Molecular interaction of the human metalloprotease meprin beta with the amyloid precursor protein, ADAM10, and ADAM17 based on proteomics

Die Zinkendopeptidasen Meprin �� und �� sind Schl��sselkomponenten in patho(physiologischen) Prozessen wie Entz��ndung, Kollagenassemblierung und Angiogenese. Nach ihrer Entdeckung in murinen B��rstensaummembranen und humanen Darmepithelien, wurden weitere Expressionsorte identifiziert, z.B. Leukozyten, Krebszellen und die humane Haut. Tiermodelle, Zellkulturen und biochemische Analysen weisen auf Funktionen der Meprine in der Epithelialdifferenzierung, Zellmigration, Matrixmodellierung, Angiogenese, Bindegewebsausbildung und immunologische Prozesse hin. Dennoch sind ihre physiologischen Substrate weitgehend noch unbekannt. Massenspektrometrisch basierte Proteomics-Analysen enth��llten eine einzigartige Spaltspezifit��t f��r saure Aminos��urereste in der P1�� Position und identifizierten neue biologische Substratkandidaten. Unter den 269 extrazellul��ren Proteinen, die in einem Substratscreen identifiziert wurden, stellten sich das amyloid precursor protein (APP) and ADAM10 (a disintegrin and metalloprotease 10) als sehr vielversprechende Kandidaten heraus. Mehrere Schnittstellen innerhalb des APP Proteins, hervorgerufen durch verschiedenen Proteasen, haben unterschiedlichen Auswirkungen zur Folge. Die ��-Sekretase BACE (��-site APP cleaving enzyme) prozessiert APP an einer Schnittstelle, welche als initialer Schritt in der Entwicklung der Alzheimer Erkrankung gilt. Toxische A�� (Amyloid ��)-Peptide werden in den extrazellul��ren Raum freigesetzt und aggregieren dort zu senilen Plaques. Membran verankertes Meprin �� hat eine ��-Sekretase Aktivit��t, die in einem Zellkultur-basierten System best��tigt werden konnte. Die proteolytische Effizienz von Meprin �� wurde in FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)-Analysen bestimmt und war um den Faktor 104 h��her als die von BACE1. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass Meprin �� die ersten zwei Aminos��uren prozessiert und somit aminoterminal einen Glutamatrest freisetzt, welcher nachfolgend durch die Glutaminylzyklase in ein Pyroglutamat zykliert werden kann. Trunkierte A��-Peptide werden nur in Alzheimer Patienten generiert. Aufgrund einer erh��hten Hydrophobie weisen diese Peptide eine h��here Tendenz zur Aggregation auf und somit eine erh��hte Toxizit��t. Bis heute wurde keine Protease identifiziert, welche diese Schnittstelle prozessiert. Die Bildung der Meprin vermittelten N-terminalen APP Fragmenten wurde in vitro und in vivo detektiert. Diese N-APP Peptide hatten keine cytotoxischen Auswirkungen auf murine und humane Gehirnzellen, obwohl zuvor N-APP als Ligand f��r den death receptor (DR) 6 identifiziert wurde, der f��r axonale Degenerationsprozesse verantwortlich ist. rnIm nicht-amyloidogenen Weg prozessiert ADAM10 APP und entl��sst die Ektodom��ne von der Zellmembran. Wir konnten das ADAM10 Propeptid als Substrat von Meprin �� identifizieren und in FRET Analysen, in vitro und in vivo zeigen, dass die Meprin vermittelte Prozessierung zu einer erh��hten ADAM10 Aktivit��t f��hrt. Dar��ber hinaus wurde ADAM10 als Sheddase f��r Meprin �� identifiziert. Shedding konnte durch Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) oder durch das Ionophor A23187 hervorgerufen werden, sowie durch ADAM10 Inhibitoren blockiert werden. rnDiese Arbeit konnte somit ein komplexes proteolytisches Netwerk innerhalb der Neurophysiologie aufdecken, welches f��r die Entwicklung der Alzheimer Demenz wichtig sein kann.rn

Interactions of inhaled nanoparticles with the alveolar-capillary barrier of the human respiratory tract

