Relationship between pain and anxiety in rats

Clinically, it is well known that neuropathic pain often induces comorbid symptoms such as anxiety. In turn, also anxiety has been associated with a heightened experience of pain. Although, the link between pain and anxiety is well recognized in humans, the neurobiological basis of this relationship remains unclear. Therefore, the aim of the current study was to investigate the influence of neuropathic pain on anxiety and vice versa in rats by assessing not only pain-related behaviour but also by discovering possible key substrates which are responsible for the interrelation of pain and anxiety.rnIn rats with a chronic constriction of the sciatic nerve (CCI model) anxiety-like behaviour was observed. Since anxiety behaviour could be completely abolished after the treatment of the pure analgesic drugs gabapentin and morphine, we concluded that anxiety was caused by the strong persistent pain. Furthermore, we found that the neuropeptides oxytocin and vasopressin were upregulated in the amygdala of CCI rats, and the intra-amygdala treatment of an oxytocin antagonist but not the vasopressin antagonist could reduce anxiety-like behaviour in these animals, while no effect on mechanical hypersensitivity was observed. These data indicate that oxytocin is implicated in the underlying neuronal processes of pain-induced anxiety and helps to elucidate the pathophysiological mechanisms of neuropathic pain. rnTo assess the influence of trait anxiety on pain sensation in rats, we determined mechanical hypersensitivity after sciatic nerve lesion (CCI) in animals selectively bred for high anxiety or low anxiety behaviour. The paw withdrawal thresholds were significantly decreased in high anxiety animals in comparison to low anxiety animals 2 and 3 weeks after surgery. In a second model state anxiety was induced by the sub-chronic injection of the anxiogenic drug pentylentetrazol in naive rats. Pain response to mechanical stimuli was increased after pharmacologically-induced anxiety. These results provided evidence for the influence of both trait and state anxiety on pain sensation. rnThe studies contribute to the elucidation of the relationship between pain and anxiety. We investigated that the neuropathic pain model displays sensory as well as emotional factors of peripheral neuropathy. Changes in expression levels of neuropeptides in the central nervous system due to neuropathic pain may contribute to the pathophysiology of neuropathic pain and its related symptoms in animals which might also be relevant for human scenarios. The results of the current study also confirm that anxiety plays an important role in the perception of pain. rnA better understanding of pain behaviour in animals might improve the preclinical profiling of analgesic drugs during development. The study highlights the potential use of the rat model as a new preclinical tool to further investigate the link between pain and anxiety by determining not only the sensory reflexes after painful stimuli but also the more complex pain-related behaviour such as anxiety.rn

Evaluation von Effektivität und Sicherheit der niederfrequenten, transkraniellen Ultraschalltherapie beim Schlaganfall

