Struktur- und Funktionsanalyse der zytokinbindenden Domäne des humanen Interleukin-6-Rezeptors

Die Familie der IL-6-Typ-Zytokine (IL-6, IL-11, CT-1, CNTF, LIF, OSM, BSF-3) ist durch eine vierhelikale Faltung gekennzeichnet. Alle Zytokine dieser Familie agieren über einen Rezeptorkomplex, der als gemeinsame Komponente mindestens ein Molekül gp130 enthält. IL-6 und IL-11 signalisieren über ein gp130-Homodimer, während CT-1, CNTF, LIF und OSM ein Heterodimer aus gp130 und dem strukturell verwandten LIFR oder, im Falle des OSM, auch OSMR verwenden. Die Rezeptoren der vierhelikalen Zytokine sind in ihrem extrazellulären Bereich modulartig aus Ig- und Fibronektin-Typ-III-ähnlichen Domänen aufgebaut. Sie besitzen als gemeinsame Struktureinheit ein zytokinbindendes Modul (CBM) aus zwei Fibronektin-Typ-III-ähnlichen Domänen, die durch vier konservierte Cysteine in der N-terminalen und ein konserviertes WSXWS-Motiv in der C-terminalen Domäne charakterisiert sind. Auf Zielzellen bindet IL-6 an den spezifischen IL-6 Rezeptor, worauf der Komplex aus IL-6/IL-6R mit dem Signaltransduktor gp130 assoziiert. Der IL-6R besteht in seinem extrazellulären Bereich aus drei Domänen. Die N-terminale Ig-ähnliche Domäne ist für die biologische Aktivität nicht notwendig. Die Domänen 2 und 3 bilden das CBM, welches auch in löslicher Form agonistisch wirkt. In der vorliegenden Arbeit wurden die strukturellen und funktionellen Eigenschaften der dritten extrazellulären Domäne des IL-6R untersucht. Das Protein läßt sich effizient in Bakterien exprimieren und in vitro renaturieren. Es konnte gezeigt werden, daß Domäne 3 für die Bindung an IL-6 ausreichend ist, der Komplex aus D3 und IL-6 jedoch nicht mehr mit dem gp130-Molekül assoziieren kann. Da der lösliche IL-6R (bestehend aus D2 und D3) in der Lage ist, an gp130 zu binden und ein biologisches Signal auszulösen, weisen diese Daten der C-terminalen CBM-Domäne (D3) eine ligandenbindende Funktion und der N-terminalen CBM-Domäne eine wichtige Rolle bei der Komplexbildung mit gp130 und Signalinduktion zu. Die gezeigte Expressions- und Renaturierungsstrategie für D3 wurde zur Markierung des Proteins mit 15N und 13C für die mehrdimensionale, heteronukleare NMR-Spektroskopie angewandt. Die hierdurch ermöglichte Strukturaufklärung von D3 als einer eindeutig in die Ligandenbindung involvierten Teilstruktur wird umfassendere strukturelle Informationen über den IL-6R-Komplex liefern, als es die bisherigen Mutations- bzw. Modellbaustudien konnten.

Die Biogenese von Chlorophyll-a/b-bindenden Lichtsammelkomplexen : Topographie des Apoproteins bei der Thylakoidinsertion

Die Biogenese von Chlorophyll-a/b-bindenden Lichtsammelkomplexen: Topographie des Apoproteins bei der Thylakoidinsertion Der wichtigste Chlorophyll a/b-bindende Lichtsammelkomplex höherer Pflanzen ist der an Photosystem II assoziierte LHCII. Die kerncodierten Apoproteine dieses Pigment-Protein Komplexes werden posttranslational in den Chloroplasten importiert und mit Hilfe des plastidären

Molekularbiologische Untersuchungen zu genetischen Varianten des dopaminergen Systems im Tiermodell und beim Menschen

Molekularbiologische Untersuchungen zu genetischen Varianten des dopaminergen Systems im Tiermodell und beim Menschen Die Arbeit beschäftigt sich mit genetischen Varianten des dopaminergen Systems und ihren funktionellen Konsequenzen im Tiermodell und beim Menschen.Im Tiermodell wurde apomorphininduziertes Verhalten bei Ratten getestet und die Dopaminrezeptoren D1 und D2 auf molekulare Veränderungen untersucht. Beim Menschen wurde über einen Apomorphintest die Sensitivität von Dopaminrezeptoren und der Einfluß dopaminerger Varianten auf die neuroendokrine Reaktion geprüft und mit Hilfe von Assoziationsuntersuchungen der Zusammenhang zwischen DNA-Sequenz-Polymorphismen des dopaminergen Systems und der Erkrankung der Alkoholabhängigkeit getestet.In dem Verhaltensmodell wurden Ratten in einem

Transkriptionelle Regulation des humanen Interferon-gamma-Promotors in T-Lymphocyten