In dieser Arbeit wurden zytotoxische Effekte sowie die inflammatorische Reaktionen des distalen respiratorischen Traktes nach Nanopartikelexposition untersucht. Besondere Aufmerksamkeit lag auch auf der Untersuchung unterschiedlicher zellul��rer Aufnahmewege von Nanopartikeln wie z.B. Clathrin- oder Caveolae-vermittelte Endozytose oder auch Clathrin- und Caveolae-unabh��ngige Endozytose (mit m��glicher Beteiligung von Flotillinen). Drei unterschiedliche Nanopartikel wurden hierbei gew��hlt: amorphes Silica (aSNP), Organosiloxan (AmorSil) und Poly(ethyleneimin) (PEI). Alle unterschiedlichen Materialien gewinnen zunehmend an Interesse f��r biomedizinische Forschungsrichtungen (drug and gene delivery). Insbesondere finden aSNPs auch in der Industrie vermehrt Anwendung, und stellen somit ein ernstzunehmendes Gesundheitsrisiko dar. Dieser wird dadurch zu einem begehrten Angriffsziel f��r pharmazeutische Verabreichungen von Medikamenten ��ber Nanopartikel als Vehikel aber bietet zugleich auch eine Angriffsfl��che f��r gesundheitssch��dliche Nanomaterialien. Aus diesem Grund sollten die gesundheitssch��digenden Risiken, sowie das Schicksal von zellul��r aufgenommenen NPs sorgf��ltig untersucht werden. In vivo Studien an der alveolaren-kapillaren Barriere sind recht umst��ndlich. Aus diesem Grund wurde in dieser Arbeit ein Kokulturmodel benutzt, dass die Alveolar-Kapillare Barrier in vivo nachstellt. Das Model besteht aus dem humanen Lungenepithelzelltyp (z.B. NCI H441) und einem humanen microvascul��ren Endothelzelltyp (z.B. ISO-HAS-1), die auf entgegengesetzten Seiten eines Transwell-Filters ausges��t werden und eine dichte Barriere ausbilden. Die NP Interaktion mit Zellen in Kokultur wurde mit denen in konventioneller Monokultur verglichen, in der Zellen 24h vor dem Experiment ausges��t werden. Diese Studie zeigt, dass nicht nur die polarisierte Eigenschaft der Zellen in Kokultur sondern auch die unmittelbare N��he von Epithel und Endothelzelle ausschlaggebend f��r durch aSNPs verursachte Effekte ist. Im Hinblick auf inflammatorische Marker (sICAM, IL-6, IL8-Aussch��ttung), reagiert die Kokultur auf aSNPs empfindlicher als die konventionelle Monokultur, wohingegen die Epithelzellen in der Kokultur auf zytotoxikologischer Ebene (LDH-Aussch��ttung) unempfindlicher auf aSNPs reagierten als die Zellen in Monokultur. Aufnahmestudien haben gezeigt, dass die Epithelzellen in Kokultur entschieden weniger NPs aufnehmen. Somit zeigen die H441 in der Kokultur ��hnliche epitheliale Eigenschaften einer sch��tzenden Barriere, wie sie auch in vivo zu finden sind. Obwohl eine ausreichende Aufnahme von NPs in H441 in Kokultur erreicht werden konnte, konnte ein Transport von NPs durch die epitheliale Schicht und eine Aufnahme in die endotheliale Schicht mit den gew��hlten Inkubationszeiten nicht gezeigt werden. Eine Clathrin- oder Caveolae-vermittelte Endozytose von NPs konnte mittels Immunfluoreszenz weder in der Mono- noch in der Kokultur nachgewiesen werden. Jedoch zeigte sich eine Akkumulation von NPs in Flotillin-1 und-2 enthaltende Vesikel in Epithelzellen aus beiden Kultursystemen. Ergebnisse mit Flotillin-inhibierten (siRNA) Epithelzellen, zeigten eine deutlich geringere Aufnahme von aSNPs. Zudem zeigte sich eine eine reduzierte Viabilit��t (MTS) von aSNP-behandelten Zellen. Dies deutet auf eine Beteiligung von Flotillinen an unbekannten (Clathrin oder Caveolae -unabh��ngig) Endozytosemechanismen und (oder) endosomaler Speicherung. Zusammenfassend waren die Aufnahmemechanismen f��r alle untesuchten NPs in konventioneller Monokultur und Kokultur vergleichbar, obwohl sich die Barriereeigenschaften deutlich unterscheiden. Diese Arbeit zeigt deutlich, dass sich die Zellen in Kokultur anders verhalten. Die Zellen erreichen hierbei einen h��heren Differenzierungsgrad und eine Zellkommunikation mit anderen relevanten Zelltypen wird erm��glicht. Durch das Einbringen eines dritten relevanten Zelltyps in die Kokultur, des Alveolarmakrophagen (Zelllinie THP-1), welcher die erste Verteidigungsfront im Alveolus bildet, wird diese Aussage weiter bekr��ftigt. Erste Versuche haben gezeigt, dass die Triplekultur bez��glich ihrer Barriereeigenschaften und IL-8-Aussch��ttung sensitiver auf z.B. TNF-��� oder LPS-Stimulation reagiert als die Kokultur. Verglichen mit konventionellen Monokulturen imitieren gut ausgebildete, multizellur��re Kokulturmodelle viel pr��ziser das zellul��re Zusammenspiel im K��rper. Darum liefern Nanopartikelinteraktionen mit dem in vitro-Triplekulturmodel aufschlussreichere Ergebnisse bez��glich umweltbedingter oder pharmazeutischer NP-Exposition in der distalen Lung als es uns bisher m��glich war.