In den westlichen Ländern nimmt die Zahl der Schlaganfall-Patienten stetig zu und zählt mittlerweilernzu einer der häufigsten Todesursachen. Derzeit ist die Rekanalisationstherapie mit demrnFibrinolytikum rt-PA die einzig zugelassene Therapie. Die Rekanalisationsrate ist oftmals inkomplettrnund aufgrund von möglichen Blutungskomplikationen die Therapie nicht bei allen Patientenrnmöglich. Daher ist es wichtig, Alternativtherapieansätze (z.B. Ultraschallthrombolyse) zurnentwickeln. Blutgerinnsel können mit Hilfe von Ultraschall in Schwingung gebracht und sornlysiert oder die Wirkung von rt-PA verstärkt werden. Die vorliegende Arbeit hatte die Evaluationrnvon Bioeffekten von 60 kHz Ultraschall an gesundem und ischämischem Hirngewebe zum Ziel.rnNeben tierexperimentellen Methoden kamen auch molekular-biologische Techniken zur Anwendung.rnDie erste Studie beschäftigte sich mit der Wirkung von 60 kHz (Intensität: 0,2 W/cm2 undrnDuty Cycle 50%) auf ischämisches Hirngewebe (permanent ischämisch und nach Reperfusion).rnLediglich nach Reperfusion und Ultraschallbehandlung war das Läsionsvolumen signifikantrnerhöht, so dass von einer besonderen Vulnerabilität des Hirngewebes nach Reperfusionrnauszugehen ist (Penumbraschädigung). In der neurologischen Beurteilung der Tiere zeigte sichrnbei allen Tieren mit permanenter Okklusion und etwa einem Drittel der Tiere nach Reperfusionrnund Ultraschallbehandlung eine Hörminderung. In der anschließenden Studie wurde diernUltraschallintensität erniedrigt und der Duty Cycle variiert. In einer publizierten in vitro Studiernkonnte die zunehmende Lyserate mit steigendem Duty Cycle nachgewiesen werden. DiernAuswertung ergab eine Abhängigkeit des Läsionsvolumens von der Länge des Duty Cycles. Derrndritte Teil der Arbeit befasst sich mit der Wirkung von Ultraschall auf die Genexpression. Hierzurnwurden gesunde Ratten mit Ultraschall verschiedener Frequenzen (60 kHz, 488 kHz und 3 MHz)rntranskraniell behandelt und 4 h bzw. 24 h nach der Behandlung getötet. Proben von ischämischenrnTieren dienten als positive Kontrollen. Aufgrund von Literaturrecherchen wurden mehrerernKandidatengene ermittelt. Die Messung der Ischämieproben ergab eine weitgehende Übereinstimmungrnmit der Literatur. Die Messungen an den mit 60 kHz behandelten Proben ergabenrnkaum Anzeichen für eine differenzielle Genregulation. Die Frequenz von 488 kHz zeigte diernmeisten Regulationen, gefolgt von der Behandlung mit 3 MHz. Dieses Ergebnis lässt vermuten,rndass es sich bei den detektierten Veränderungen um protektive Mechanismen handelt, da diesernFrequenzen bislang im Tierversuch als nebenwirkungsarm beschrieben wurden. Die Auswertungrnvon 60 kHz-Proben mit Affymetrix Arrays ergab lediglich einige wenige differentiell regulierternGene. Die Array-Experimente konnten nicht durch qPCR-Messungen bestätigt werden.

Beeinflussung der menschlichen allergischen Immunantwort durch Allergen-DNA-transfizierte dendritische Zellen

Immunreaktionen gegen Antigene können eine zelluläre Immunantwort, eingeleitet durch TH1-Zellen induzieren oder aber eine antikörpervermittelte humorale Immunantwort induzieren, die von Zellen des TH2-Typs bestimmt sind. Diese unterschiedlichen Immunreaktionen regulieren sich gegenseitig, indem sie sich wechselseitig unterdrücken. Dadurch stellt sich ein Gleichgewicht zwischen den TH1- und TH2-Immunantworten ein. Die Allergie vom Soforttyp ist TH2-dominiert und wird ausgelöst durch die Produktion spezifischer IgE-Antikörper gegen eigentlich harmlose Antigene. Durch die frühe Ausschüttung des Zytokins IL-4 von T-Zellen differenzieren naive allergenspezifische T-Zellen zu TH2-Zellen aus. Diese sezernieren dann ebenfalls IL-4 und auch IL-13, was die B-Zellen zu einer vermehrten Produktion von IgE-Molekülen stimuliert. IgE bindet an den hochaffinen IgE-Rezeptor auf Mastzellen, Basophilen und Eosinophilen. Bei weiterem Allergenkontakt kommt es durch Kreuzvernetzung der Fc-Rezeptoren zur Ausschüttung vo

Mechanismen der Progenitorzell-induzierten Gefäßneubildung und myokardialen Funktionsverbesserung