Interferon-gamma is mainly produced by activated T helper cells and cytotoxic T lymphocytes and sustains the immune-defense against viral and bacterial infections. For a better understanding of IFN-gamma promoter regulation in T cells, different DNA-binding motivs were examined. Hereby, a new motiv (-196 to -183) was identified, that binds to the transcription factor AP-1 in T helper cells and Jurkat T cells. This factor acts as an essential activator protein. Further investigation demonstrated that IL-12 and IL-18 induce different regulatory pathways. Both AP-1 and STAT-4 bindings at their cognate DNA elements (-196 to -183 and -224 to -215) are required for the IL-12 dependent activation whereas IL-18 causes direct activation via AP-1.Moreover, the TH2 cytokine IL-4 represses significantly the IFN-gamma promoter activity in CD4+ T cells. IL-4 induces GATA-3, that interacts with two DNA-motivs (-111 to -87) at the IFN-gamma promoter.Furthermore, transgenic mice were generated, yielding a human IFN-gamma promoter construct (410 bp) under the control of a luciferase reporter gene. The data demonstrated a specific IFN-gamma promoter activation by antiCD3 plus antiCD28 in CD4+ and CD8+ T cells. The luciferase activty in CD4+ T cells was reinforced by addition of IL-12 and IL-18 and repressed by IL-4.

Kryoelektronenmikroskopie von Proteinen: 3D-Struktur (12 A) des Hämocyanins der Schnecke Haliotis

Zusammenfassung:Die Quartärstruktur des respiratorischen Proteins Hämocyanin (Isoform HtH1) aus der marinen Schnecke Haliotis tuberculata wurde vermittels Kryoelektronen-mikroskopie und 3D-Rekonstruktion untersucht. Das Molekül ist zylinderförmig, hat einen Durchmesser von ca. 35 nm und besteht aus einer Zylinderwand und einem internen Kragenkomplex. Dieser wiederum besteht aus einem Collar und einem Arc.Die kryoelektronenmikroskopischen Aufnahmen von in glasartigem Eis fixierten HtH1-Molekülen brachte eine enorme Verbesserung der Anzahl der zur Verfügung stehenden Ansichtswinkel gegenüber den negativkontrastierten Molekülen, die auf Karbonfilm präpariert waren.Die 3D-Rekonstruktion des HtH1 mittels Aufnahmen bei drei verschiedenen Defo-kuswerten verbesserte die Auflösung noch einmal deutlich gegenüber den Rekon-struktionen, die aus Aufnahmen bei einem festen Defokuswert gemacht wurden, und zwar auf 12 Å. Das Molekül besitzt eine D5-Symmetrie.Aus dieser bisher genausten Rekonstruktion eines Molluskenhämocyanins aus EM-Bildern ließen sich folgende neue Strukturdetails ableiten:· Ein Untereinheitendimer konnte als Repeating Unit im Dekamer des HtH1 beschrieben werden.· Das Untereinheitendimer konnte aus der 3D-Dichtekarte isoliert werden. Es be-steht eindeutig aus 16 Massen, die funktionellen Domänen entsprechen. Zwei dieser Massen bilden den Collar, zwei den Arc und 12 das Wandsegment.· Die gegenläufige Anordnung der beiden Untereinheiten innerhalb dieses Unte-reinheitendimers konnten bestätigt und auf zwei Möglichkeiten eingeschränkt werden.· Die Zahl der alternativen Anordnungen der 16 funktionellen Domänen (HtH1-a bis HtH1-h) im Untereinheitendimer konnten von 80 auf 2 eingeengt werden.· Es konnte über molekulares Modellieren mithilfe einer publizierten Kristallstruk-tur eine 3D-Struktur fastatomarer Auflösung der funktionellen Domäne HtH1-g berechnet werden.· Die funktionelle Domäne HtH1-g konnte als Domänenpaar plausibel in die 3D?Dichtekarte des Untereinheitendimers eingepasst werden, und zwar in die beiden Massen des Arc.Aus der elektronenmikroskopisch gewonnenen Dichtekarte wurde mit Hilfe des

Zeitaufgelöste Fluoreszenzmessungen zur Faltung und Pigmentbindung des Lichtsammlerproteins LHC II aus Photosystem II

Zusammenfassung Der Lichtsammlerkomplex (LHCII) aus PhotosystemII hoeherer Pflanzen kann in vitro rekonstituiert werden. Es werden drei Reaktionszeiten (<10 s; <1 min; <10 min) aufgeloest. Dabei werden bei allen Reaktionszeiten Pigmente durch das Apoprotein gebunden. Chlorophylle (Chl a und Chl b) und Xanthophylle wirken limitierend auf die Rekonstitution. Chl a beschleunigt die zweite Reaktionszeit, ein ausgeglichenes Chl a/b-Verhaeltnis verkürzt die dritte Reaktionszeit. Ein molekularer Mechanismus als Interpretation dieser Effekte wird vorgeschlagen. Native Lipide verlaengern nichtspezifisch die Rekonstitution. Abiotische Faktoren haben einen spezifischen Einfluss auf die Rekonstitution. Spezifische Einfluesse der o. a. Bedingungen auf die thermische Stabilitaet des rekonstituierten LHCII wurden bestimmt.

