Mechanismen der Progenitorzell-induzierten Gefäßneubildung und myokardialen Funktionsverbesserung

Entscheidend für die Sauerstoffversorgung im ischämischen Gewebe ist die Bildung von Blutgefäßen. Dieser Vorgang findet im erwachsenen Organismus in Form von Arteriogenese, Angiogenese und Vaskulogenese statt. Die Entdeckung, dass endotheliale Progenitorzellen (EPC) aus dem Knochenmark mobilisiert werden können, um sich im Ischämiegebiet an der Bildung neuer Kapillaren zu beteiligen, eröffnet einen vollkommen neuen therapeutischen Ansatz. In der hier vorliegenden Arbeit konnte in drei unterschiedlichen Tiermodellen, dem Matrigelmodell, dem Hinterlaufischämiemodell und dem Infarktmodell der Nacktmaus gezeigt werden, dass eine Zelltherapie mit EPC die Neovaskularisation steigert und zu einer myokardialen Funktionsverbesserung beiträgt. Der entscheidende Beitrag der Arbeit liegt jedoch in der Erforschung des Zeitraums der Wirkung der Stammzelltherapie. In allen drei Tiermodellen konnte durch ein spezifisches Abtöten der mit der viralen Thymidinkinase (TK) transduzierten EPC der positive Effekt auf die Neovaskularisation gestoppt werden. Im Herzinfarktmodell der Nacktmaus kam es sogar zu einer signifikanten Verschlechterung der Herzfunktion sowie zu einer Vergrößerung des Infarktareals. Dieser Effekt war durch Apoptose der Zellen in der dritten und vierten Woche nach Infarkt und Zellinfusion zu beobachten. Somit besitzen EPC nicht nur eine Rolle in der initialen Freisetzung von Zytokinen, sondern tragen auch langfristig zur Aufrechterhaltung des zelltherapeutischen Effektes bei. Ob hierfür allein der Mechanismus der Differenzierung verantwortlich ist, bleibt in weiteren Untersuchungen abzuklären. Denkbar wäre auch eine Beeinflussung des Remodeling über parakrine Langzeiteffekte. Im zweiten Teil der Doktorarbeit wurde versucht, das eingeschränkte zelltherapeutische Potential von Progenitorzellen von Patienten mit „Koronarer Herzkrankheit“ (KHK) und ischämischer Kardiomyopathie mit Hilfe zweier eNOSTranskriptionsverstärker, „eNOS-enhancer“, zu verbessern. Im Matrigelmodell der Maus konnten wir eine Verbesserung des Neovaskularisationspotentials von Knochenmarkszellen (BMC) von Patienten nach Präinkubation mit dem eNOS-enhancer nachweisen. Auch im Myokardinfarktmodell der Maus konnten eine Verbesserung der Herzfunktion und eine Reduktion der Infarktgröße beobachtet werden. Beim direkten Vergleich der beiden eNOS-enhancer konnte kein Unterschied gefunden werden. Zusammenfassend leistet die hier vorliegende Arbeit einen wichtigen Beitrag zum Verständnis für die Bedeutung von Progenitorzellen im Rahmen der Stammzelltherapie nach Myokardinfarkt. Ferner wurde die Möglichkeit aufgezeigt, durch gezielte Beeinflussung der Progenitorzellen ihr therapeutisches Potential signifikant zu steigern.

Gen knockdown der Metalloproteasen Meprin alpha 1, alpha 2 und beta im Zebrabärbling Danio rerio