Entscheidend für die Sauerstoffversorgung im ischämischen Gewebe ist die Bildung von Blutgefäßen. Dieser Vorgang findet im erwachsenen Organismus in Form von Arteriogenese, Angiogenese und Vaskulogenese statt. Die Entdeckung, dass endotheliale Progenitorzellen (EPC) aus dem Knochenmark mobilisiert werden können, um sich im Ischämiegebiet an der Bildung neuer Kapillaren zu beteiligen, eröffnet einen vollkommen neuen therapeutischen Ansatz. In der hier vorliegenden Arbeit konnte in drei unterschiedlichen Tiermodellen, dem Matrigelmodell, dem Hinterlaufischämiemodell und dem Infarktmodell der Nacktmaus gezeigt werden, dass eine Zelltherapie mit EPC die Neovaskularisation steigert und zu einer myokardialen Funktionsverbesserung beiträgt. Der entscheidende Beitrag der Arbeit liegt jedoch in der Erforschung des Zeitraums der Wirkung der Stammzelltherapie. In allen drei Tiermodellen konnte durch ein spezifisches Abtöten der mit der viralen Thymidinkinase (TK) transduzierten EPC der positive Effekt auf die Neovaskularisation gestoppt werden. Im Herzinfarktmodell der Nacktmaus kam es sogar zu einer signifikanten Verschlechterung der Herzfunktion sowie zu einer Vergrößerung des Infarktareals. Dieser Effekt war durch Apoptose der Zellen in der dritten und vierten Woche nach Infarkt und Zellinfusion zu beobachten. Somit besitzen EPC nicht nur eine Rolle in der initialen Freisetzung von Zytokinen, sondern tragen auch langfristig zur Aufrechterhaltung des zelltherapeutischen Effektes bei. Ob hierfür allein der Mechanismus der Differenzierung verantwortlich ist, bleibt in weiteren Untersuchungen abzuklären. Denkbar wäre auch eine Beeinflussung des Remodeling über parakrine Langzeiteffekte. Im zweiten Teil der Doktorarbeit wurde versucht, das eingeschränkte zelltherapeutische Potential von Progenitorzellen von Patienten mit „Koronarer Herzkrankheit“ (KHK) und ischämischer Kardiomyopathie mit Hilfe zweier eNOSTranskriptionsverstärker, „eNOS-enhancer“, zu verbessern. Im Matrigelmodell der Maus konnten wir eine Verbesserung des Neovaskularisationspotentials von Knochenmarkszellen (BMC) von Patienten nach Präinkubation mit dem eNOS-enhancer nachweisen. Auch im Myokardinfarktmodell der Maus konnten eine Verbesserung der Herzfunktion und eine Reduktion der Infarktgröße beobachtet werden. Beim direkten Vergleich der beiden eNOS-enhancer konnte kein Unterschied gefunden werden. Zusammenfassend leistet die hier vorliegende Arbeit einen wichtigen Beitrag zum Verständnis für die Bedeutung von Progenitorzellen im Rahmen der Stammzelltherapie nach Myokardinfarkt. Ferner wurde die Möglichkeit aufgezeigt, durch gezielte Beeinflussung der Progenitorzellen ihr therapeutisches Potential signifikant zu steigern.

Molecular interaction of the human metalloprotease meprin beta with the amyloid precursor protein, ADAM10, and ADAM17 based on proteomics