Experimentelle Untersuchungen zur embryonalen Entwicklung identifizierter Vorläuferzellen des zentralen Nervensystems von Drosophila melanogaster

Zusammenfassung Das ventrale Nervensystem (vNS) von Drosophila melanogaster entsteht aus zwei verschiedenen Populationen von Vorläufern, den mesektodermalen oder Mittellinien (ML)-Vorläufern und den neuroektodermalen Vorläufern oder Neuroblasten (NBs). Beide Populationen unterscheiden sich in vielen Aspekten, wie z.B. Genexpression, Teilungsverhalten und Zellstammbaum. Die ca. 30 NBs pro Hemisegment delaminieren als Einzelzellen aus dem Neuroektoderm und bilden ein invariantes subepidermales Muster in der neu entstandenen neuralen Zellschicht aus. Sie sind dort aufgrund ihrer Lage und der Expression spezifischer molekularer Marker individuell identifizierbar. Um die Mechanismen zu verstehen, die zur Determination und Differenzierung von ZNS Zellen führen, ist es eine Grundvoraussetzung, die Zellstammbäume aller Vorläufer zu kennen. Unter Verwendung des lipophilen in vivo Fluoreszenzfarbstoffs DiI wurden in früheren Arbeiten die Zellstammbäume der ML-Vorläufer und von 17 NBs, die aus der ventralen Hälfte des Neuroektoderms stammten, beschrieben. In der hier vorgelegten Arbeit wurden die Zellstammbäume von 13 NBs, die aus dem dorsalen Teil des Neuroektoderms delaminierten, beschrieben und 12 davon identifizierten Vorläufern zugeordnet. Darüber hinaus wurde ein bisher nicht beschriebener NB (NB 1-3) identifiziert und anhand morphologischer und molekularer Kriterien charakterisiert. Insgesamt produzierten die NBs ca. 120 Neurone und 22 bis 27 Gliazellen pro Hemineuromer, die in eine systematische Terminologie eingefügt wurden. Insgesamt besteht damit ein Neuromer des embryonalen vNS von Drosophila aus ca. 700 Neuronen (350 pro Hemineuromer) und 60 Gliazellen (30 pro Hemineuromer), die von NBs abstammen. Hinzu kommen ca. 12 ML-Neurone und 2 bis 4 ML-Glia pro Neuromer. Damit stammten die meisten Gliazellen im embryonalen vNS von Drosophila von NBs ab, die aus dem dorsalen Neuroektoderm hervorgingen. Zwei dieser NBs hatten ausschließlich gliale Nachkommen (NB 6-4A, GP) und fünf generierten sowohl Glia als auch Neurone (NBs 1-3, 2-5, 5-6, 6-4T, 7-4). Die übrigen sieben Zellstammbäume (NBs 2-4, 3-3, 3-5, 4-3, 4-4, 5-4, Klon y) waren rein neuronal. Es war ferner möglich, das bereits bekannte laterale Cluster von even-skipped exprimierenden Zellen (EL) dem Stammbaum von NB 3-3 zuzuordnen. Zusammen mit den zuvor beschriebenen Klonen sind damit mehr als 90% der thorakalen und abdominalen Zellstammbäume im embryonalen vNS von Drosophila bekannt. Darüber hinaus sind zuvor identifizierte Neurone und die meisten Gliazellen einem bestimmten Stammbaum zugeordnet und damit mit einer ontogenetischen Geschichte versehen. Dieser komplette Datensatz liefert eine Grundlage für die Interpretation mutanter Phänotypen und für zukünftige Untersuchungen über die Festlegung von Zellschicksalen und die Differenzierung von Zellen. Dies könnte dazu beitragen, das Verhältnis zwischen Herkunft der Zelle, Genexpression und Zellfunktion besser zu verstehen. Die wesentliche Funktion neuronaler Zellen ist die Integration und Weiterleitung von elektrischen Signalen. Mithin ist die Ausbildung elektrischer Eigenschaften (Elektrogenese) ein wesentlicher Aspekt der neuronalen Entwicklung. Um dabei zelltypspezifische Unterschiede zu finden, ist die Arbeit an definierten Zellpopulationen eine zwingende Voraussetzung. Es wurde daher hier ein in vitro System verwendet, das die selektive Kultivierung identifizierter embryonaler Vorläufer unter verschiedenen Bedingungen erlaubt. Da die Zellstammbäume der ML-Vorläufer besonders einfach sind und die ML-Zellen zudem in vielen Aspekten von den neuroektodermalen Zellen verschieden sind (s.o.), wurden die ML-Neurone als erstes Modellsystem ausgewählt. Unter Verwendung der Patch-clamp Technik wurden die in dieser definierten Zellpopulation auftretenden Ionenströme detailliert beschrieben. ML-Neurone exprimierten zumindest zwei verschiedene Typen von spannungsgesteuerten K+-Strömen (IA und IK), einen spannungsabhängigen Na+-Strom und zwei spannungsgesteuerte Ca(Ba)2+-Ströme. Darüber hinaus reagierten sie auf die Neurotransmitter ACh und GABA. Die meisten Ionenströme in den ML-Neuronen waren, trotz ihrer ontogenetischen Besonderheit, annähernd identisch mit denen, die in anderen Drosophila-Neuronen gefunden wurden. Ihnen fehlte allerdings eine anhaltende Komponente des Na+-Stroms, und sie waren homogen in ihrer Aktivität. Selbst bei anhaltender elektrischer Stimulation generierten sie immer nur ein Aktionspotential. Sie sind daher möglicherweise spezifisch hinsichtlich ihrer Signalleitungseigenschaften. Interessanterweise zeigte sich durch Verwendung verschiedener Kulturbedingungen, daß die Expression der spannungsgesteuerten K+-Kanäle weitgehend zellautonom erfolgte, während die Expression der anderen Ströme stark durch das Vohandensein von Neuritenkontakten beeinflußt wurde. Vorläufige Untersuchungen lassen darauf schließen, daß der involvierte molekulare Mechanismus unabhängig von synaptischer Transmission ist. In einer Art 'Ausblick' wurde schließlich die Validität von in vitro Ableitungen durch Analyse spannungsgesteuerter K+-Ströme in einer neuen in situ Präparation geprüft, die verschiedene Bereiche des Drosophila-ZNS für elektrophysiologische Untersuchungen zugänglich macht. Damit ist ein experimentelles System etabliert, daß den direkten Vergleich von in vitro und in situ Daten an definierten Zellpopulationen ermöglichen sollte.

