Identification of preferentially targeted tumor-associated antigens in melanoma patients via mRNA stimulation of CD8+ blood lymphocytes

Until now, therapeutic vaccination of cancer patients has mainly relied on rather few T cell epitopes processed from structurally normal shared tumor antigens and presented by frequent HLA alleles. So far the design of these studies has not addressed the individuality of tumor-host interactions, which are not only determined by the antigenic tumor phenotype or the natural HLA polymorphism, but also by the individual T cell repertoire. The procedure described herein was developed to identify the preferential targets of the individual repertoire from a panel of known shared tumor-associated antigens. Lymphocytes were isolated from the peripheral blood of cancer patients or healthy donors and stimulated twice with autologous mRNA-transfected FastDC (Dauer et al., J Immunol. 170:4069, 2003). FastDC were generated from blood monocytes and separately transfected via lipofection with in vitro transcribed mRNAs encoding the panel antigens. Responder lymphocytes were tested on day 12 in a 20-hour IFN-g ELISPOT assay for recognition of 293T cells co-transfected pairwise with plasmids encoding the stimulation antigens and the respective individual’s HLA class I alleles. In a first step, stimulation parameters were optimized for the detection of anti-HCMV pp65 responses. A maximum amplification of pp65-specific CD8+ T cell responses was obtained at a rather low IL-2 concentration (25 IU/ml) and at a minimum APC-to-effector ratio of 1:10. Addition of IL-4, IL-7 or IL-15 did not substantially improve the stimulatory potential. The test was applied to the human melanoma models D05 and MZ2, in both of which multiple T cell-defined antigens had previously been identified by expression screening. Blood lymphocytes were stimulated in parallel with autologous tumor cells and with mRNA-transfected FastDC. In D05, T cell reactivities against three out of eleven epitopes induced by stimulation with tumor cells were also found after stimulation with mRNA-transfected FastDC. Two further T cell target epitopes were identified with mRNA but not with tumor cell stimulation. In MZ2, T cell responses against five distinct epitopes were detected on day 12 after stimulation with mRNA transfectants. The same responses were detectable after stimulation with tumor cells only on day 32. mRNA stimulations against 21 tumor-associated antigens in addition to HCMV pp65 were performed in four healthy individuals. In all cases, CD8+ T cells against HCMV pp65 could be expanded. Among tumor-associated antigens, only reactivity against Melan-A/MART-1 in association with HLA-A*0201 was detectable in one of the donors. The vaccination of patients with targets a priori known to be recognized by their T cell repertoire may help to improve the outcome of therapeutic vaccination.

Untersuchungen zum Einfluss des malignen Melanoms auf die Frequenz und Funktion regulatorischer T-Zellen

Im Immunsystem spielen regulatorische T-Zellen (Treg) eine essentielle Rolle bei der Unterdrückung und Eindämmung von überschüssigen oder schädlichen Immunreaktionen. Ihre suppressiven Eigenschaften wirken aber auch bei Immune Escape Mechanismen von Tumoren mit und können den Erfolg von Tumorimmuntherapien deutlich mindern.rnIn dieser Arbeit konnte zum ersten Mal die Frequenz verschiedener Treg Subpopulationen im peripheren Blut von gesunden Spendern und Melanompatienten in verschiedenen Stadien der Erkrankung verglichen werden. Dabei wurden Treg-Subpopulationen mit den Markerkombinationen CD4+CD25++, CD4+CD25+CD127low, CD4+CD25+HLA DR+, CD4+Foxp3+, CD4+Foxp3+CD25+, CD4+Foxp3+CD127low und CD4+Foxp3+HLA DR+ untersucht. Insbesondere bei den Subpopulationen, die durch die Expression von Foxp3 charakterisiert sind, konnten in Patienten im Spätstadium IV der Melanomerkrankung, verglichen mit Patienten im Stadium I-II oder gesunden Spendern, erhöhte Treg Frequenzen im peripheren Blut festgestellt werden. Diese Funde korrelierten mit der Beobachtung einer verminderten antigenspezifischen T Zellreaktivität in solchen Melanompatienten. Des Weiteren zeigte sich, dass eine DC basierte Tumorantigen-spezifische Immuntherapie bei einem Teil der behandelten Stadium IV Melanompatienten eine Abnahme der Treg Frequenzen im peripheren Blut zur Folge hatte. Dies korrelierte mit Beobachtungen aus vorangegangenen Studien unserer Arbeitsgruppe, bei denen sich zeigte, dass eine solche Immuntherapie die zuvor supprimierten T Zellantworten zumindest vorübergehend wiederherstellen kann. Bei Untersuchungen zur Expression des IL 1-Rezeptors-1 konnte dieser auf Proteinebene als verstärkt exprimierter Aktivierungsmarker auf Treg bestätigt werden. In Anwesenheit von IL-1 wird die Suppressorfunktion der Treg inhibiert. Eine Konversion von humanen Treg zu nicht suppressorischen TH-17-Zellen durch die Kostimulation mit IL 1 konnte dabei nicht nachgewiesen werden. Vielmehr scheint die Induktion von IL 2 die entscheidende Wirkung von IL 1 auf humane Treg und Teff darzustellen.rn