Funktionelle Analyse der Plasmamembran-Ca 2+-ATPase 2 -PMCA2- in Modellen der Neurodegeneration

Calcium (Ca2+) ist ein ubiquit��r vorkommendes Signalmolek��l, das an der Regulation zahlreicher zellul��rer Prozesse, von der Proliferation bis zum programmierten Zelltod, beteiligt ist. Daher m��ssen die intrazellul��ren Ca2+-Spiegel streng kontrolliert werden. Ver��nderungen der Ca2+-Hom��ostase w��hrend der altersassoziierten Neurodegeneration k��nnen dazu beitragen, dass Neuronen vulnerabler sind. So wurden erh��hte Ca2+-Konzentrationen in gealterten Neuronen, begleitet von einer erh��hten Vulnerabilit��t, beobachtet (Hajieva et al., 2009a). Weiterhin wird angenommen, dass der selektive Untergang von dopaminergen Neuronen bei der Parkinson Erkrankung auf eine erh��hte Ca2+-Last zur��ckzuf��hren sein k��nnte, da diese Neuronen einem st��ndigen Ca2+-Influx,rnaufgrund einer besonderen Isoform (CaV 1.3) spannungsgesteuerter Ca2+-Kan��le des L-Typs, ausgesetzt sind (Chan et al., 2007). Bislang wurden die molekularen Mechanismen, die einem Ca2+-Anstieg zu Grunde liegen und dessen Auswirkung jedoch nicht vollst��ndig aufgekl��rt und daher in der vorliegenden Arbeit untersucht. Um Ver��nderungen der Ca2+-Hom��ostase w��hrend der altersassoziiertenrnNeurodegeneration zu analysieren wurden prim��re Mittelhirnzellen aus Rattenembryonen und SH-SY5Y-Neuroblastomazellen mit dem Neurotoxin 1-Methyl-4-Phenyl-Pyridin (MPP+), das bei der Etablierung von Modellen der Parkinson-Erkrankung breite Anwendung findet, behandelt. Ver��nderungen der intrazellul��ren Ca2+-Konzentration wurden mit einem auf dem gr��n fluoreszierenden Protein (GFP)-basierten Ca2+-Indikator,rn���Cameleon cpYC 3.6��� (Nagai et al., 2004), ermittelt. Dabei wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass MPP+ die Abregulation der neuronenspezifischen ATP-abh��ngigen Ca2+-Pumpe der Plasmamembran (PMCA2) induziert, die mit der Ca2+-ATPase des endoplasmatischen Retikulums (SERCA) und dem Na+/Ca2+-Austauscher (NCX) das zellul��re Ca2+-Effluxsystem bildet, was zu einer erh��hten zytosolischen Ca2+-Konzentration f��hrt. Die PMCA2-Abnahme wurde sowohl auf Transkriptionsebene als auch auf Proteinebene demonstriert, w��hrend keine signifikanten Ver��nderungen der SERCA- und NCX-Proteinmengen festgestellt wurden. Als Ursache der Reduktion der PMCA2-Expression wurde eine Abnahme des Transkriptionsfaktors Phospho-CREB ermittelt, dessen Phosphorylierungsstatus abh��ngig von der Proteinkinase A (PKA) war. Dieser Mechanismus wurde einerseits unter MPP+-Einfluss und andererseits vermittelt durch endogene molekulare Modulatoren gezeigt. Interessanterweise konnten die durch MPP+ induzierte PMCA2-Abregulation und der zytosolische Ca2+-Anstieg durch die Aktivierung der PKA verhindert werden. Parallel dazu wurde eine MPP+-abh��ngige verringerte mitochondriale Ca2+-Konzentration nachgewiesen, welche mit einer Abnahme des mitochondrialen Membranpotentials korrelierte. Dar��ber hinaus kam es als Folge der PMCA2-Abnahme zu einem verminderten neuronalen ��berleben.rnVer��nderungen der Ca2+-Hom��ostase wurden auch w��hrend der normalen Alterung inrnprim��ren Fibroblasten und bei M��usen nachgewiesen. Dabei wurden verringerte PMCA und SERCA-Proteinmengen in gealterten Fibroblasten, einhergehend mit einem Anstieg der zytosolischen Ca2+-Konzentration demonstriert. Weiterhin wurden verringerte PMCA2-Proteinmengen im Mittelhirn von gealterten M��usen (C57B/6) detektiert.rnDer zellul��re Ca2+-Efflux ist somit sowohl im Zuge der physiologischen Alterung als auch in einem altersbezogenen Krankheitsmodell beeintr��chtigt, was das neuronale ��berleben beeinflussen kann. In zuk��nftige Studien soll aufgekl��rt werden, welche Auswirkungen einer PMCA2-Reduktion genau zu dem Verlust von Neuronen f��hren bzw. ob durch eine PMCA2-��berexpression neurodegenerative Prozesse verhindert werden k��nnen.

