Conditional and transgenic mouse models as tools to study the role of TGFbeta, BMP signaling in skeletal development

Die TGFbeta/BMP Signaltransduktionskaskade ist wichtig für viele Entwicklungsprozesse fast aller embryonaler sowie extraembryonaler Gewebe und sie ist ebenso essentiell bei der Aufrechterhaltung der Homöostase im adulten Organismus. In vielen Mausmodellen und Zellkulturversuchen wurde gezeigt, dass Liganden dieses Signalweges in verschiedene Stadien der Knorpel- und Knochenentwicklung involviert sind. BMPs sind beispielsweise maßgeblich an der frühen Kondensation und Bildung des Knorpels und später an Proliferation und Hypertrophie der Chondrozyten beteiligt. BMPs können ektopisch Knochenbildung auslösen und das Expressionsmuster der Liganden und spezifischen Rezeptoren in der Wachstumsfuge lässt auf eine wichtige Rolle der BMPs in der Wachstumsfuge schließen. Der gezielte knock out der BMP-Rezeptoren Bmpr1a und Bmpr1b in proliferierenden Chondrozyten führt zur Ausbildung einer generellen Chondrodysplasie. Smad1, Smad5 und Smad8 sind die Mediatoren der BMP-Signalkaskade. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte die Rolle und Funktion der Smad1- und Smad5-Proteine in der Wachstumsfuge untersucht werden. Hierzu wurden konditionale Smad1-knock out-Mäuse mit einer transgenen Mauslinie gekreuzt, die die Cre-Rekombinase spezifisch in proliferierenden Chondrozyten exprimiert. Diese Mäuse wurden mit und ohne heterozygotem Smad5-Hintergrund charakterisiert. Bei einem knock out von Smad1 allein konnte ein leichte Verkürzung der Wachstumsfuge beobachtet werden, wobei prähypertrophe und hypertrophe Zone gleichermaßen betroffen waren. Dieser Phänotyp war verstärkt in Mäusen mit zusätzlichem heterozygotem Smad5-Hintergrund. Eine Verringerung der Proliferationsrate konnte zusammen mit einer verminderten Ihh-Expression nachgewiesen werden. Zusätzlich konnte anhand von Röntgenaufnahmen eine Dysorganisation der nasalen Region und ein fehlendes nasales Septum beobachtet werden. Produktion und Mineralisation der extrazellulären Matrix waren nicht beeinträchtigt. Um die Rolle der BMP- und TGFbeta-Signalkaskaden während der endochondralen Ossifikation zu vergleichen, wurden transgene Mäuse generiert, in denen die TGFbeta-Signalkaskade spezifisch in proliferierenden Chondrozyten gestört war. Zwei Mauslinien, die ähnliche Phänotypen zeigten, wurden untersucht. Esl1 ist ein TGFbeta-bindendes Protein, von dem man annimmt, dass es die TGFbeta-Signalkaskade inhibieren kann. Esl1-knock out-Mäuse sind kleiner als Wildtypmäuse und die Überexpression von Esl1 in proliferierenden Chondrozyten führt zu einer Verlängerung der Wachstumsfuge und einer verstärkten Proliferationsrate. Knorpelmarker, wie Col2a1 und Sox9 sind in diesen Mäusen herunterreguliert, während Col10a1 und Ihh als Marker für die hypertrophe und prähypertrophe Zone herunterreguliert waren. Dies führt zu der Annahme, dass mehr Zellen in die terminale Differenzierung eintreten. Bei transgenen Mäusen, in denen ein dominant-negativer (dn) TGFbeta-Rezeptor in proliferierenden Chondrozyten überexprimiert wurde, konnte eine verlängerte prähypertrophe Zone, eine erhöhte Ihh-Expression, sowie eine verstärkte Proliferationsrate beobachtet werden. Zusätzlich konnte in homozygoten Tieren ein craniofacialer Phänotyp beschrieben werden, der zu Problemen bei der Nahrungsaufnahme und damit zu einer starken Wachstumsbeeinträchtigung führte. Die BMP- und TGFbeta-Signalkaskaden haben möglicherweise antagonistische Effekte in der Wachstumsfuge. Während der Ausfall von BMP in proliferierenden Chondrozyten aufgrund einer gesunkenen Proliferationsrate zu einer Verkürzung der Wachstumsfuge führte, kann man in Mäusen mit einer Störung der TGFbeta-Signalkaskade eine verstärkte Proliferation in einer daher verlängerten Wachstumsfuge beobachten. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die Generation einer transgenen Mauslinie, die die Cre-Rekombinase spezifisch in hypertrophen Chondrozyten exprimiert. Promoterstudien mit transgenen Mäusen weisen darauf hin, dass ein putatives AP1-Element, etwa 4 kb vor dem ersten Exon des Col10a1 gelegen, wichtig für die spezifische Expression in hypertrophen Chondrozyten ist. Ein Konstrukt, dass vier Kopien dieses Elements und den basalen Promoter enthält, wurde benutzt, um die Cre-Rekombinase spezifisch zu exprimieren. Diese Mauslinie befindet sich in der Testphase und erste Daten deuten auf eine spezifische Expression der Cre-Rekombinase in hypertrophen Chondrozyten hin.

