GM-CSF (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor): Modulation der durch UV-B-Strahlung induzierten Hautkarzinogenese

UV-B-Strahlung, die durch die fortschreitende Zerstörung der Ozonschicht zunimmt, ist hauptsächlich für das Entstehen von Basaliomen und Plattenepithelkarzinomen verantwort-lich, an denen jedes Jahr etwa 2-3 Millionen Menschen weltweit erkranken. UV-B indu-zierte Hautkarzinogenese ist ein komplexer Prozess, bei dem vor allem die mutagenen und immunsuppressiven Wirkungen der UV-B-Strahlung von Bedeutung sind. Die Rolle von GM-CSF in der Hautkarzinogenese ist dabei widersprüchlich. Aus diesem Grund wurde die Funktion von GM-CSF in vivo in der UV-B induzierten Hautkarzinogenese mittels zwei bereits etablierter Mauslinien untersucht: Erstens transgene Mäuse, die einen GM-CSF Antagonisten unter der Kontrolle des Keratin-10-Promotors in den suprabasalen Schichten der Epidermis exprimieren und zweitens solche, die unter dem Keratin-5-Promotor murines GM-CSF in der Basalschicht der Epidermis überexprimieren. Eine Gruppe von Tieren wurde chronisch, die andere akut bestrahlt. Die konstitutionelle Verfassung der Tiere mit erhöhter GM-CSF-Aktivität in der Haut war nach chronischer UV-B-Bestrahlung insgesamt sehr schlecht. Sie wiesen deshalb eine stark erhöhte Mortali-tät auf. Dies ist sowohl auf die hohe Inzidenz als auch dem frühen Auftreten der benignen und malignen Läsionen zurückzuführen. Eine verminderte GM-CSF Aktivität verzögerte dagegen die Karzinomentwicklung und erhöhte die Überlebensrate leicht. GM-CSF wirkt auf verschiedenen Ebenen tumorpromovierend: Erstens erhöht eine gesteigerte Mastzell-anzahl in der Haut der GM-CSF überexprimierenden Tiere per se die Suszeptibilität für Hautkarzinogenese. Zweitens stimuliert GM-CSF die Keratinozytenproliferation. Dadurch kommt es nach UV-B-Bestrahlung zu einer prolongierten epidermalen Hyperproliferation, die zur endogenen Tumorpromotion beiträgt, indem sie die Bildung von Neoplasien unter-stützt. Der Antagonist verzögert dagegen den Proliferationsbeginn, die Keratinozyten blei-ben demzufolge länger in der G1-Phase und der durch UV-B verursachte DNA-Schaden kann effizienter repariert werden. Drittens kann GM-CSF die LCs nicht als APCs aktivie-ren und eine Antitumorimmunität induzieren, da UV-B-Strahlung zur Apoptose von LCs bzw. zu deren Migration in Richtung Lymphknoten führt. Zusätzlich entwickeln GM-CSF überexprimierende Tiere in ihrer Haut nach UV-B-Bestrahlung ein Millieu von antago-nistisch wirkenden Zytokinen, wie TNF-a, TGF-b1 und IL-12p40 und GM-CSF, die proinflammatorische Prozesse und somit die Karzinomentwicklung begünstigen. Der Anta-gonist hemmt nach UV-B-Bestrahlung die Ausschüttung sowohl von immunsuppressiven Zytokinen, wie etwa TNF-a, als auch solchen, die die Th2-Entwicklung unterstützen, wie etwa IL-10 und IL-4. Dies wirkt sich negativ auf die Karzinomentwicklung aus.