In vivo and in vitro investigation of the tissue-specific activity of the human CYP3A4 and CYP3A5 promoters

The human cytochrome P450 3A4 (CYP3A4), the predominant but variably expressed cytochrome P450 in adult liver and small intestine is involved in the metabolism of over 50% of currently used drugs. Its paralog CYP3A5 plays a crucial role in the disposition of several drugs with low therapeutic index, including tacrolimus. Limited information is available for the CYP3A5 transcriptional regulation and its induction by xenobiotics remains controversial. In the first part of this study, we analysed the CYP3A5 transcriptional regulation and its induction by xenobiotics in vivo using transgenic mice. To this end, two transgenic strains were established by pronuclear injection of a plasmid, expressing firefly luciferase driven by a 6.2 kb of the human CYP3A5 promoter. A detailed analysis of both strains shows a tissue distribution largely reflecting that of CYP3A5 transcripts in humans. Thus, the highest luciferase activity was detected in the small intestine, followed by oesophagus, testis, lung, adrenal gland, ovary, prostate and kidney. However, no activity was observed in the liver. CYP3A5-luc transgenic mice were similarly induced in both sexes with either PCN or TCPOBOP in small intestine in a dose-dependent manner. Thus, the 6.2 kb upstream promoter of CYP3A5 mediates the broad tissue activity in transgenic mice. CYP3A5 promoter is inducible in the small intestine in vivo, which may contribute to the variable expression of CYP3A in this organ. rnThe hepato-intestinal level of the detoxifying oxidases CYP3A4 and CYP3A5 is adjusted to the xenobiotic exposure mainly via the xenosensor and transcriptional factor PXR. CYP3A5 is additionally expressed in several other organs lacking PXR, including kidney. In the second part of this study, we investigated the mechanism of the differential expression of CYP3A5 and CYP3A4 and its evolutionary origin using renal and intestinal cells, and comparative genomics. For this examination, we established a two-cell line models reflecting the expression relationships of CYP3A4 and CYP3A5 in the kidney and small intestine in vivo. Our data demonstrate that the CYP3A5 expression in renal cells was enabled by the loss of a suppressing Yin Yang 1 (YY1)-binding site from the CYP3A5 promoter. This allowed for a renal CYP3A5 expression in a PXR-independent manner. The YY1 element is retained in the CYP3A4 gene, leading to its suppression, perhaps via interference with the NF1 activity in renal cells. In intestinal cells, the inhibition of CYP3A4 expression by YY1 is abrogated by a combined activating effect of PXR and NF1 acting on their respective response elements located adjacent to the YY1-binding site on CYP3A4 proximal promoter. CYP3A4 expression is further facilitated by a point mutation attenuating the suppressing effect of YY1 binding site. The differential expression of CYP3A4 and CYP3A5 in these organs results from the loss of the YY1 binding element from the CYP3A5 promoter, acting in concert with the differential organ expression of PXR, and with the higher accumulation of PXR response elements in CYP3A4. rn