Sedimentary environments and climate change: a case study (late Miocene, central Crete)

In this study, conditions of deposition and stratigraphical architecture of Neogene (Tortonian, 11-6,7Ma) sediments of southern central Crete were analysed. In order to improve resolution of paleoclimatic data, new methods were applied to quantify environmental parameters and to increase the chronostratigraphic resolution in shallow water sediments. A relationship between paleoenvironmental change observed on Crete and global processes was established and a depositional model was developed. Based on a detailed analysis of the distribution of non geniculate coralline red algae, index values for water temperature and water depth were established and tested with the distribution patterns of benthic foraminifera and symbiont-bearing corals. Calcite shelled bivalves were sampled from the Algarve coast (southern Portugal) and central Crete and then 87Sr/86Sr was measured. A high resolution chronostratigraphy was developed based on the correlation between fluctuations in Sr ratios in the measured sections and in a late Miocene global seawater Sr isotope reference curve. Applying this method, a time frame was established to compare paleoenvironmental data from southern central Crete with global information on climate change reflected in oxygen isotope data. The comparison between paleotemperature data based on red algae and global oxygen isotope data showed that the employed index values reflect global change in temperature. Data indicate a warm interval during earliest Tortonian, a second short warm interval between 10 and 9,5Ma, a longer climatic optimum between 9 and 8Ma and an interval of increasing temperatures in the latest Tortonian. The distribution of coral reefs and carpets shows that during the warm intervals, the depositional environment became tropical while temperate climates prevailed during the cold interval. Since relative tectonic movements after initial half-graben formation in the early Tortonian were low in southern central Crete, sedimentary successions strongly respond to global sea-level fluctuation. A characteristic sedimentary succession formed during a 3rd order sea-level cycle: It comprises mixed siliciclastic-limestone deposited during sea-level fall and lowstand, homogenous red algal deposits formed during sea-level rise and coral carpets formed during late rise and highstand. Individual beds in the succession reflect glacioeustatic fluctuations that are most prominent in the mixed siliciclastic-limestone interval. These results confirm the fact that sedimentary successions deposited at the critical threshold between temperate and tropical environments develop characteristic changes in depositional systems and biotic associations that can be used to assemble paleoclimatic datasets.