Untersuchung des immunogenen Potentials von Dense Bodies des Humanen Cytomegalovirus (HCMV) als Grundlage für die Entwicklung einer neuartigen HCMV-Vakzine

ZusammenfassungDas Humane Cytomegalovirus (HCMV) ist ein Erreger von erheblicher klinischer Bedeutung. Eine HCMV-Vakzine ist bislang nicht verfügbar. Immunität ist nur durch eine Kombination effizienter humoraler und zellulärer Effektormechanismen zu vermitteln. Inhalt der Arbeit war es zu untersuchen, ob defekte virale Partikel, sog. Dense Bodies (DB) eine derartige Immunantwort gegen HCMV induzieren können. Die Immunisierung mit DB induzierte im Mausmodell die Bildung HCMV-neutralisierender Antikörper, die über ein Jahr hinweg im Serum der Tiere nachweisbar blieben. Die Spiegel an neutralisierenden Antikörpern waren mit Titern vergleichbar, die nach einer durchlaufenen, natürlichen HCMV-Infektion in menschlichen Seren gemessen wurden. Obwohl DB ein Totantigen darstellen und keine de novo-Synthese von viralen Proteinen vermitteln, stimulierten sie zudem eine deutliche HCMV-spezifische, zytotoxische T-Zell-Antwort (CTL-Antwort). Die Analyse der T-Helferzell-Antwort ergab, dass die Applikation von DB eine Th1-artige Immunantwort auslöste, die die Kontrolle einer Virusinfektion unterstützt. DB des HCMV sind folglich geeignet, sowohl humorale als auch zelluläre Immuneffektormechanismen effizient zu induzieren. Sie erwiesen sich als ein wirksames Antigentransportsystem, das als vielversprechende Grundlage für die Entwicklung einer rekombinanten HCMV-Vakzine dienen kann. Um die Immunogenität der DB für die Anwendung am Menschen weiter zu optimieren, müssen sie um zusätzliche Epitope ergänzt werden. Derartige rekombinante DB können nur durch Konstruktion mutanter HCMV-Genome generiert werden. Daher wurden im Rahmen dieser Arbeit zwei Genombereiche des HCMV dahingehend charakterisiert, ob sie zur Insertion von Fremdsequenzen geeignet sind. Der Leserahmen UL32, der für das Phosphoprotein pp150 kodiert, erwies sich als essentiell. Mit der IE4-Region hingegen konnte ein 5 kB langes Genomfragment identifiziert werden, das aus dem Genom deletiert und gegen zusätzliche antigene Determinanten ausgetauscht werden kann. Zusammenfassend eröffnen die vorgestellten Ergebnisse neue Möglichkeiten zur Entwicklung eines wirksamen Impfstoffes gegen HCMV.