Die Metalloproteasen Meprin α und β übernehmen Schlüsselfunktionen in vielen (patho-) physiologischenrnProzessen. So sind sie beteiligt an der Umstrukturierung der extrazellulären Matrix, an immunologischenrnReaktionen oder an entzündlichen Gewebserkrankungen. Die beiden Enzyme kommenrnhauptsächlich in den Bürstensaummembranen von Niere und Darm sowie in der Haut von Vertebratenrnvor. Für die Erforschung der biologischen Aktivität der Meprine wurde in dieser Arbeit der ModellorganismusrnDanio rerio verwendet, der vor allem durch die Möglichkeit der gentechnischen Manipulationrnprädestiniert ist. Im Fisch konnten drei homologe Enzyme (Meprin α1, α2 und β) nachgewiesenrnwerden. Während mRNA-Analysen eine nahezu ubiquitäre Verteilung der Meprine offenbarten,rnkonnte ich mittels spezifischer Antikörper die Expression auf Proteinebene nachweisen. WährendrnMeprin α1 und β verstärkt im Darmepithel und in der Epidermis lokalisiert sind, konnte Meprinrnα2 ausschließlich in der Lamina propria des Darms identifiziert werden.rnDer Hauptteil der vorliegenden Arbeit zielt auf die spezifische Reduzierung des Expressionslevels derrnMeprine in Embryonen des Zebrabärblings. Dies wurde durch die Mikroinjektion von sogenanntenrnMorpholinos in die Zygote erzielt. Morpholinos sind RNA-Moleküle, die spezifisch an die mRNA desrnZielproteins binden können und die Translation verhindern. Die auftretenden Effekte durch das Fehlenrnder Meprine lassen so Rückschlüsse auf ihre physiologische Funktion zu. Nach der Injektion vonrnMorpholinos gegen Meprin α1 zeigten sich lediglich leichte epidermale Deformationen. Bei Meprin βrnhingegen kam es zu einer massiven Fehlbildung von Organen im Rumpf- und Schwanzbereich. Diesesrnführte zu erheblichen Defekten; die Embryonen starben innerhalb der ersten 24 Stunden nach derrnBefruchtung. Demzufolge müssen Meprin α1 und Meprin β insbesondere an der Gewebsdifferenzierungrnbeteiligt sein. Dies korreliert mit verschiedenen Experimenten, u.a. an knockout Mäusen, ausrndenen hervorgeht, dass die Prozessierung und Aktivierung der Cytokine Interleukin-1β oder Interleukin-rn18 durch Meprin β erfolgen kann.rnDie Injektion von Meprin α2-Morpholinos erbrachte ein weiteres, eindrucksvolles Ergebnis: Das Blutgefäßsystemrnvon injizierten Embryonen war vollständig unterbrochen und es sammelten sich Erythrozytenrnim Bereich der Caudalvene an. Diese Phänotypen gleichen den knockdown-Experimenten mitrndem vascular endothelial growth factor VEGF-A, dem entscheidenden Wachstumsfaktor in der Angiogenesern(Blutgefäßbildung). Eine Inkubation des humanen VEGF-A mit (humanem) rekombinantemrnMeprin α bzw. β führte zu einer differenzierten Prozessierung des Moleküls. Diese Ergebnisse legenrnnahe, dass Meprin α pro-angiogenetisch wirkt, indem es VEGF-A prozessiert und damit die Gefäßbildungrnaktiviert. Aus den Daten dieser Arbeit wird die hohe Signifikanz der Meprine für die Proliferationrnund Differenzierung spezieller Gewebe deutlich, welche somit eine wichtige Grundlage für Studienrnan höheren Vertebraten darstellt.

Tissue engineering strategies for biomaterial-based anticancer drug delivery and enhancement of angiogenesis in tumor-resected bone

