CD137-selektierte leukämiereaktive T-Zellen gesunder Spender zur adoptiven Immuntherapie stammzelltransplantierter Leukämiepatienten = CD137-selected leukaemia-reactive T Cells from healthy donors for adoptive immunotherapy in stem-cell-transplanted leukaemia-patients

Bei stammzelltransplantierten Patienten, die ein Rezidiv ihrer Leukämie erleiden, kann eine Donor-Lymphozyten-Infusion (DLI) dauerhafte vollständige Leukämieremissionen induzieren. T-Zellen in der DLI vermitteln sowohl den potentiell kurativen Graft-versus-Leukaemia (GVL) Effekt, als auch die potentiell lebensbedrohliche Graft-versus-Host Disease (GVHD). Hingegen könnte die Infusion von leukämiereaktiven T-Zellen einen selektiven GVL Effekt und einen Langzeitschutz vor Rezidiven durch eine spezifisch gegen die Leukämie gerichtete Immunantwort und Immunität vermitteln. Unsere Arbeitsgruppe hat Protokolle zur in vitro Generierung leukämiereaktiver T-Zellen entwickelt, die hohe zytotoxische Aktivität gegen akute myeloische Leukämie-Blasten (AML) bei minimaler Reaktion auf mögliche GVHD Zielstrukturen zeigen. Für die klinische Anwendung sind diese Protokolle jedoch zu aufwändig, wobei vor allem eine erhebliche Verkürzung der Kulturzeit auf wenige Wochen erforderlich ist. Diese Verkürzung der in vitro Kulturzeit könnte das Wachstum von T-Zellen vom central memory oder frühen effector memory Phänotyp fördern, für die eine bessere in vivo Effektorfunktion und längere Persistenz im Rezipienten verglichen mit T-Zellen aus Langzeitkultur gezeigt werden konnte. Der Aktivierungsmarker und Kostimulations-Rezeptor CD137 kann zur Erkennung und Isolation antigenspezifischer T-Zellen genutzt werden, ohne dass dafür das von den T-Zellen erkannte Peptidepitop bekannt sein muss. Eine CD137-vermittelte Anreicherung mit Hilfe von clinical grade Materialien könnte verwendet werden, um DLI-Produkte mit leukämiespezifischen T-Zellen herzustellen, die sich sowohl durch eine effizientere T-Zell Generierung durch in vitro Selektion und Kostimulation, als auch durch eine verbesserte Spezifität des T-Zell-Produkts auszeichnen. Lymphozyten-Leukämie Cokulturen (mixed lymphocyte leukaemia cultures) wurden mit CD8 T-Zellen gesunder Spender und HLA-identischen oder einzel-HLA-mismatch AML-Blasten angesetzt und wöchentlich restimuliert. Nach zwei Wochen wurden die T-Zellen 12 Stunden nach Restimulation über den Marker CD137 positiv isoliert und anschließend separat weiterkultiviert. Die isolierten Fraktionen und unseparierten Kontrollen wurden im ELISPOT-Assay und im Chrom-Freisetzungstest an Tag 5 nach der Restimulation getestet. Es wurden keine konsistent nachweisbaren Vorteile im Hinblick auf Wachstum und Funktion der isolierten CD137-positiv Fraktion im Vergleich zur unseparierten Kontrolle gefunden. Verschiedene Isolationsmethoden, Patient-Spender-Systeme, Methoden zur Restimulation, Temperaturbedingungen, Zytokinkombinationen und Methoden der Zytokinzugabe sowie zusätzliche Feeder-Zellen oder AML-Blasten konnten Wachstum, funktionelle Daten und die deutlichen Zellverluste während der Isolation nicht entscheidend beeinflussen. Vitalfärbungen zeigten, dass aktivierungsinduzierter Zelltod CD137-positiver Zellen zu diesen Ergebnissen beitragen könnte. Im Gegensatz zur Stimulation mit AML-Blasten wurden erfolgreiche CD137-Anreicherungen für peptidstimulierte T-Zellen publiziert. Unterschiedliche CD137-Expressionskinetiken, aktivierungsinduzierter Zelltod und regulatorische T-Zellen sind mögliche Faktoren aufgrund derer die CD137-Anreicherung in diesem spezifischen Kontext ungeeinet sein könnte. Der stimulatorische Effekt eines CD137-Signals auf AML-reaktive CD8 T-Zellen wurde mit Hilfe von CD3/CD28 und CD3/CD28/CD137 Antikörper-beschichteten magnetischen beads untersucht. Für Nierenzellkarzinom-reaktive T-Zellen war die Stimulation mit CD3/CD28/CD137 beads genauso effektiv wie mit Tumorzellen und effektiver als mit CD3/CD28 beads. Beide Arten von beads waren für eine Stimulation während der ersten Wochen der Zellkultur geeignet, sodass ein zusätzliches CD137-Signal für die länger anhaltende Expansion tumorreaktiver T-Zellen zur klinischen Anwendung nützlich sein könnte. Die bead-Expansion veränderte die IFN-Sekretion im ELISPOT nicht, aber verursachte eine mäßige Verschlechterung der Zytotoxizität im Chrom-Freisetzungstest. Im Gegensatz dazu zeigten bei AML-reaktiven T-Zellen beide Arten von beads einen nicht apoptosevermittelten, dosisabhängigen zellschädigenden Effekt, der zu einer raschen Abnahme der Zellzahl in Kulturen mit beads führte. Unerwünschte Effekte auf die T-Zell-Funktionalität durch bead-Stimulation sind in der Literatur beschrieben, dennoch gibt es aktuell keine Veröffentlichungen, die eine fundierte Erklärung für den Effekt auf AML-reaktive T-Zellen bieten könnten. Abgesehen von Literaturdaten, die darauf hindeuten, dass CD137 ein vielversprechendes Kandidatenmolekül für die Anreicherung und Expansion von AML-reaktiven T-Zellen sein könnte, zeigen die eigenen Daten sowohl zur CD137-Isolation als auch zur bead-Stimulation, dass für diese spezielle Anwendung CD137 ein ungeeigneter Aktivierungsmarker und Kostimulations-Ligand ist.