Die Zinkendopeptidasen Meprin α und β sind Schlüsselkomponenten in patho(physiologischen) Prozessen wie Entzündung, Kollagenassemblierung und Angiogenese. Nach ihrer Entdeckung in murinen Bürstensaummembranen und humanen Darmepithelien, wurden weitere Expressionsorte identifiziert, z.B. Leukozyten, Krebszellen und die humane Haut. Tiermodelle, Zellkulturen und biochemische Analysen weisen auf Funktionen der Meprine in der Epithelialdifferenzierung, Zellmigration, Matrixmodellierung, Angiogenese, Bindegewebsausbildung und immunologische Prozesse hin. Dennoch sind ihre physiologischen Substrate weitgehend noch unbekannt. Massenspektrometrisch basierte Proteomics-Analysen enthüllten eine einzigartige Spaltspezifität für saure Aminosäurereste in der P1´ Position und identifizierten neue biologische Substratkandidaten. Unter den 269 extrazellulären Proteinen, die in einem Substratscreen identifiziert wurden, stellten sich das amyloid precursor protein (APP) and ADAM10 (a disintegrin and metalloprotease 10) als sehr vielversprechende Kandidaten heraus. Mehrere Schnittstellen innerhalb des APP Proteins, hervorgerufen durch verschiedenen Proteasen, haben unterschiedlichen Auswirkungen zur Folge. Die β-Sekretase BACE (β-site APP cleaving enzyme) prozessiert APP an einer Schnittstelle, welche als initialer Schritt in der Entwicklung der Alzheimer Erkrankung gilt. Toxische Aβ (Amyloid β)-Peptide werden in den extrazellulären Raum freigesetzt und aggregieren dort zu senilen Plaques. Membran verankertes Meprin β hat eine β-Sekretase Aktivität, die in einem Zellkultur-basierten System bestätigt werden konnte. Die proteolytische Effizienz von Meprin β wurde in FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)-Analysen bestimmt und war um den Faktor 104 höher als die von BACE1. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass Meprin β die ersten zwei Aminosäuren prozessiert und somit aminoterminal einen Glutamatrest freisetzt, welcher nachfolgend durch die Glutaminylzyklase in ein Pyroglutamat zykliert werden kann. Trunkierte Aβ-Peptide werden nur in Alzheimer Patienten generiert. Aufgrund einer erhöhten Hydrophobie weisen diese Peptide eine höhere Tendenz zur Aggregation auf und somit eine erhöhte Toxizität. Bis heute wurde keine Protease identifiziert, welche diese Schnittstelle prozessiert. Die Bildung der Meprin vermittelten N-terminalen APP Fragmenten wurde in vitro und in vivo detektiert. Diese N-APP Peptide hatten keine cytotoxischen Auswirkungen auf murine und humane Gehirnzellen, obwohl zuvor N-APP als Ligand für den death receptor (DR) 6 identifiziert wurde, der für axonale Degenerationsprozesse verantwortlich ist. rnIm nicht-amyloidogenen Weg prozessiert ADAM10 APP und entlässt die Ektodomäne von der Zellmembran. Wir konnten das ADAM10 Propeptid als Substrat von Meprin β identifizieren und in FRET Analysen, in vitro und in vivo zeigen, dass die Meprin vermittelte Prozessierung zu einer erhöhten ADAM10 Aktivität führt. Darüber hinaus wurde ADAM10 als Sheddase für Meprin β identifiziert. Shedding konnte durch Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) oder durch das Ionophor A23187 hervorgerufen werden, sowie durch ADAM10 Inhibitoren blockiert werden. rnDiese Arbeit konnte somit ein komplexes proteolytisches Netwerk innerhalb der Neurophysiologie aufdecken, welches für die Entwicklung der Alzheimer Demenz wichtig sein kann.rn