Ein neues Lumineszenzverfahren zur quantitativen und räumlichen Darstellung von Produkten des Glukosestoffwechsels in Tumoren

Eine neue auf einer Pyruvat abhängigen Biolumineszenzreaktion basierende Methode zur quantitativen Bestimmung und räumlichen Darstellung von Pyruvat in Gefrierschnitten von Gewebeproben wurde entwickelt. Dabei wurden biochemische Reaktionen so verknüpft, dass sichtbares Licht proportional zum eingesetzten Pyruvatgehalt entstand. Eine hoch signifikante positive Korrelation beider Parameter ermöglichte eine Kalibrierung mit definierten Pyruvatgehalten und damit die Quantifizierung in unbekannten Proben. Die Nachweisgrenze lag bei 0,04 pmol Pyruvat mit einer Auflösung von 0,02 µmol/g. Das Biolumineszenzverfahren wurde mit Hilfe anderer Methoden validiert, wobei eine Wiederfindung mit einer konzentrationsabhängigen Abweichung von ≤ 15 % erzielt wurde. Ein wesentlicher Vorteil der neuen Methode gegenüber bisherigen Verfahren zum Pyruvatnachweis liegt in der Messwerterfassung definierter histologischer Gewebsareale. Dies wird durch computergesteuerte Überlagerung von Metabolitverteilungen mit Schnittbildern aus Strukturfärbungen und interaktiver, „optischer Mikrodissektion“ der Gewebeschnitte möglich. Ein weiterer Nutzen der Methode ist deren optionale Kombination mit der Biolumineszenztechnik für andere Stoffwechselprodukte. So ermöglicht eine exakte Superposition zweier Metabolitbilder von unmittelbar aufeinander folgenden Gewebeschnitten eine korrelative Kolokalisationsanalyse beider Metabolite. Das Ergebnis lässt sich zum einen in Form von „Pixel-zu-Pixel“-Korrelationen dokumentieren, zum anderen kann für jeden Bildpunkt ein Laktat/Pyruvat-Verhältnis als Maß für den Redoxzustand des Gewebes berechnet und dargestellt werden. Hieraus ergeben sich z.B. räumliche L/P-Verteilungen (L/P-Karten). Ein solches „Redoximaging“ durch Kartierung des L/P-Quotienten ist bislang mit keinem anderen Verfahren möglich. Während die Entwicklung des Pyruvatnachweises eine Kernaufgabe der vorliegenden Arbeit darstellte, bestand ein weiterer wesentlicher Teil in der praktischen Anwendung der neuen Methode im Bereich der experimentellen Tumorforschung. So ergaben Messungen an acht verschiedenen Linien von humanen HNSCC-Xenotransplantaten (n = 70 Tumoren) einen mittleren Pyruvatgehalt von 1,24 ± 0,20 µmol/g. In sechs Humanbiopsien derselben Tumorentität wurde ein durchschnittlicher Pyruvatgehalt von 0,41 ± 0,09 µmol/g gemessen. Bei den Xenotransplantaten konnte eine signifikante positive Korrelation zwischen der Summe aus Laktat und Pyruvat bzw. dem L/P Verhältnis und der Strahlensensibilität gefunden werden, wobei das L/P-Verhältnis ebenso wie die Summe aus Laktat und Pyruvat maßgeblich von Laktat bestimmt wurden. Der Zusammenhang der Metabolite mit der Strahlensensibilität lässt sich durch deren antioxidative Eigenschaften erklären. Da der Redoxzustand der Zelle kritisch bezüglich der Effizienz von ROS induzierenden Therapieansätzen, wie z.B. Bestrahlung oder bestimmter Chemotherapeutika sein kann, könnte die Bestimmung des L/P Verhältnisses als prognostischer Faktor prädiktive Aussagen über die Sensibilität gegenüber solchen Behandlungen erlauben.

Entwicklung eines pharmakologischen Modells zur Prüfung immuntherapeutischer Antikörper mit dreidimensionalen Tumorzellkulturen in vitro