Funktionale Analyse des CpY/DmX Gens aus Chironomus und Drosophila melanogaster

Zusammenfassung: Funktionale Analyse des CpY/DmX Gens aus Chironomus und Drosophila melanogaster Bei CpY und DmX handelt es sich um homologe neuartige Gene aus den Dipteren Chironomus piger und Drosophila melanogaster. CpY und DmX bestehen aus 15 Exons, die für eine mRNA von ca. 11,5 kb kodieren.Das Gen hat eine genomische Länge von ca. 15 kb. Die abgeleiteten Genprodukte sind durch eine hohe Anzahl von WD-Repeats gekennzeichnet.WD-Proteine besitzen in der Regel regulatorische Funktionen in allen möglichen Bereichen. Ein Strukturvergleich mit homologen Genen legt die Vermutung nahe, daß sich sowohl am N- als auch am C-Terminus eine WD-Propellerstruktur befindet. CpY aus Chironomus piger ist in einem hromosomalen Abschnitt lokalisiert, der den Kern eines evolvierendenGeschlechtschromosoms darstellt. Dieses Gen besitzt im Gegensatz zu DmX geschlechtsspezifisch in Introns integrierte Transposons und wird quantitativ geschlechtsspezifisch gespleißt. DmX ist auf dem X-Chromosom im Bereich 5D6-5E1 lokalisiert, es konnte jedoch kein geschlechtsspezifisches Expressionsmuster diagnostiziert werden. Die Transkriptionsanalyse ergab,daß DmX während der Oogenese und der gesamten Embryonalentwicklung transkribiert wird. Dabei wird neben einer ubiquitären Grundexpression DmX in einer gewebespezifischen Weise exprimiert. Die DmX-Transkriptewandern offensichtlich - wie die CpY-Transkripte - in großer Menge in die reifende Oozyte. Bei DmX/CpY könnte es sich also um ein maternales Effektgen handeln. Während der Embryogenese können zunächst DmX-Transkripte am posterioren Pol nachgewiesen werden. Danach färben die vorderen und hinteren Mitteldarmvorläufer, dann spezifische Zellen im ZNS und in reifen Embryonen das gesamte ZNS, Sinnesorgan-Anlagen im Kopf, sowie der Enddarm. Das dem DmX benachbarte Gen DmSPX, welchen mit diesem einen gemeinsamen 174 bp großen bidirektionalen Promoter besitzt, zeigt ein von DmX unterschiedliches Transkriptionsmuster. Mit einer Reihe von Keimbahntransformationen konnten die für eine ordnungsgemäße Expression hinreichenden regulatorischen Bereiche identifiziert werden. In Versuchen, mittels verschiedener 'Antisense'-Strategien einen Phänotyp zu generieren, konnte kein spezifischer Phänotyp nachgewiesen werden. Durch die erfolgreiche Keimbahntranformationeines Rettungsvektors, welcher ein intaktes DmX-Gen enthält, konnte der Phänotyp von EMS-DmX-Mutanten identifiziert werden: Nach anfänglich normaler Embryonalentwicklung werden die Larven im Laufe des L1-Stadiums schlaff und inaktiv, jedoch nicht paralytisch und stellen Bewegung und Nahrungsaufnahme ein. Kurz nachdem wildtypische Larven das L2-Stadium erreichen, sterben die Mutanten ab. Der Phänotyp wei'st starke Ähnlichkeit zu Synaptotagmin I-Mutanten und zu alpha-Adaptin-Mutanten auf. Das Transkriptionsmuster ähnelt dem von alpha-Adaptin und AP50. Alle diese Gene spielen in der Endozytose eine Rolle

Aktivierung des Sauerstoffsensors FNR von Escherichia coli durch Glutathion in vivo und in vitro

Der Sauerstoffsensor FNR (Fumarat-Nitratreduktase-Regulator) von Escherichia coli spielt eine wichtige Rolle beim Umschalten vom aeroben zum anaeroben Stoffwechsel. FNR ist ein Transkriptionsregulator, der im aktiven Zustand ein [4Fe4S]-Zentrum besitzt. Bei Kontakt mit Sauerstoff zerfällt das [4Fe4S]- zu einem [2Fe2S]-Zentrum und führt zum Verlust der Aktivität von FNR. Die Reaktionen, die zum Aufbau des [4Fe4S]-Zentrums und der reduktiven Aktivierung von aerob und anaerob isoliertem apoFNR führen, wurden in vivo und in vitro untersucht. Die Einfluß in vivo von Glutathion auf die Funktion von FNR und die Rolle von Glutathion beim Aufbau des [4Fe4S]-Zentrums in gereinigtem apoFNR zeigen die wichtige Bedeutung von Glutathion bei der de novo Assemblierung von [4Fe4S]FNR und bei der reduktiven Aktivierung von sauerstoff-inaktiviertem FNR. Die energetischen Parameter von E. coli und ihre Änderungen beim Übergang vom aeroben zum anaeroben Stoffwechsel wurden untersucht. Das elektrochemische Protonenpotential delta-p über der Cytoplasmamembran wurde im Gleichgewichtszustand in der aeroben Atmung und anaeroben Nitrat-, Fumarat- und Dimethylsulfoxid-Atmung bestimmt. Delta-p betrug in der aeroben Atmung -160 mV, in der anaeroben Atmung sank delta-p entgegen früheren Vermutungen lediglich um 20 mV. Die geringen Änderungen von delta-p können deshalb vermutlich nicht als regulatorisches Signal für das Umschalten vom aeroben zum anaeroben Stoffwechsel genutzt werden.