Patienten, die an Osteosarkom leiden werden derzeit mit intravenös applizierten krebstherapeutischen Mitteln nach Tumorresektion behandelt, was oftmals mit schweren Nebenwirkungen und einem verzögerten Knochenheilungsprozess einhergeht. Darüber hinaus treten vermehrt Rezidive aufgrund von verbleibenden neoplastischen Zellen an der Tumorresektionsstelle auf. Erfolgreiche Knochenregeneration und die Kontrolle von den im Gewebe verbleibenden Krebszellen stellt eine Herausforderung für das Tissue Engineering nach Knochenverlust durch Tumorentfernung dar. In dieser Hinsicht scheint der Einsatz von Hydroxyapatit als Knochenersatzmaterial in Kombination mit Cyclodextrin als Medikamententräger, vielversprechend. Chemotherapeutika können an Biomaterial gebunden und direkt am Tumorbett über einen längeren Zeitraum freigesetzt werden, um verbliebene neoplastische Zellen zu eliminieren. Lokal applizierte Chemotherapie hat diverse Vorteile, einschließlich der direkten zytotoxischen Auswirkung auf lokale Zellen, sowie die Reduzierung schwerer Nebenwirkungen. Diese Studie wurde durchgeführt, um die Funktionsfähigkeit eines solchen Arzneimittelabgabesystems zu bewerten und um Strategien im Bereich des Tissue Engineerings zu entwickeln, die den Knochenheilungsprozess und im speziellen die Vaskularisierung fördern sollen. Die Ergebnisse zeigen, dass nicht nur Krebszellen von der chemotherapeutischen Behandlung betroffen sind. Primäre Endothelzellen wie zum Beispiel HUVEC zeigten eine hohe Sensibilität Cisplatin und Doxorubicin gegenüber. Beide Medikamente lösten in HUVEC ein tumor-unterdrückendes Signal durch die Hochregulation von p53 und p21 aus. Zudem scheint Hypoxie einen krebstherapeutischen Einfluss zu haben, da die Behandlung sensitiver HUVEC mit Hypoxie die Zellen vor Zytotoxizität schützte. Der chemo-protektive Effekt schien deutlich weniger auf Krebszelllinien zu wirken. Diese Resultate könnten eine mögliche chemotherapeutische Strategie darstellen, um den Effekt eines zielgerichteten Medikamenteneinsatzes auf Krebszellen zu verbessern unter gleichzeitiger Schonung gesunder Zellen. Eine erfolgreiche Integration eines Systems, das Arzneimittel abgibt, kombiniert mit einem Biomaterial zur Stabilisierung und Regeneration, könnte gesunden Endothelzellen die Möglichkeit bieten zu proliferieren und Blutgefäße zu bilden, während verbleibende Krebszellen eliminiert werden. Da der Prozess der Knochengeweberemodellierung mit einer starken Beeinträchtigung der Lebensqualität des Patienten einhergeht, ist die Beschleunigung des postoperativen Heilungsprozesses eines der Ziele des Tissue Engineerings. Die Bildung von Blutgefäßen ist unabdingbar für eine erfolgreiche Integration eines Knochentransplantats in das Gewebe. Daher ist ein umfangreich ausgebildetes Blutgefäßsystem für einen verbesserten Heilungsprozess während der klinischen Anwendung wünschenswert. Frühere Experimente zeigen, dass sich die Anwendung von Ko-Kulturen aus humanen primären Osteoblasten (pOB) und humanen outgrowth endothelial cells (OEC) im Hinblick auf die Bildung stabiler gefäßähnlicher Strukturen in vitro, die auch effizient in das mikrovaskuläre System in vivo integriert werden konnten, als erfolgreich erweisen. Dieser Ansatz könnte genutzt werden, um prä-vaskularisierte Konstrukte herzustellen, die den Knochenheilungsprozess nach der Implantation fördern. Zusätzlich repräsentiert das Ko-Kultursystem ein exzellentes in vitro Model, um Faktoren, welche stark in den Prozess der Knochenheilung und Angiogenese eingebunden sind, zu identifizieren und zu analysieren. Es ist bekannt, dass Makrophagen eine maßgebliche Rolle in der inflammatorisch-induzierten Angiogenese spielen. In diesem Zusammenhang hebt diese Studie den positiven Einfluss THP-1 abgeleiteter Makrophagen in Ko-Kultur mit pOB und OEC hervor. Die Ergebnisse zeigten, dass die Anwendung von Makrophagen als inflammatorischer Stimulus im bereits etablierten Ko-Kultursystem zu einer pro-angiogenen Aktivierung der OEC führte, was in einer signifikant erhöhten Bildung blutgefäßähnlicher Strukturen in vitro resultierte. Außerdem zeigte die Analyse von Faktoren, die in der durch Entzündung hervorgerufenen Angiogenese eine wichtige Rolle spielen, eine deutliche Hochregulation von VEGF, inflammatorischer Zytokine und Adhäsionsmoleküle, die letztlich zu einer verstärkten Vaskularisierung beitragen. Diese Resultate werden dem Einfluss von Makrophagen zugeschrieben und könnten zukünftig im Tissue Engineering eingesetzt werden, um den Heilungsprozess zu beschleunigen und damit die klinische Situation von Patienten zu verbessern. Darüber hinaus könnte die Kombination der auf Ko-Kulturen basierenden Ansätze für das Knochen Tissue Engineering mit einem biomaterial-basierenden Arzneimittelabgabesystem zum klinischen Einsatz kommen, der die Eliminierung verbliebener Krebszellen mit der Förderung der Knochenregeneration verbindet.