In den letzten Jahren hat die Tumorbehandlung mit immunologischen Präparaten an Bedeutung gewonnen. Der allgemeine Ablauf der Testung eines Arzneimittelkandidaten sieht vor, zunächst in Zellkulturversuchen und Tierversuchen Wirkweise und Sicherheit, sowie voraussichtliche Abbauwege und mögliche Gefahren so beurteilen zu können, dass sie für einen Einsatz im Menschen in Frage kommen. Zur präklinischen in vitro-Testung werden dabei in der Regel Monolayer-Zellkulturen oder Einzelzellsuspensionen eingesetzt. Der Einsatz von 3D-Zellkulturmodellen, welche den Aufbau von Mikrometastasen oder intervaskuläre Areale in Tumoren exakter widerspiegeln, führt zu wesentlich besseren Voraussagen bezüglich der klinischen Wirksamkeit neuer Präparate. Das Ziel dieser Arbeit war daher die Entwicklung und Anwendung eines neuen 3D-Zellkulturbasierten Systems zur Testung trifunktionaler bispezifischer Antikörper für die Tumorbehandlung, welches sich auch auf andere vergleichbare Präparate übertragen lässt.rnIn meiner Arbeit konnte ich mehrere humane Tumorzelllinien definieren, mit denen es gelang, stabile Co-Kulturen von Multi Cellular Tumour Spheroids (MCTS) mit Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC) in miniaturisierten Spinner-Flaschen zu etablieren. Spinner-Flaschen, in denen die im Kulturmedium befindlichen Immunzellen, MCTS und Therapeutika ständig frei zirkulieren, sind besonders für eine wirklichkeitsnahe Nachbildung der in vivo-Simulation mit disseminierten Tumorzellen oder mit malignem Aszites geeignet. Diese Art der Kultivierung erlaubte Beobachtungszeiten von ≥20 Tagen für eine große Bandbreite Analysemethoden. Zu den mit dem erstellten Protokoll standardmäßig durchführbaren Analysemethoden zählen unter anderem immunhistochemische Färbungen an Sphäroid-Gefrierschnitten, Vitalitätstest, Untersuchung der Plattierungs-Effizienz, Bestimmung der Sphäroidvolumina, Zytokinbestimmungen aus dem Medienüberstand mit Cytokine Bead Arrays, PCR-Analysen immunzellspezifischer Antigene, sowie durchflusszytometrische Analysen. Diese Methodenkombination erlaubt einen sehr detaillierten Einblick in die Wirkweise und Effizienz neuer Immuntherapeutika aus verschiedensten Blickwinkeln und stellt ein reproduzierbares Testsystem zur präklinischen Testung von Immuntherapeutika dar, das zukünftig als Bindeglied zwischen Monolayer-Zellkulturen und klinischen Prüfungen einen festen Platz einnehmen könnte.rnMit dem beschriebenen 3D-Zellkultur-System wurden in der vorliegenden Arbeit die trifunktionalen bispezifischen Antikörper catumaxomab (unter dem Handelsnamen Removab® für die Behandlung maligner Ascites zugelassen) und ertumaxomab (derzeit in klinischen Prüfungen) hinsichtlich ihrer Wirkweise untersucht. Die Antikörper besitzen im Gegensatz zu herkömmlichen monoklonalen Antikörpern zwei verschiedene Bindungsarme, einer gegen CD3 auf T-Zellen, der zweite gegen EpCAM respektive Her2/neu - beides weit verbreitete Tumorantigene - gerichtet. An ihrem Fc-Teil besitzen sie eine dritte Bindungskapazität, über welche sie an Fcγ RI, -IIa und -III positive akzessorische Zellen binden. Diese Kombination ermöglicht theoretisch die Ausbildung eines Tri-Zell-Komplexes aus T-Zelle, Tumorzelle und akzessorischer Zelle. Dies stellt eine wirkungsvolle Therapieoption unter Ausnutzung der körpereigenen, immunologischen Abwehr dar. rnIm Rahmen dieser Arbeit wurde gezeigt, dass beide Antikörper eine Größenreduktion der Sphäroide mit den entsprechenden Tumorantigenen in gleichem Maße bewirkten und die Plattierungseffizienz durch ertumaxomab dosisabhängig reduziert wurde. Mit dem erstellten Testsystem konnte der Wirkmechanismus von catumaxomab auf Sphäroide der Zelllinie FaDu (Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinom) detaillierter gezeigt werden: catumaxomab wirkte dosisabhängig auf die Reduktion der Sphäroidvolumina und die zunehmende Infiltration von CD45+ Zellen, die als T-, NK- und/oder dendritische Zellen identifiziert wurden. Des Weiteren rief die catumaxomab-Gabe eine verstärkte Ausschüttung der Zytokine IL-2, IFN-γ und TNF-α hervor. Diese Ergebnisse sprechen dafür, dass catumaxomab die zelluläre Immunantwort aktiviert.rnDie Standard-Tumorbehandlung beinhaltet die Gabe von Chemotherapeutika. Oft werden dafür Zytostatika mit dem unerwünschten Nebeneffekt auch gesunde proliferierende Zellen anzugreifen verwendet. Dies kann prinzipiell auch die Wirksamkeit der Antikörper-Therapie beeinflussen. Aus diesem Grund wurden in dieser Arbeit zusätzlich vergleichende Kombinations-Versuche mit catumaxomab und einem gängigen Zytostatikum - Cisplatin - durchgeführt. Mit Untersuchungen der Sphäroidvolumina, Vitalitätstests und Plattierungseffizienz konnte gezeigt werden, dass die Wirkung von catumaxomab bei gleichzeitiger Anwendung beider Therapeutika aufrecht erhalten bleibt und diese sogar additiv verstärkt wird. Eine Kombinationstherapie im Menschen ist daher denkbar.rnrn