Generierung eines BAC-transgenen Mausstamms zur Analyse von Melanomen

Da Tumorerkrankungen ein enormes Gesundheitsproblem in der westlichen Welt darstellen, wird eine Vielzahl neuer Behandlungsstrategien entwickelt. Neuartige Tumor-Therapeutika werden jedoch üblicherweise zunächst an Tiermodellen evaluiert, bevor sie am Menschen angewandt werden.rnIn der vorliegenden Arbeit wurde ein BAC-transgenes Mausmodell generiert, welches als autochthones Melanommodell zur Anwendung kommen sollte.rnZunächst wurde dafür ein DNA-Konstrukt erzeugt. Dieses enthält die Melanom-Onkogene BrafV600E, Cdk4R24C und Mitf deren Expression durch die Tamoxifen-induzierbare Rekombinase CreERT2 kontrollierbar sein sollte. Die Verwendung des Tyrosinasepromoters sollte die melanozytenspezifische Expression der eingebrachten Gene gewährleisten. Ein weiterer Bestandteil des Konstrukts ist ein Luziferase-Gen, welches die Lokalisierung Onkogen-exprimierender Zellen durch in vivo-Biolumineszenz-Imaging erlaubt, da die Onkogen- und Luziferase-Expression durch 2A-Sequenzen gekoppelt sind.rnVor der Generierung der transgenen Tiere sollten in vitro Analysen die Funktionalität des Konstruktteils, bestehend aus den Onkogenen und der Luziferase, klären. Zu diesem Zweck wurde die Zelllinie C22 mit einem Expressionsvektor transfiziert, welcher den genannten Konstruktteil enthielt. Es konnte ein Anstieg der Braf- und Cdk4-Expression auf Protein Ebene, das Vorhandensein von Luziferase-Aktivität und die Aktivierung des MAP-Kinase-Signalwegs nachgewiesen werden. Die Funktionalität des untersuchten Konstruktteils war damit nahegelegt und die Generierung der transgenen Tiere wurde fortgesetzt.rnDie Pronukeus-Injektion resultierte schließlich in 3 Founder-Tieren, die mittels PCR und Southern Blot identifiziert wurden und die Bezeichnung „B6 tg Tyr iOnkogene“ (TyriOn) erhielten. Durch Verkreuzen der Founder-Tiere mit C57BL/6 Mäusen wurden im weiteren Verlauf 3 Linien erzeugt. Bei in vivo Biolumineszenz-Messungen zeigten Tiere der Linie D einen gewissen Grad an Hintergrund-Luziferase-Aktivität, die jedoch durch Tamoxifen-Injektionen verstärkt werden konnte. In den Folgegenerationen ging diese Tamoxifen-induzierte Verstärkung der Luziferase-Aktivität teilweise verloren. Es wurde die Vermutung angestellt, dass funktionelle und nicht-funktionelle Varianten des Transgens an unterschiedlichen Stellen im Genom von Founder D integriert hatten, und sich in den folgenden Generationen auf die Nachkommen verteilten. Die mangelnde Induzierbarkeit betroffener Tiere konnte nicht auf fehlende Integrität der Sequenz „iOnkogene“ in diesen Tieren oder auf nicht-funktionelle loxP-Stellen im Konstrukt zurückgeführt werden.rnTamoxifen-Injektionen führten in TyriOn-D Tieren im Laufe von 15 Monaten nicht zur Entwicklung von Tumoren. Ebenso wenig konnten in TyriOn-D / Cre del Tieren, welche die eingebrachten Onkogene maximal exprimieren sollten, Tumoren detektiert werden. Um zu analysieren, ob die eingebrachten Onkogene die Bildung von Tumoren begünstigen, wurden TyriOn-D Tiere mit dem Melanom-anfälligen Stamm MT/ret verkreuzt. Hierzu konnte im Rahmen dieser Arbeit noch kein Ergebnis erzielt werden. Allerdings konnte in Melanomen von TyriOn-D / MT/ret Tieren Luziferase-Aktivität bei in vivo Biolumineszenz-Messungen und CreERT2 RNA durch RT-PCR detektiert werden.rnTyriOn-D / MT/ret Tiere werden im weiteren Verlauf dieses Projektes nicht nur der Analyse der Melanomentwicklung dienen. Deren Tumore ermöglichen außerdem weitere Untersuchungen bezüglich der Funktionalität des Konstrukts, die teilweise in TyriOn Tieren keine Resultate ergaben.