Synthese und Charakterisierung von HPMA-stabilisierten Kolloiden sowie deren Evaluierung in vitro und in vivo

Nanodimensionale Wirkstoff-Trägersysteme sind in der Lage, sowohl die Bioverfügbarkeit als auch das pharmakokinetische Profil von Wirkstoffen drastisch zu verbessern. Hauptgründe dafür sind eine erhöhte Plasma-Halbwertszeit durch die größenbedingte verminderte renale Ausscheidung und eine gesteigerte Anreicherung im Tumorgewebe durch den EPR-Effekt. Diese Arbeit beschreibt die Synthese und Entwicklung neuer kolloidaler Wirkstoff-Trägersysteme, welche biokompatibel, teilweise bioabbaubar und funktionalisierbar sind. Ein Fluoreszenzfarbstoff wurde als hydrophobes Wirkstoffmodell eingekapselt. Wohldefinierte, eng verteilte und funktionalisierbare HPMA-basierte Block- und statistische Copolymere unterschiedlicher Molekulargewichte (10-25 kDa) und hydrophiler/hydrophober Zusammensetzung (10-50 mol%) wurden mittels RAFT- Polymerisation in Kombination mit dem Reaktivesteransatz hergestellt und in Miniemulsionsprozesse eingesetzt, um ihre Stabilisierungseffizienz zu untersuchen. Dabei zeigte sich, dass die kleineren Copolymere (10 kDa) mit einem Einbau von 10 mol% LMA, sowohl im Modellsystem Polystyrol, als auch im bioabbaubaren PDLLA-System, besonders geeignet sind und ergaben monodisperse Kolloide im Größenbereich von 100 bis 300 nm. Die kolloidalen Systeme zeigten keine Wirkung auf die Zellviabilität. In Folge dessen wurde das Aggregationsverhalten in humanem Blutserum mittels DLS untersucht, wobei keine Interaktion mit Blutbestandteilen festgestellt werden konnte. Zellaufnahmestudien wurden an HeLa-Zellen durchgeführt, um das Schicksal der Kolloide in vitro zu untersuchen. Dabei wurden Kernmaterial, Hülle und das hydrophobe Wirkstoffmodell durch unterschiedliche Fluoreszenzmarkierung getrennt betrachtet. Das hydrophobe Wirkstoffmodell wurde allein durch Interaktion der Kolloide mit den Zellen übertragen, was für eine diffusionsbedingte, initiale, aber unspezifische Freisetzung spricht. Eine solche Freisetzungskinetik kann durch Verwendung von Nitroglycerin, als vasodilatierender Wirkstoff mit geringer unspezifischer Wirkung, ausgenutzt werden, um den EPR-Effekt zu unterstützen. Die Aufnahme des Partikels hingegen geschieht zeitverzögert. Das Schicksal der Kolloide (sowohl des Kern- und desrnHüllmaterials) wurde durch doppelte Fluoreszenzmarkierung untersucht. Dabei kam es zu einer intrazellulären Ablösung der stabilisierenden Block-Copolymere zwischen 8 und 24 h. Nach Aufklärung der Aufnahme- und Freisetzungskinetiken wurde nun die Körperverteilung der PS- und PDLLA-Kolloide nach 18F-Markierung mittels PET und ex vivo-Biodistributiosstudien untersucht. Dabei hatte das Kernmaterial einen Einfluss auf die Körperverteilung. PET-Studien in Mäusen zeigten, dass die stabilisierenden Block-Copolymere beider Kolloide ein starkes Signal in der Niere geben, wobei das der PS-Kolloide weiter ausgeprägt war. Darüber hinaus war eine Anreicherung dieser in Lunge, Leber und Milz festzustellen. Die Verdrängung der stabilisierenden Polymere durch die Interaktion mit Blutbestandteilen erklärt dabei das erhöhte Nieren- und Blasensignal der PS- Kolloide. Das Anreicherungsmuster der PDLLA-Kolloide hingegen zeigte neben der Nierenakkumulation eine erhöhte Blutaktivität und somit die gewünschten langzirkulierenden Eigenschaften. Diese Ergebnisse konnten auch mittels ex vivo- Biodistributionsstudien bestätigt werden. Um die Tumoranreicherung weiter zu verbessern wurde die Verwendung von Folat als Erkennungsstruktur am einfachen HPMA-Polymer untersucht. Die Konjugate zeigten eine erhöhte Anreicherung im Vergleich zu den Polymeren ohne Erkennungsstrukturen. Blockadestudien bestätigten die Selektivität der Anreicherung. Diese Daten zeigen das Potential der Folat-Erkennungsstruktur in vivo innerhalb kurzer Zeitfenster, welche nun auf kolloidale Systeme übertragen werden kann.