Das Phosphoproteom von Plattenepithelkarzinomen des Kopf-Hals-Bereichs nach Bestrahlung und Applikation des Cyclooxygenase-Inhibitors Flurbiprofen

Ziel: Die Radiotherapie hat in der Behandlung von Plattenepithelkarzinomen des Kopf- und Halsbereichs nach wie vor einen hohen Stellenwert. Der Erfolg eines Therapieregimes, das die Behandlung mit ionisierenden Strahlen einschließt, ist jedoch häufig limitiert durch die Entwicklung radioresistenter Tumorzellpopulationen, die nicht selten durch die Bestrahlung selbst induziert wird. Die Mechanismen, die zu einer solchen bestrahlungsinduzierten Radioresistenz führen sind bisher nur unvollständig verstanden und Methoden, durch die die Entwicklung von Radioresistenz verhindert werden könnte, wie beispielsweise der präventive Einsatz von Pharmazeutika, sind bislang nicht systematisch untersucht. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es zu überprüfen, ob der Cyclooxygenase-Inhibitor Flurbiprofen durch Bestrahlung induzierte Veränderungen der Phosphoprotein-Expression verstärken oder abschwächen kann und ob sich aus solchen Modifikationen des Bestrahlungsergebnisses ein radioprotektiver Effekt der Flurbiprofenapplikation ableiten lässt. Methoden: Es wurde ein experimenteller Ansatz gewählt, der mittels 2D PAGE und anschließender MALDI-TOF Massenspektrometrie das Phosphoproteom einer HNSCC-Zelllinie unter verschiedenen Bedingungen untersuchte. Die Zellen wurden entweder mit einer Energiedosis von 8 Gy bestrahlt, mit einer 200 μM Flurbiprofen enthaltenden Lösung inkubiert oder sie wurden mit einer Kombination aus Flurbiprofenapplikation und Bestrahlung behandelt. Vor der 2D PAGE wurden die Phosphoproteine durch IMAC angereichert. Zur Verbesserung der Gel-Analytik wurde die Software Delta 2D angewendet, die zum Ausgleich von Laufweitenunterschieden zwischen den Gelen ein Warping vorsieht. Ergebnisse und Diskussion: Bei der Analyse, der unter den verschiedenen experimentellen Bedingungen differentiell exprimierten Phosphoproteinen mittels bioinformatischer Hilfsprogramme wie z.B. WEBGestalt und STRING, wurden sieben Proteine mit Bedeutung für das Wachstum und die Entdifferenzierung von Tumoren identifiziert und einer ausführlichen Literaturrecherche unterzogen. Auf diese Weise konnten die Ergebnisse der für die vorliegende Arbeit durchgeführten Experimente in den systembiologischen Kontext eingeordnet werden. Besonders hervorzuheben ist die Herabregulierung der möglicherweise Radioresistenz vermittelnden Proteine GRP-75, 14-3-3 sigma und CRT sowie die Herabregulierung des anti-apoptotischen und tumor-begünstigenden Hsp60 durch Flurbiprofen. Die Verminderung der Expression unterstreicht das Potential dieses Pharmakons sowie der Klasse der COX-Inhibitoren als mögliche radiosensitivierende und tumorsuppressive Substanzen.