Funktionelle Zusammenhänge zwischen Expressionsveränderungen des von Hippel-Lindau Tumorsuppressorgens und dessen potentiellen Zielgenen in sporadischen Nierenzellkarzinomen

ZusammenfassungNierenzellkarzinome (NZK) sind häufig gekennzeichnet durch den Funktionsverlust des von Hippel-Lindau Tumorsuppressorgens (VHL TSG). Man kennt heute eine Reihe potentieller Kandidatengene, die eventuell in Wechselwirkung mit dem VHL-Genprodukt stehen (VEGF, c-fos, c-myc). Zur Aufklärung der molekularen Vorgänge, die zur Pathogenese der gut vaskularisierten Nierenzellkarzinome beitragen, wurden NZK-Zellinien untersucht. Vektorkonstrukte wurden generiert, um das in vitro und in vivo Wachstumsverhalten vor und nach Transfektion zu beobachten. Mit Hilfe eines GFP-Fusionsproteins wurden zusätzlich Hinweise auf die intrazelluläre Lokalisation des VHL-Genproduktes (pVHL) geliefert. Nach Abschluß der vorliegenden Studien zeigte sich eine direkte Abhängigkeit der beiden Gene VHL und VEGF. Sowohl die in vitro als auch die in vivo Ansätze bewiesen eine Interaktion der beiden Gene. Die Frage nach einer Interaktion von pVHL mit den Genprodukten Fos und Myc läßt sich jedoch nicht eindeutig beantworten. Die Expressionsveränderungen dieser Gene erfolgten scheinbar willkürlich, eine Interaktion konnte nicht bestätigt werden.Die Lokalisation des VHL-Genproduktes ist von Fall zu Fall unterschiedlich, ein Zusammenhang mit den verschiedenen Funktionen des VHL-Gens ist demnach wahrscheinlich. Zusammenfassend läßt sich sagen, daß das VHL TSG eine Rolle bei der Kontrolle der Angiogenese spielt, eine Interaktion mit VEGF ist mehr als wahrscheinlich. Zukünftig sind bei der Aufklärung des Pathomechanismus von Nierenzellkarzinomen deshalb vor allem Studien nötig, die dem VHL TSG als Angiogeneseinhibitor eine zentrale Bedeutung bei der Heilung sporadischer Tumoren mit starker Vaskularisierung zukommen lassen.

Molekulargenetische Untersuchungen von Komponenten des Knorpel-, Knochengewebes

Die Skelettentwicklung wird von zahlreichen genetischen Faktoren gesteuert, die bei Fehlfunktion Ursache unterschiedlichster Erkrankungen des Knorpel-/Knochengewebes sein können. Die Untersuchung von bekannten Kandidatengenen (FGFR3) sowie der Versuch der Identifizierung und Charakterisierung neuer Kandidatengene, ist Inhalt der vorliegenden Arbeit. Das humane FGFR3-Gen stellt ein bekanntes Kandidatengen dar, das bei Veränderungen zu einem Spektrum an Erkrankungen führt (Skelettentwicklungsstörungen, Kleinwuchsformen, nicht-syndromatische Kraniosynostosen, Tumorerkrankungen). Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte die vollständige genomische Struktur des FGFR3-Gens aufgeklärt wurde. Hierdurch konnte ein Set von Primern generiert werden, mit dem die genomische Mutationsanalyse des kompletten FGFR3-Gens möglich war. Die Anwendung dieser umfassenden FGFR3-Diagnostik erbrachte den ersten Nachweis einer HCH-Mutation bei einer Patientin mit Hypochondroplasie (HCH) in der extrazellulären Domäne des FGFR3-Gens. Durch Computer-simulierte Strukturanalyse konnte gezeigt werden, dass die Sekundär- bzw. Tertiärstruktur dieses FGF-Rezeptors durch die Mutation mit großer Wahrscheinlichkeit nicht krankheitsverursachend verändert wird. Die Mutation betrifft jedoch eine mögliche funktionell wichtige N-Glykosylierungsstelle des Rezeptors, was den phänotypischen Effekt der Mutation erklären könnte. In der vorliegenden Arbeit wurde außerdem das Expressionsmuster der zwei bekannten Spleißvarianten (IIIb und IIIc) des Ffgfr3-Gens detailliert untersucht. Anhand von Mausschnitten unterschiedlicher Entwicklungsstadien konnte nachgewiesen werden, dass die IIIc-Variante bei der Maus in erster Linie in Knorpel-/Knochengewebe exprimiert wird, während sich die IIIb-Variante ausschließlich auf epitheliale Strukturen beschränkt. Zur Evaluierung systematischer Ansätze zur Isolation neuer knorpelspezifischer Gene wurden in einer ersten umfassenden Serie - ausgehend von einer humanen fetalen Chondrozyten-cDNA-Bank - die Möglichkeiten eines Knorpel-/Knochen-EST-Projekts untersucht und beurteilt. Die ermittelten Ergebnisse zeigen, dass 5% der untersuchten EST-Klone neue, möglicherweise knorpelspezifische Gene darstellen. Die Ergebnisse sind ein deutlicher Hinweis darauf, dass die verwendete cDNA-Bank zur Isolierung neuer, möglicherweise knorpelspezifischer Gene geeignet ist. Diese Einschätzung wurde dadurch unterstützt, dass ein Klon isoliert und charakterisiert wurde, der im Verlauf der Arbeit als Msx2-interagierender Faktor (MINT) publiziert wurde und in der Knorpel-/Knochen-Entwicklung eine wichtige Rolle spielt.In einem zweiten Versuchsansatz wurde die von Velculescu et al. (1995) veröffentliche SAGE ('serial analysis of gene expression')-Methode - ausgehend von RNA einer humanen Chondrosarkom-Zelllinie - etabliert. Die relativ aufwendige Technik konnte erfolgreich durchgeführt werden. Die Auswertung ergab, dass auch die bei dieser Versuchsreihe verwendete Strategie die Möglichkeit eröffnet, systematisch gewebsspezifische Gene zu isolieren.