Tetracycline-inducible RNAi Knockdown of SCL (Stem Cell Leukaemia) in Mice

RNAi (RNA interference) is a powerful technology for sequence-specific targeting of mRNAs. This thesis was aimed at establishing conditions for conditional RNAi-mediated silencing first in vitro and subsequently also in transgenic mice. As a target the basic helix-loop-helix transcription factor encoding gene SCL (stem cell leukaemia also known as Tal-1 or TCL5) was used. SCL is a key regulator for haematopoietic development and ectopic expression of SCL is correlated with acute T-lymphoblastic leukaemias. Loss of SCL function studies demonstrated that ab initio deletion of SCL resulted in embryonic lethality around day E9 in gestation. To be able to conditionally inactivate SCL, RNAi technology was combined with the tetracycline-dependent regulatory system. This strategy allowed to exogenously control the induction of RNAi in a reversible fashion and consequently the generation of a completely switchable RNAi knockdown. First a suitable vector allowing for co-expression of tetracycline-controlled shRNAs (small hairpin RNAs) and constitutively active EGFP (enhanced green fluorescent protein) was generated. This novel vector, pRNAi-EGFP, was then evaluated for EGFP expression and tetracycline-mediated expression of shRNAs. Four sequences targeting different regions within the SCL mRNA were tested for their efficiency to specifically knockdown SCL. These experiments were performed in M1 murine leukaemia cells and subsequently in the HEK 293 cell line, expressing an engineered HA-tagged SCL protein. The second assay provided a solid experimental method for determining the efficiency of different SCL-siRNA knockdown constructs in tissue culture. Western blotting analyses revealed a down regulation of SCL protein for all four tested SCL-specific target sequences albeit with different knockdown efficiencies (between 25% and 100%). Furthermore, stringent tetracycline-dependent switchability of shRNA expression was confirmed by co-transfecting the SCL-specific pRNAi-EGFP vector (SCL-siRNA) together with the HA-tagged SCL expression plasmid into the HEK 293TR /T-REx cell line constitutively expressing the tetracycline repressor (TetR). These series of experiments demonstrated tight regulation of siRNA expression without background activity. To be able to control the SCL knockdown in vivo and especially to circumvent any possible embryonic lethality a transgenic mouse line with general expression of a tetracycline repressor was needed. Two alternative methods were used to generate TetR mice. The first approach was to co-inject the tetracycline-regulated RNAi vector together with a commercially available and here specifically modified T-REx expression vector (SCL-siRNA T-REx FRT LoxP mouse line). The second method involved the generation of a TetR expressor mouse line, which was then used for donating TetR-positive oocytes for pronuclear injection of the RNAi vector (SCL-siRNA T-REx mouse line). As expected, and in agreement with data from conditional Cre-controlled adult SCL knockout mice, post-transcriptional silencing of SCL by RNAi caused a shift in the maturation of red blood cell populations. This was shown in the bone marrow and peripheral blood by FACS analysis with the red blood cell-specific TER119 and CD71 markers which can be used to define erythrocyte differentiation (Lodish plot technique). In conclusion this study established conditions for effective SCL RNAi-mediated silencing in vitro and in vivo providing an important tool for further investigations into the role of SCL and, more generally, of its in vivo function in haematopoiesis and leukaemia. Most importantly, the here acquired knowledge will now allow the establishment of other completely conditional and reversible knockdown phenotypes in mice.

Compliance lebertransplantierter Patienten mit dem Immunsuppressivum Tacrolimus bei 2x täglicher im Vergleich zu 1x täglicher Einnahme