Untersuchungen zur Wechselbeziehung zwischen Proteom, Energiestoffwechsel, Redoxstatus und Radiosensibilität von Tumorzellen in vitro und in vivo

Zielsetzung der vorliegenden Arbeit war die Erforschung ursächlicher Unterschiede im Energiestoffwechsel von hoch- und niedrig-glykolytischen Tumorzelllinien. Darüber hinaus wurde die Hypothese überprüft, wonach eine hohe glykolytische Aktivität in Tumorzellen zu einer Anreicherung von antioxidativen Metaboliten führt und infolgedessen eine Therapieresistenz gegen Gammabestrahlung hervorruft. Abschließend sollte durch biochemische und gentechnische Manipulationen des Energie- bzw. Glukosestoffwechsels die Strahlenresistenz von Tumorzellen verändert und somit neue therapeutische Interventionen eröffnet werden.rnDie zur Klärung dieser Fragestellung erforderlichen molekularbiologischen Experimente erfolgten an jeweils zwei Ovarialkarzinomzelllinien (OC316 und IGROV-1) und zwei Plattenepithelkarzinomzelllinien der Kopf- und Halsregion (SAS und FaDu) sowie den entsprechenden Experimentaltumoren.rnUnabhängig von der Tumorentität und dem Tumormodell konnte gezeigt werden, dass eine erhöhte Expression Stoffwechsel-assoziierter Proteine mit einem gesteigerten Energiestoffwechsel einhergeht. Der Transfer der Ovarial- und Plattenepithelkarzinomzelllinien in das Mausmodell führte zu keiner grundsätzlichen Änderung des Tumormikromilieus. So wies die hoch-metabolische Linie OC316 in vitro und in vivo eine stark erhöhte MCT-4 Expression auf, deren gentechnische Inhibition jedoch zu keiner Reduktion der Glykolyserate führte.rnDie Hypothese, dass die Laktatproduktion als prädiktiver Marker für die Strahlenresistenz einer Tumorzelllinie fungiert, konnte nicht bestätigt werden. Jedoch führte die Manipulation der intrazellulären Laktatbildung und des Energiestoffwechsels mit nicht zelltoxischen Konzentrationen von 2-Deoxy-D-glukose (2DG) und Rotenon (ROT) bei den Ovarialkarzinomzelllinien zu einer Erhöhung der intrazellulären O2--Anionen, einer Zunahme der Strahlenempfindlichkeit sowie zur Steigerung der initialen und residualen DNA-Doppelstrangbrüche nach Gammabestrahlung.rnHierbei wirken 2DG und ROT synergistisch durch die Inhibierung antioxidativer Systeme sowie durch die Erhöhung des zellulären Radikal-Status. Die Anwendung von Stoffwechselmanipulatoren zur Optimierung und Unterstützung vorhandener Radikal-erzeugender Therapieformen wird aktuell in klinischen Studien überprüft. Translational könnte die durch 2DG und ROT beschriebene Erhöhung der Strahlenempfindlichkeit bei Ovarialkarzinomzelllinien z. B. in Kombination mit intensitätsmodulierten Strahlentherapien neue Behandlungsmöglichkeiten eröffnen, was in weiterführenden in vivo Studien zu überprüfen ist.rn

Charakterisierung von T-Zell-Antworten gegen humane Nierenzellkarzinome sowie Identifizierung von HLA-G als tumorassoziiertes Antigen und Immunevasionsmechanismus des Nierenzellkarzinoms