Identifikation und Charakterisierung molekularer Komponenten des Verbindungsciliums der Photorezeptoren von Vertebraten

Photorezeptorzellen sind aus funktionell und morphologisch unterschiedlichen Kompartimenten aufgebaut: Einem lichtsensitiven Außensegment, das über ein nichtmotiles modifiziertes Cilium mit dem metabolisch aktiven Innensegment verbunden ist. Die Membranen des Außensegments werden kontinuierlich erneuert. Diese Prozesse erfordern die Translokation von Proteinen der Signaltransduktionskaskade vom Syntheseort im Innensegment in das Außensegment. Der intrazelluläre Transport der Proteine erfolgt durch das Verbindungscilium als einzige direkte cytoplasmatische Brücke zwischen den beiden Kompartimenten. Die Cytoskelettproteine des Verbindungsciliums sind maßgeblich an diesen Transportprozessen, sowie an der Ausbildung der Disk-Membranen und Funktion des Ciliums als Diffusionsbarriere beteiligt. Trotz dieser, für die Aufrechterhaltung der Photorezeptorzelle wichtigen Funktionen, sind bislang nur wenige molekulare Strukturkomponenten des Verbindungsciliums bekannt und funktionell charakterisiert. Um weitere Proteinkomponenten des Ciliums zu identifizieren, wurde eine biochemisch-molekularbiologische Strategie angewandt. Detergenzextrahierte Cilienapparate von Rinderphotorezeptorzellen wurden zur Immunisierung eines Kaninchens eingesetzt. Das affinitätsgereinigte Antiserum, mit Antikörpern gegen Epitope der unterschiedlichen Proteine des Verbindungsciliums, wurde anschließend zur Durchmusterung einer Rattenretina cDNA-Expressionsbank verwendet. Positive Klone wurden isoliert, sequenziert, und deren 3´- und 5´-terminale cDNA-Sequenzen in Datenbankrecherchen analysiert. Neben Klonen, die für Fragmente von bereits bekannten photorezeptorspezifischen Proteinen kodieren, Klonen mit Homologien zu EST´s, und Klonen ohne Homologien zu in Datenbanken enthaltenen Einträgen, wurden 8 cDNA-Klone isoliert, die für bisher unbekannte Cytoskelettproteine des Verbindungsciliums kodieren. Zwei dieser Proteine wurden näher charakterisiert: Das Mikrotubuli-Bindungsprotein EB2p und das Aktin-Bindungsprotein Flightless (Flip). Indirekte Immunofluoreszenzmarkierungen mit Antikörpern gegen EB1p, die mit EB2p kreuzreagieren, wurden EB-Proteine im Verbindungscilium und Basalkörper der Rezeptorzellen lokalisiert. Funktionell trägt Rn EB2p vermutlich zur Stabilisierung der axonemalen Mikrotubuli bei, und dürfte durch Interaktion mit cytoplasmatischem Dynein an retrograden Transportprozessen im Verbindungscilium beteiligt sein. Das Aktin-Bindungsprotein Flightless ist ein cytoplasmatisches Protein mit einer N-terminalen LRR-Domäne, die Protein-Protein- und Protein-Lipid-Interaktionen vermittelt. C-terminal weist Flip zwei Segmente mit Homologien zu Gelsolin auf. Indirekte Immunofluoreszenzmarkierungen und immuno-elektronenmikroskopische Analysen zeigen, daß Flip im Verbindungscilium in der subzellulären Domäne zwischen den axonemalen Mikrotubulipaarringen und der Plasmamembran lokalisiert ist. Im Außensegment der Photorezeptorzellen liegt Flip an den Disk-Membranen assoziiert vor. Flip verfügt vermutlich über zwei Funktion: Membran-assoziiert dürfte es Aktinfilamente an den Membranen der Außensegmente verankern. Im Verbindungscilium hingegen könnte es die ciliären Aktinfilamente modifizieren, die Transportwege für aktin-assoziierte Motorproteine sind. Flip und EB2p sind möglicherweise an den intrazellulären Transportprozessen durch das Verbindungscilium beteiligt.Die in der vorliegenden Arbeit angewandte Methode konnte erfolgreich zur Isolierung bislang unbekannter Proteine des Verbindungsciliums eingesetzt werden. Darüberhinaus wurde Flip auch in den ciliären Sinneszellen des Riechepithels und den mechanorezeptiven Haarzellen des Innenohrs identifiziert. Erkenntnisse über die molekulare Zusammensetzung des ciliären Cytoskeletts von Photorezeptorzellen können daher auch auf andere ciliäre Sinneszellen angewandt werden. Dies ermöglicht einen besseren Einblick in die allgemeine Funktion cilärer Cytoskelettstrukturen sensorischer Zellen.