Compliance lebertransplantierter Patienten mit der immunsuppressiven Therapie ist unerlässlich für den lang-fristigen Erfolg der Lebertransplantation. Aus Non-Compliance mit der immunsuppressiven Therapie können Abstoßungsreaktionen, Organverlust oder sogar Tod resultieren. Hauptziel der vorliegenden Studie war die erstmalige Evaluation der Compliance bei Einnahme von Prograf® (zweimal tägliche Einnahme von Tacrolimus) im Vergleich zur Einnahme von Advagraf® (einmal tägliche Einnahme von Tacrolimus). Von Interesse war außerdem die Fragestellung, ob sich die Compliance bezüglich der immunsuppressiven Therapie mit dem Zeitabstand zur Transplantation verändert. rnDie Compliancemessung wurde offen mittels MEMS® (Aardex Ltd., Schweiz) durchgeführt, der Patient war also über die Compliancekontrolle informiert. Mittels MEMS® konnten Datum und Uhrzeit der Dosisentnahme dokumentiert und damit zuverlässig das gesamte Compliancemuster über im Durchschnitt 176 Tage mit der zweimal täglichen Einnahme und 188 Tage mit der einmal täglichen Einnahme pro Patient erfasst werden. 65 Patienten mit dem Basisimmunsuppressivum Prograf® wurden in die prospektive, nicht-interventionelle Studie eingeschlossen und nach Per Protokoll-Analyse konnten die Daten von 63 in Mainz lebertransplantierten Patienten ausgewertet werden (Prograf®: Gruppe 1: 15 Patienten (Pat.), Gruppe 2: 23 Pat., Gruppe 3: 22 Pat., Drop-outs: 3 Pat.; Advagraf®: Gruppe 1: 16 Pat., Gruppe 2: 23 Pat., Gruppe 3: 23 Pat., Drop-outs: 1 Pat.). Die Dosing Compliance (DC), definiert als Prozent der Tage, an denen der MEMS®-Behälter korrekt geöffnet und die Dosis höchstwahrscheinlich korrekt eingenommen wurde, war der primäre Zielparameter. Weitere Methoden der Compliancemessung, wie der Pill Count, mehrere Fragebögen (Selbsteinschätzung, Patientenwissen-, Morisky-, MESI-, HADS-, SF-36- und Patientenzufriedenheit-Fragebogen) sowie die Blutspiegelmessung wurden eingesetzt, um die Compliance der Patienten umfassend charakterisieren zu können. rnDer Median der DC mit der zweimal täglichen Einnahme betrug 97% bei Pat. > 6 m.p.t. < 2 y.p.t., 97% bei Pat. > 2 y.p.t. < 5 y.p.t. und 98% bei Pat. > 5 y.p.t. (p=0,931; Kruskal-Wallis-Test). Der Median der DC von Tacroli-mus bei einmal täglicher Einnahme (Advagraf®) betrug 99% bei Pat. > 6 m.p.t. < 2 y.p.t., 98% bei Pat. > 2 y.p.t. < 5 y.p.t. und 97% bei Pat. > 5 y.p.t. (p=0,158; Kruskal-Wallis-Test). Insgesamt zeigten die Patienten während des gesamten Beobachtungszeitraums von 12 Monaten eine gute Compliance für die Einnahme ihres Immun-suppressivums. Die Timing Compliance (TiC)-raten lagen auf einem niedrigeren Niveau als die Dosing- und Taking Compliance (TC)-raten. Die Complianceraten der drei Subgruppen unterschieden sich nicht signifikant. Die Patienten mit dem geringsten Abstand zur Transplantation zeigten bei beinahe allen Messmethoden die höchste Compliance im Gegensatz zur etwas geringeren Compliance der Patienten mit größerem Abstand zur Transplantation. Die während der Advagraf®-Phase mittels MEMS® gemessenen DC-, TC- und TiC-raten fielen höher aus als bei Einnahme von Prograf® (p(DC)=0,003; p(TC)=0,077; p(TiC)=0,003; Wilcoxon Vorzeichen-Rang-Test). Dieses Ergebnis untermauert die in anderen Indikationen gefundene Complianceverbesserung durch die einmal tägliche Arzneimittelgabe im Vergleich zur zweimal täglichen Gabe. Die Auswertung der Drug Holidays ergab für die Advagraf®-Phase hingegen niedrigere Complianceraten als für die Prograf®-Phase. Dieses Ergebnis ist auf die Definition des Drug Holidays (keine Arzneimitteleinnahme über 48 h) zurück zu führen. Die Chance Advagraf® einmal pro Tag zu vergessen ist doppelt so hoch, als Prograf® dreimal aufeinander fol-gend zu vergessen. Mit einer verhältnismäßigeren Definition von Drug Holidays (Einnahmepause von 72 Stun-den bei einmal täglicher Einnahme von Advagraf® entsprechend drei ausgelassenen Dosen von Prograf®) ist die Compliancerate 81%. Die Ergebnisse des Pill Counts waren sowohl bei Einnahme von Prograf® als auch von Advagraf® mit der jeweils gemessenen TC vergleichbar, was die Zuverlässigkeit der Messergebnisse bes-tätigt. rnDie zusätzlich eingesetzten Methoden verifizierten das Ergebnis der höheren Compliance mit der einmal tägli-chen Einnahme. Die während der Advagraf®-Phase beantworteten Fragebögen zeigten einen Trend zu besserer Compliance und Lebensqualität. Lediglich die Ergebnisse des MESI-Fragebogens und der Blutspiegelmessungen wichen sowohl während der Prograf®- als auch während der Advagraf®-Phase stark von den Ergebnis-sen der anderen Methoden ab. rnUnter Einbeziehung aller mittels MEMS® und Pill Count objektiv gemessenen Complianceparameter konnten während der Prograf®-Einnahme 54 von 60 Pat. (90%) und während der Advagraf®-Phase 59 von 62 Pat. (95%) als compliant eingestuft werden. Aufgrund subjektiver Compliancemessungen waren 49 von 58 Pat. (84%) während der Prograf®- und 54 von 59 Pat. (92%) während der Advagraf®-Phase als compliant einzustufen. Es wurde beobachtet, dass die zeitlich korrekte Einnahme der Morgendosis einfacher und bei Einmalgabe zu bevorzugen ist. Die wochentagsbezogene Auswertung ergab erwartungsgemäß, dass am Wochenende (Samstag und Sonntag) am häufigsten Dosen ausgelassen wurden. rnDie Umstellung von Prograf® auf Advagraf® stellte kein Problem dar. Beinahe alle Patienten waren dankbar und zufrieden mit der Reduzierung der Dosierungsfrequenz und der größeren Unabhängigkeit durch die entfallene abendliche Einnahme. Der positive Einfluss der geringeren Dosierungshäufigkeit auf die Langzeitcompliance der Patienten, ist ein hinreichender Grund die Entwicklung von Formulierungen zur einmal täglichen Ein-nahme für weitere Immunsuppressiva zu fordern. Insbesondere bei den häufig eingesetzten Kombinationstherapien von Immunsuppressiva würde der Effekt der Complianceverbesserung noch verstärkt werden, wenn alle eingesetzten Immunsuppressiva zur einmal täglichen Gabe geeignet wären.