Evaluation eines humanisierten Mausmodells der allergischen Atemwegsentzündung

Aus der zunehmenden Prävalenz allergischer Erkrankungen vor allem in den Industrienationen ergibt sich ein erhöhter Bedarf an Grundlagenforschung im Bereich von Allergie und Asthma sowie der Entwicklung innovativer Therapiestrategien. In der vorliegenden Dissertation wurden die immundefizienten Mausstämme NOD-Scid und NOD-Scid gc als vielversprechender translationaler Schritt zwischen dem reinen Tiermodell und der Erprobung neuer Therapieansätze an Probanden in klinischen Studien beleuchtet. Im experimentellen Verlauf der Arbeit wurde ein humanisiertes Mausmodell der allergischen Atemwegsentzündung zunächst in immundefizienten NOD-Scid und darauffolgend in NOD-Scid gc Mäusen etabliert. Diese Mausstämme zeichnen sich durch das Nichtvorhandensein von B- und T-Zellen aus. Im NOD-Scid gc Stamm resultiert aus einer zusätzlichen Mutation des Gens für die gamma-Kette des IL-2 Rezeptors der Verlust von natürlichen Killerzellen (NK-Zellen), was die Immunität in diesem Stamm weiter herabsetzt und eine Humanisierung erleichtert. Die Humanisierung der Mäuse erfolgte durch die intraperitoneale Injektion von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs), die unter Anwendung der Ficoll-Dichtezentrifugation aus dem Blut von Probanden isoliert wurden. Für die Gewinnung der PBMCs wurden zum einen Asthma-Patienten mit einer hochgradigen Sensibilisierung gegen Birkenpollen herangezogen. Zum anderen wurden in Kontrollexperimenten PBMCs nicht-allergischer Probanden verwendet. Während sich für den NOD-Scid Stamm 80 Millionen PBMCs als angemessene Transferzahl erwiesen, reichten für die Rekonstitution des NOD-Scid gc Stammes 5 Millionen PBMCs aus. Eine Analyse der Tiere erfolgte 24 Tage nach Injektion der humanen Zellen. Der Transfer der PBMCs allergischer Asthmatiker führte besonders nach additiver Applikation des Birkenallergens sowie des humanen rekombinanten Zytokins IL-4 und darauffolgender nasaler allergener Provokation zu einer starken pulmonalen Entzündung in den Mäusen. Die nasale Allergenprovokation an den Tagen 20-22 nach PBMC-Transfer erwies sich für das Aufkommen der Inflammation als unbedingt erforderlich. Die nasale Provokation mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) mündete in einer herabgesetzten Inflammation ohne Ausprägung einer Atemwegsüberempfindlichkeit (AHR), reduzierten Zellzahlen in der bronchoalveolären Lavage (BAL) sowie verminderten Frequenzen humaner Zellen in den Lungen von Versuchstieren, die mit atopischen PBMCs supplementiert mit Birkenallergen und IL-4 rekonstituiert wurden. Die Allergenabhängigkeit des etablierten Modells wurde anhand von Experimenten untermauert, die verdeutlichten, dass ein Transfer von PBMCs nicht-allergischer Probanden trotz Zugabe des Allergens und humanem IL-4 keine Atemwegsinflammation auslöste. Bei den humanen Zellen, die an Tag 24 nach Rekonstitution in den Mäusen detektiert werden konnten, handelte es sich hauptsächlich um T-Zellen. Innerhalb dieser CD3+ T-Zellen konnten CD4+ und CD8+ T-Zellen differenziert werden. Depletionsexperimente, in denen nach Gewinnung der PBMCs aus dem Blut der Probanden verschiedene T-Zellsubpopulationen (CD3+, CD4+, CD8+) eliminiert wurden, führten zu dem Befund, dass die allergische Atemwegsentzündung in dem System von humanen CD4+ T-Zellen abhängig war. Nach der Etablierung des humanisierten Mausmodells der allergischen Atemwegsentzündung wurde das System zur Analyse des suppressionsfördernden Potentials des HIV-1 - Hüllproteins gp120 genutzt. Die Applikation von gp120 führte zu einer Reduktion der Atemwegsinflammation. Dies äußerte sich in einer Aufhebung der AHR, verminderten Zellzahlen in der BAL sowie dem reduzierten Einstrom humaner T-Zellen in die Lungen der rekonstituierten Tiere. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die anti-inflammatorische Wirkung des gp120 strikt von der Anwesenheit regulatorischer T-Zellen (Tregs) innerhalb der für die Humanisierung genutzten PBMCs abhängig war. Eine Depletion der Tregs vor Transfer in die Mäuse führte zum Verlust der anti-inflammatorischen Effekte des gp120. Diese Ergebnisse sprechen für die Modulation regulatorischer T-Zellen als hoffnungsvolle Maßnahme in der Behandlung allergischer Erkrankungen. Die im Rahmen dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse eröffnen innovative Ansätze zur Analyse neuer Therapiestrategien in einem Testsystem, dass die Erforschung humaner Zellinteraktionen sowie die Wirkung potentieller Arzneistoffe auf humane Zellen unter in vivo Bedingungen erlaubt.