Humane Nierenzellkarzinom-(NZK)-Zelllinien wurden etabliert, um sie zur Generierung von autologen zytotoxischen T-Zelllinien einzusetzen. Erst nach Modifikation mit dem kostimulierenden B7-1-Molekül wurden mit der NZK-Zelllinie MZ1257RC autologe, tumorspezifische T-Zelllinien generiert und charakterisiert. Die Aufklärung eines T-Zell-definierten TAA eines autologen, zytotoxischen T Zellklons wurde mittels Expressionsklonierung einer hergestellten cDNS-Expressionsbank begonnen. Nach in vitro-Sensibilisierung von peripheren Blutmonozyten mit der autologen NZK-Zelllinie MZ2733RC wurde die HLA-Klasse I-restringierte T Zelllinie XIE6 generiert, die die autologe und verschiedene allogene NZK- sowie Zervixkarzinom-Zelllinien, jedoch nicht autologe Nierenzellen lysiert. Die T Zellen exprimieren TZR Vβ13.6-Ketten und sezernieren GM-CSF und IL-10 nach Antigenstimulation. Jedoch ist die NZK-Zelllinie MZ2733RC wenig sensitiv gegenüber autologen und allogenen Effektorzellen. Erst die Blockade ihrer HLA Klasse I-Moleküle auf der Zelloberfläche erhöht ihre Sensitivität gegenüber allogenen lymphokin-aktivierten Killer-Zellen. Verantwortlich dafür können nicht-klassische HLA Klasse Ib-Moleküle, insbesondere HLA-G sein, dessen Transkripte in der RNS der NZK-Zellen, jedoch nicht in Nierenzellen detektiert wurden. In einer detaillierten Studie wurden HLA-G-Transkripte in NZK-Zelllinien (58%), in NZK-Biopsien (80%), und nur in wenigen Nierenepithelbiopsien (10%) nachgewiesen. In der NZK-Zelllinie MZ2733RC wurde eine konstitutive HLA-G1-Proteinexpression beobachtet, die durch eine IFN-γ-Behandlung induzierbar ist.

Bedeutung des Glukosestoffwechsels für die Strahlenempfindlichkeit solider Tumoren

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, Stoffwechseluntersuchungen an Experimentaltumoren von humanen Plattenepithelkarzinomen des Kopf-Hals-Bereiches mit bekannter Strahlenempfindlichkeit durchzuführen. Die Resultate sollten mit dem Genexpressionsniveau glykolyseassoziierter Transportproteine und Enzyme, der Proteinexpression von LDH-A, der Hypoxie und der Strahlenresistenz der Tumoren korreliert werden. Während die Tumorproben und die Daten zum biologischen Strahlenverhalten und zur Charakterisierung der Hypoxie aus Dresden stammen, wurden alle anderen Untersuchungen in Mainz durchgeführt. Ein wichtiges Merkmal der kooperativen Studie bestand darin, dass erstmals die Strahlenresistenz von Experimentaltumoren systematisch in einem klinischen Fraktionierungsschema untersucht wurde. Die lokale Bestimmung der Gewebskonzentrationen der Metabolite ATP, Glukose und Laktat erfolgte mit dem Verfahren der bildgebenden Biolumineszenz. Die Auswertung der Ergebnisse mit Unterstützung von Bildverarbeitungs-Software wurde weiterentwickelt und in wesentlichen Punkten verbessert. Zur Ermittlung des mRNA-Expressionsniveaus der Glykolyseenzyme PFK-L und LDH-A sowie des Glukosetransporters GLUT1 diente die real time RT-PCR-Methode. Ein Kernpunkt des methodischen Teils der vorliegenden Arbeit bildeten die Validierung und Etablierung dieses Verfahrens. Durch die Anwendung dieser Technik war es möglich, eine relative Quantifizierung des Expressionslevels durchzuführen. Die Western Blot-Analyse lieferte Aussagen über den Proteingehalt von LDH-A. Dabei kam ein neues Auswerteverfahren durch Anwendung fluoreszenzmarkierter Antikörper zum Einsatz. Die Ergebnisse zeigten erstmals einen direkten Zusammenhang zwischen dem Laktatgehalt von Tumoren und deren Strahlenresistenz. Es wurde im Vergleich zu früheren klinischen Untersuchungen eine Einstufung in Hoch- und Niedriglaktattumoren vorgenommen und eine signifikante Korrelation innerhalb der Hochlaktattumoren zwischen dem Laktatgehalt und der über Pimonidazol quantifizierten hypoxischen Fraktion festgestellt. Während die PCR Unterschiede in den drei untersuchten Genen auf transkriptioneller Ebene zwischen den sieben untersuchten Tumorlinien erkennen ließ, waren die Western Blot-Ergebnisse nahezu gleich. Da auch die Western Blot-Analysen keine Übereinstimmungen mit dem Laktatgehalt zeigten, kann auch der reine Proteingehalt keine Rolle als aktivitätsbestimmende Größe der Glykolyse spielen. Vielmehr scheinen Aktivierungs- und posttranslationale Prozesse oder auch eine Kombination mehrerer Faktoren eine Rolle zu spielen. Letztlich deuten die Befunde darauf hin, dass die glykolytische Aktivität der untersuchten Tumoren nicht über Transkription und Proteinexpression reguliert wird. Der Zusammenhang zwischen dem Laktatgehalt und der Strahlenresistenz der Tumoren kann von großer klinischer Bedeutung sein, da ein klinisch relevantes Fraktionierungsschema bei der Bestrahlung angewandt wurde. Unsere Ergebnisse bestätigen die Arbeitshypothese, dass ein hoher glykolytischer Flux mit einer hohen Umsatzrate an Metaboliten mit Radikalfängerfunktion, wie Pyruvat, einhergeht, die den Tumoren eine Radioresistenz verleihen. Der Laktatgehalt von Biopsien als Marker für die Strahlenresistenz könnte in Zukunft zu einer der Radiotherapie vorangehenden Patientenselektion herangezogen werden, um die Therapie- und insbesondere Dosisplanung in der Onkologie zu unterstützen.