Untersuchungen zur Zell-Transistor-Kopplung mittels der Voltage-Clamp-Technik

Untersuchungen zur Zell-Transistor Kopplung mittels der Voltage-Clamp TechnikIn der vorliegenden Arbeit wird die extrazellul��re Einkopplung elektrischer Signale von Zellen in Transistoren hinsichtlich der an der Kopplung beteiligten Parameter untersucht. Daf��r werden Zellen aus Prim��rkulturen und von Zell-Linien direkt auf den aktiven Sensorfl��chen der hergestellten Chips kultiviert. F��r die Experimente werden n- und p-Kanal Feldeffekttransistoren (FET) sowie Extended-Gate-Elektroden (EGE) mit Gold- und Titanoberfl��chen entwickelt.Zur Untersuchung der Kopplungseigenschaften werden die neuronale Zell-Linie SH-SY5Y, die humane Endothel Zell-Linie EA.hy-926 sowie als Prim��rzellen hippocampale Neuronen und Kardiomyozyten embryonaler und neonataler Ratten eingesetzt. Die Voltage-Clamp Technik erlaubt die Untersuchung spannungsgesteuerter Ionenkan��le in der Zellmembran. Ma��gebend f��r den Signalverlauf des extrazellul��r eingekoppelten Signals ist der Ionenstrom von Na+, K+ und Ca2+ durch die Membran im Kontaktbereich zwischen Zelle und Sensor.Die Kopplung kann elektrisch mithilfe eines Ersatzschaltkreises beschrieben werden, der alle beteiligten elektrischen Gr����en der Membran und der Ionenstr��me, sowie die Parameter des Kontaktbereichs und des Sensors enth��lt.Die Simulation der extrazellul��ren Signale zeigt, dass die beobachteten Signalformen nur durch eine Erh��hung der Ionenkanaldichten und dadurch einer deutlich vergr����erten Leitf��higkeit der Ionenarten im Kontaktbereich gegen��ber der freien Membran erkl��rt werden k��nnen.

Ion channels in mixed tethered bilayer lipid membranes

Mixed tethered bilayer lipid membranes (tBLMs) are described based on the self-assembly of a monolayer on template stripped gold, of an archea analogue thiolipid, 2,3-di-o-phytanyl-sn-glycerol-1-tetraethylene glycol-D,L-���-lipoic acid ester lipid (DPTL), and a newly designed dilution molecule, tetraethylene glycol-D,L-���-lipoic acid ester (TEGL). The usage of spacer and addition of extra dilution molecules between the substrate and the bilayer is that this architecture provides an ionic reservoir underneath the membrane, avoiding direct contact of the embedded membrane proteins with the gold electrodes and increasing the lateral diffusion of the bilayer, thus allowing for the incorporation of complex channels proteins which are failed in non-diluted systems. The tBLM is completed by fusion of liposomes made from a mixture of 1,2-diphythanolyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPhyPC), cholesterol, and 1,2-diphytanoyl-sn-Glycero-3-phosphate (DPhyPG) in a molar ratio of 6:3:1. Varying the mixing ratio, the optimum mixing ratio was obtained at a dilution factor of DPTL and TEGL at 90%:10%. Only under these conditions, the mixed tBLM showed electrical properties, as shown by EIS, which are comparable to a BLM. With higher dilution factors, a defect-free lipid bilayer was not formed. Formation of bilayers have been characterized by different techniques, such as surface plasmon resonance (SPR), electrochemical impedance spectroscopy (EIS), atomic force microscopy (AFM), and quartz crystal microbalance (QCM). Different proteins such as hemolysin, melittin, gramicidin, M2, Maxi-K, nAChR and bacteriohodopsin are incorporated into these tBLMs as shown by SPR and EIS studies. Ionic conductivity at 0 V vs. Ag|AgCl, 3M KCl were measured by EIS measurements. Our results indicate that these proteins have been successfully incorporated into a very stable tBLM environment in a functionally active form. Therefore, we conclude that the mixed tBLMs have been successfully designed as a general platform for biosensing and screening purposes of membrane proteins.