High gradient magnetic separation (HGMS) of erythrocytes infected with plasmodium falciparum

This thesis was undertaken to explore possible applications of high gradient magnetic separation (HGMS) for the separation of RBCs infected with Plasmodium falciparum, with the dual aim of establishing a novel and superior method for isolating late-stage infected cells, and of obtaining synchronized cell cultures.rnThe presented work presents protocols for HGMS of parasitized RBCs that fulfil these aims. Late-stage parasitized cell can be isolated essentially devoid of contamination with non-infected and ring-stage infected cells. Such an easy method for a highly quantitative and qualitative purification has not yet been reported. Synchronous cultures can be obtained both following depletion of late-stage infected cells, and following isolation of the latter. The quality of synchronization cultures matches that of sorbitol lysis, the current standard method for malaria culture synchronization. An advantage of HGMS is the avoidance of osmotic stress for RBCs. The new methods further have the appeal of high reproducibility, cost-effectiveness, and simple protocol.rnIt should be possible to take the methods beyond Plasmodium infected RBCs. Most magnetic separation techniques in the sector of biomedical research employ columns with a hydrophilic polymer-coated matrix. Our procedure employs an optimized buffer system. Polymer coating becomes unnecessary and uncoated columns are available at a fraction of the cost.

Design of multifunctional magnetic nanomaterials for biomedical applications

Diese Arbeit ist ein Beitrag zu den schnell wachsenden Forschungsgebieten der Nano-Biotechnologie und Nanomedizin. Sie behandelt die spezifische Gestaltung magnetischer Nanomaterialien für verschiedene biomedizinische Anwendungsgebiete, wie beispielsweise Kontrastmittel für die magnetische Resonanztomographie (MRT) oder "theragnostische" Agenzien für simultane optische/MR Detektion und Behandlung mittels photodynamischer Therapie (PDT).rnEine Vielzahl magnetischer Nanopartikel (NP) mit unterschiedlichsten magnetischen Eigenschaften wurden im Rahmen dieser Arbeit synthetisiert und erschöpfend charakterisiert. Darüber hinaus wurde eine ganze Reihe von Oberflächenmodifizierungsstrategien entwickelt, um sowohl die kolloidale als auch die chemische Stabilität der Partikel zu verbessern, und dadurch den hohen Anforderungen der in vitro und in vivo Applikation gerecht zu werden. Diese Strategien beinhalteten nicht nur die Verwendung bi-funktionaler und multifunktioneller Polymerliganden, sondern auch die Kondensation geeigneter Silanverbindungen, um eine robuste, chemisch inerte und hydrophile Siliziumdioxid- (SiO2) Schale um die magnetischen NP auszubilden.rnGenauer gesagt, der Bildungsmechanismus und die magnetischen Eigenschaften monodisperser MnO NPs wurden ausgiebig untersucht. Aufgrund ihres einzigartigen magnetischen