Glukosestoffwechsel und Strahlentherapie solider, maligner Tumoren

Der Tumorstoffwechsel ist charakterisiert durch eine erhöhte Glykolyserate und die Anreicherung von Laktat auch in Anwesenheit von Sauerstoff. In früheren Arbeiten dieser Arbeitsgruppe konnte gezeigt werden, dass ein hoher Laktatgehalt in Primärtumoren signifikant mit einem gesteigerten Metastasierungsverhalten und einer schlechteren Patientenprognose verknüpft ist. Ein wichtiges Verfahren zur Bestimmung des Metabolitstatus in kryokonservierten Tumorschnitten ist die induzierte, metabolische Biolumineszenz. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein neues, digitales Kamerasystem für Biolumineszenzmessungen etabliert. Außerdem wurde der für die Laktat- und Glukosemessungen benötigte Enzymmix optimiert, so dass eine bessere Lichtausbeute und eine Kosteneinsparung von etwa 50% erzielt werden konnte. Durch die Einführung von Kontrollmessungen und die Verwendung eines neu entwickelten ImageJ-PlugIns für eine halbautomatisierte Auswertung, konnte ein zuverlässiges Messsystem etabliert werden, das Ergebnisse mit einer verbesserten Reproduzierbarkeit liefert. rnDieses neue Messsytem wurde in einer Studie an zehn humanen xenotransplantierten Plattenepithelkarzinomen des Kopf-Hals-Bereiches erfolgreich eingesetzt. Es konnte gezeigt werden, dass eine signifikante, positive Korrelation zwischen dem Laktatgehalt in soliden Primärtumoren und der Resistenz gegenüber einer fraktionierten Strahlentherapie besteht. rnIn einer weiterführenden Studie wurde im gleichen Xenograftmodell der Einfluss einer fraktionierten Strahlentherapie auf den Tumorstoffwechsel untersucht. Der Vergleich von zwei humanen Plattenepithelkarzinomlinien des Kopf-Hals-Bereichs im Verlauf einer fraktionierten Strahlentherapie zeigt deutliche Unterschiede zwischen strahlenresistenten und strahlensensiblen Tumoren. In der strahlenempfindlichen Tumorlinie UT-SCC 14 treten nach Bestrahlung mit drei Fraktionen in der Expression glykolyse-assoziierter Gene und nach zehn Fraktionen im ATP- und Laktatgehalt signifikante Veränderungen auf. Im Gegensatz dazu wird bei der strahlenresistenten Linie UT-SCC 5 lediglich eine Absenkung des Laktatgehaltes nach zehn Fraktionen beobachtet, nicht jedoch des ATP-Gehalts. Die mRNA-Expression wird in UT-SCC 5 nicht durch eine fraktionierte Bestrahlung verändert. Diese Ergebnisse liefern erste Hinweise, dass das mRNA-Expressionslevel und der Metabolitgehalt frühe Marker für das Ansprechen auf eine Strahlentherapie sein können.rn