studien aufgrund des tieferen Verständnisses der die 3He Messung beeinflussenden Faktoren besser zu planen.

Genexpressionsanalyse der fötalen Wachstumsfuge des Rindes

Erkrankungen des Skelettapparats wie beispielsweise die Osteoporose oder Arthrose gehören neben den Herz-Kreislauferkrankungen und Tumoren zu den Häufigsten Erkrankungen des Menschen. Ein besseres Verständnis der Bildung und des Erhalts von Knochen- oder Knorpelgewebe ist deshalb von besonderer Bedeutung. Viele bisherige Ansätze zur Identifizierung hierfür relevanter Gene, deren Produkte und Interaktionen beruhen auf der Untersuchung pathologischer Situationen. Daher ist die Funktion vieler Gene nur im Zusammenhang mit Krankheiten beschrieben. Untersuchungen, die die Genaktivität bei der Normalentwicklung von knochen- und knorpelbildenden Geweben zum Ziel haben, sind dagegen weit weniger oft durchgeführt worden. rnEines der entwicklungsphysiologisch interessantesten Gewebe ist die Epiphysenfuge der Röhrenknochen. In dieser sogenannten Wachstumsfuge ist insbesondere beim fötalen Gewebe eine sehr hohe Aktivität derjenigen Gene zu erwarten, die an der Knochen- und Knorpelbildung beteiligt sind. In der vorliegenden Arbeit wurde daher aus der Epiphysenfuge von Kälberknochen RNA isoliert und eine cDNA-Bibliothek konstruiert. Von dieser wurden ca. 4000 Klone im Rahmen eines klassischen EST-Projekts sequenziert. Durch die Analyse konnte ein ungefähr 900 Gene umfassendes Expressionsprofil erstellt werden und viele Transkripte für Komponenten der regulatorischen und strukturbildenden Bestandteile der Knochen- und Knorpelentwicklung identifiziert werden. Neben den typischen Genen für Komponenten der Knochenentwicklung sind auch deutlich Bestandteile für embryonale Entwicklungsprozesse vertreten. Zu ersten gehören in erster Linie die Kollagene, allen voran Kollagen II alpha 1, das mit Abstand höchst exprimierte Gen in der fötalen Wachstumsfuge. Nach den ribosomalen Proteinen stellen die Kollagene mit ca. 10 % aller auswertbaren Sequenzen die zweitgrößte Gengruppe im erstellten Expressionsprofil dar. Proteoglykane und andere niedrig exprimierte regulatorische Elemente, wie Transkriptionsfaktoren, konnten im EST-Projekt aufgrund der geringen Abdeckung nur in sehr geringer Kopienzahl gefunden werden. Allerdings förderte die EST-Analyse mehrere interessante, bisher nicht bekannte Transkripte zutage, die detaillierter untersucht wurden. Dazu gehören Transkripte die, die dem LOC618319 zugeordnet werden konnten. Neben den bisher beschriebenen drei Exonbereichen konnte ein weiteres Exon im 3‘-UTR identifiziert werden. Im abgeleiteten Protein, das mindestens 121 AS lang ist, wurden ein Signalpeptid und eine Transmembrandomäne nachgewiesen. In Verbindung mit einer möglichen Glykosylierung ist das Genprodukt in die Gruppe der Proteoglykane einzuordnen. Leicht abweichend von den typischen Strukturen knochen- und knorpelspezifischer Proteoglykane ist eine mögliche Funktion dieses Genprodukts bei der Interaktion mit Integrinen und der Zell-Zellinteraktion, aber auch bei der Signaltransduktion denkbar. rnDie EST-Sequenzierungen von ca. 4000 cDNA-Klonen können aber in der Regel nur einen Bruchteil der möglichen Transkripte des untersuchten Gewebes abdecken. Mit den neuen Sequenziertechnologien des „Next Generation Sequencing“ bestehen völlig neue Möglichkeiten, komplette Transkriptome mit sehr hoher Abdeckung zu sequenzieren und zu analysieren. Zur Unterstützung der EST-Daten und zur deutlichen Verbreiterung der Datenbasis wurde das Transkriptom der bovinen fötalen Wachstumsfuge sowohl mit Hilfe der Roche-454/FLX- als auch der Illumina-Solexa-Technologie sequenziert. Bei der Auswertung der ca. 40000 454- und 75 Millionen Illumina-Sequenzen wurden Verfahren zur allgemeinen Handhabung, der Qualitätskontrolle, dem „Clustern“, der Annotation und quantitativen Auswertung von großen Mengen an Sequenzdaten etabliert. Beim Vergleich der Hochdurchsatz Blast-Analysen im klassischen „Read-Count“-Ansatz mit dem erstellten EST-Expressionsprofil konnten gute Überstimmungen gezeigt werden. Abweichungen zwischen den einzelnen Methoden konnten nicht in allen Fällen methodisch erklärt werden. In einigen Fällen sind Korrelationen zwischen Transkriptlänge und „Read“-Verteilung zu erkennen. Obwohl schon simple Methoden wie die Normierung auf RPKM („reads per kilo base transkript per million mappable reads“) eine Verbesserung der Interpretation ermöglichen, konnten messtechnisch durch die Art der Sequenzierung bedingte systematische Fehler nicht immer ausgeräumt werden. Besonders wichtig ist daher die geeignete Normalisierung der Daten beim Vergleich verschieden generierter Datensätze. rnDie hier diskutierten Ergebnisse aus den verschiedenen Analysen zeigen die neuen Sequenziertechnologien als gute Ergänzung und potentiellen Ersatz für etablierte Methoden zur Genexpressionsanalyse.rn