Verhaltens eignen sich diese NPs besonders als (positive) Kontrastmittel zur Verkürzung der longitudinalen Relaxationszeit T1, was zu einer Aufhellung im entsprechenden MRT-Bild führt. Tatsächlich wurde dieses kontrastverbessernde Potential in mehreren Studien mit unterschiedlichen Oberflächenliganden bestätigt. Au@MnO „Nanoblumen“, auf der anderen Seite, sind Vertreter einer weiteren Klasse von Nanomaterialien, die in den vergangenen Jahren erhebliches Interesse in der wissenschaftlichen Welt geweckt hat und oft „Nano-hetero-Materialien“ genannt wird. Solche Nano-hetero-partikel vereinen die individuellen physikalischen und chemischen Eigenschaften der jeweiligen Komponenten in einem nanopartikulärem System und erhöhen dadurch die Vielseitigkeit der möglichen Anwendungen. Sowohl die magnetischen Merkmale von MnO, als auch die optischen Eigenschaften von Au bieten die Möglichkeit, diese „Nanoblumen“ für die kombinierte MRT und optische Bildgebung zu verwenden. Darüber hinaus erlaubt das Vorliegen zweier chemisch unterschiedlicher Oberflächen die gleichzeitige selektive Anbindung von Katecholliganden (auf MnO) und Thiolliganden (auf Au). Außerdem wurde das therapeutische Potential von magnetischen NPs anhand von MnO NPs demonstriert, die mit dem Photosensibilisator Protoporhyrin IX (PP) funktionalisiert waren. Bei Bestrahlung mit sichtbarem Licht initiiert PP die Produktion von zytotoxisch-reaktivem Sauerstoff. Wir zeigen, dass Nierenkrebszellen, die mit PP-funktionalisierten MnO NPs inkubiert wurden nach Bestrahlung mit Laserlicht verenden, während sie ohne Bestrahlung unverändert bleiben. In einem ähnlichen Experiment untersuchten wir die Eigenschaften von SiO2 beschichteten MnO NPs. Dafür wurde eigens eine neuartige SiO2-Beschichtungsmethode entwickelt, die einer nachfolgende weitere Anbindung verschiedenster Liganden und die Einlagerung von Fluoreszenzfarbstoffen durch herkömmliche Silan- Sol-Gel Chemie erlaubt. Die Partikel zeigten eine ausgezeichnete Stabilität in einer ganzen Reihe wässriger Lösungen, darunter auch physiologische Kochsalzlösung, Pufferlösungen und humanes Blutserum, und waren weniger anfällig gegenüber Mn-Ionenauswaschung als einfache PEGylierte MnO NPs. Des Weiteren konnte bewiesen werden, dass die dünne SiO2 Schicht nur einen geringen Einfluss auf das magnetische Verhalten der NPs hatte, so dass sie weiterhin als T1-Kontrastmittel verwendet werden können. Schließlich konnten zusätzlich FePt@MnO NPs hergestellt werden, welche die individuellen magnetischen Merkmale eines ferromagnetischen (FePt) und eines antiferromagnetischen (MnO) Materials vereinen. Wir zeigen, dass wir die jeweiligen Partikelgrößen, und damit das resultierende magnetische Verhalten, durch Veränderung der experimentellen Parameter variieren können. Die magnetische Wechselwirkung zwischen beiden Materialien kann dabei auf Spinkommunikation an der Grenzfläche zwischen beiden NP-Sorten zurückgeführt werden.rn