Primär- und Genstruktur des Hämocyanins der Schnecke Haliotis tuberculata

Als erste komplette Sequenz eines Gastropoden-Hämocyanins wurde das Hämocyanin von Haliotis tuberculata über cDNA vollständig kloniert und sequenziert. Die Primärstruktur besteht aus 3404 Aminosäuren mit einer errechneten Molekülmasse von 392 kDa. Neben der vollständigen Primärstruktur des sezernierten Proteins ist in der cDNA eine Signalsequenz kodiert. Mit Hilfe spezifischer Primer wurde die Genstruktur des HtH1-Gens zwischen der Signalsequenz und dem 3´-UTR über PCR aus genomischer DNA ermittelt. Dies ist die erste bekannte Genstruktur eines Schnecken-Hämocyanins. Das Gen umfaßt etwa 28,6 kb und besteht aus 17 Exons und 16 Introns. Die kodierende Sequenz des Signalpeptids und der acht FUs sind in den Linker-Regionen durch Introns (Linker-Introns) getrennt. Die Signalsequenz von bislang 48 Nukleotiden sowie die Sequenz der funktionellen Domänen HtH1-a, HtH1-f und HtH1-g sind durch 'interne' Introns in zwei bis vier Exons unterteilt. Von der Untereinheit HtH2 wurde über cDNA und genomische PCR die vollständige kodierende Sequenz der funktionellen Domänen HtH2-b bis HtH2-h und ein großer Teil von HtH2-a sequenziert. Die partielle Primärstruktur umfaßt 3307 Aminosäuren. Es fehlen noch etwa 100 Aminosäuren aus dem N-terminalen Bereich von HtH2-a. Das Fragment des HtH2-Gens von 18,3 kb besteht aus 15 Exons und 14 Introns. Die Exon-Größen und die Positionen sowie Phasen der Introns entsprechen exakt den Verhältnissen im HtH1-Gen. Multiple Sequenzalignments und daraus erstellte phylogenetische Stammbäume mit den abgeleiteten Aminosäuresequenzen von HtH1, HtH2 und anderen Mollusken-Hämocyaninen zeigen die Verwandtschaftsverhältnisse der Mollusken-Hämocyanine. Auf der Annahme basierend, daß eine 'molekulare Uhr' existiert, läßt sich mit Hilfe einer Distanzmatrix die Phylogenie der Mollusken-Hämocyanine rekapitulieren und die einzelnen Aufspaltungsereignisse im Verlauf der Evolution der Mollusken datieren.

Charakterisierung synapsenassoziierter Proteine des Haushuhns (Gallus gallus domesticus)

Charakterisierung synapsenassoziierter Proteine des Haushuhns(Gallus gallus domesticus) Die Familie der synapsenassoziierten Proteine (SAP) umfaßt bei Säugern vier Proteine: SAP90 (=PSD-95), SAP97, SAP102 (=PSD-93) und Chapsyn110. Die Proteine enthalten charakteristischerweise drei PDZ-Domänen, eine SH3-Domäne und eine GK-Domäne über die sie mit anderen Proteinen interagieren können. SAP können so Verbindungen zwischen Neurotransmitterrezeptoren und Signaltransduktionsmolekülen sowie dem Zytoskelett herstellen.In dieser Arbeit wurden die synapsenassoziierten Proteine des Huhns charakterisiert. Die cDNAs von SAP90, SAP97 und Chapsyn110 wurden sequenziert. Die cDNA von SAP102 wurde teilweise sequenziert. Die Analyse genomischer DNA durch PCR ergab, daß die SAP90- und SAP97-mRNA von einem Gen transkribiert werden. Die mRNA-Verteilung von SAP90, SAP97 und Chapsyn110 im Gehirn einen Tag alter Küken wurde mit in situ Hybridisierung untersucht. Die Verteilung der SAP90-mRNA und von NMDA-Rezeptoren im Gehirn des Huhns ist sehr ähnlich. Weiterhin wurde bei Küken untersucht, inwieweit SAP bei der Prägung eine Rolle spielen. Der relative mRNA-Gehalt von SAP90, SAP97 und Chapsyn110 wurde 30 Minuten, 5 Stunden und 10 Stunden nach einer akustische Prägung der Küken gemessen. Fünf Stunden nach akustischer Prägung war der Gehalt der SAP90-mRNA, im anterioren lateralen Hyperstriatum ventrale um 13% erhöht. Der mRNA-Gehalt in anderen Regionen und der anderen SAP-Gene war unverändert.