Die Regulation der Ubiquitinligase CHIP durch das Cochaperon BAG2 im zellulären System und im Kontext der replikativen Seneszenz

Eine funktionierende Proteinqualitätskontrolle ist essenziell für die Vitalität einer Zelle. Das dynamische Gleichgewicht zwischen Proteinfaltung und -degradation wird von molekularen Chaperonen aufrechterhalten, deren Aktivität wiederum durch die Interaktion mit zahlreichen Cochaperonen moduliert wird. Das Cochaperon CHIP ist ein zentraler Faktor in Proteintriage-Entscheidungsprozessen, da es als Ubiquitinligase Chaperonsubstrate dem Abbau zuführt und somit die Chaperonmaschinerie direkt mit den Systemen der Proteindegradation verbindet. Um Polypeptide vor einem vorzeitigen Abbau zu schützen, wird die destruktive Aktivität von CHIP durch weitere Cochaperone reguliert. rnIn dieser Arbeit konnte die Hemmung der Ligaseaktivität von CHIP durch das Cochaperon BAG2 mechanistisch erstmals in einem zellulären System nachgewiesen werden. Dazu wurde die humane IMR-90 Fibroblasten Zelllinie verwendet. Die Ubiquitinierungsaktivität von CHIP wurde anhand von HSP72 als Modell-CHIP-Substrat untersucht. Durch die verringerte Ubiquitinierung, und damit dem reduzierten Abbau von HSP72, regulierte BAG2 dessen intrazelluläre Proteinspiegel, ohne dabei selbst eine Hitzeschockantwort zu induzieren. Überexprimiertes BAG2 wirkte sich trotz stabilisierter HSP72-Spiegel bei einem appliziertem Hitzestresses negativ auf die Zellvitalität aus, vermutlich da BAG2 durch die Inhibition von CHIP-vermittelter Ubiquitinierung massiv in das Gleichgewicht zwischen Substratfaltung und -degradation eingreift.rnDa sich die Mechanismen der Proteinqualitätskontrolle in der Alterung stark verändern und sich den wandelnden Bedingungen in der Zelle anpassen, wurde in einem zweiten Teil dieser Arbeit mit Hilfe des IMR-90 Zellsystems als etabliertes Modell zellulärer Seneszenz analysiert, inwieweit sich die Aktivität und die Regulation von CHIP durch BAG2 in der zellulären Alterung ändern. In seneszenten Zellen war HSP72 erheblich weniger ubiquitiniert als in jungen Fibroblasten, was auf eine reduzierte CHIP-Aktivität hinweist. Diese blieb jedoch durch BAG2 weiterhin modulierbar. Die Funktion von BAG2 als Inhibitor der Ubiquitinligase CHIP blieb demnach in seneszenten Zellen bestehen. In gealterten Fibroblasten regulierte BAG2 außerdem die Proteinspiegel des CHIP-Substrates und Seneszenzinitiators p53, was BAG2 eine mögliche Rolle in der Etablierung des Seneszenz-Phänotyps zuspricht. Weiterhin unterlagen die Proteinspiegel der beiden funktionell redundanten CHIP-Modulatoren BAG2 und HSPBP1 in der zellulären Alterung einer reziproken Regulation. In gealterten Mäusen trat die gegenläufige Veränderung der beiden Cochaperone gewebsspezifisch in der Lunge auf. Außerdem waren die BAG2-Proteinspiegel im Hippocampus gealterter Tiere signifikant erhöht.rnZusammenfassend konnte anhand der erzielten Ergebnisse die Funktion von BAG2 als Inhibitor von CHIP im zellulären System bestätigt werden. Außerdem durchlaufen die Aktivität und die Regulation von CHIP einen seneszenzspezifischen Adaptationsprozess, welcher für die Erhaltung der Proteostase in der Alterung relevant sein könnte und in welchem die Funktion von BAG2 als CHIP-Modulator möglicherweise eine wichtige Rolle spielt.rnZukünftige Studien könnten die komplexen Mechanismen weiterführend aufklären, mit denen CHIP-Aktivität reguliert wird. Dies kann helfen, der altersbedingten Abnahme an proteostatischer Kontrolle entgegenzuwirken und aberrante Proteinaggregation in altersassoziierten Erkrankungen vorzubeugen.rn

Relevanz der Methioninoxidation aus evolutionärer Sicht und im akuten oxidativen Stressmodell der Alzheimerschen Krankheit

Im Laufe der Evolution müssen Sauerstoff-metabolisierende Organismen eine Reihe von Anpassungen entwickelt haben, um in der zytotoxischen oxidativen Umgebung der sauerstoff-haltigen Erdatmosphäre überleben zu können. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten vergleichenden Analysen mitochondrial kodierter und kern-kodierter Proteome mehrerer hundert Spezies haben ergeben, dass die Evolution eines alternativen genetischen Codes in Mitochondrien eine moderne Adaptation in diesem Sinne war. Viele aerobe Tiere und Pilze dekodieren in Abweichung vom genetischen Standard-Code das Codon AUA als Methionin. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass diese Spezies dadurch eine massive Akkumulation der sehr leicht oxidierbaren Aminosäure Methionin in ihren Atmungskettenkomplexen erreichen, die generell ein bevorzugtes Ziel reaktiver Sauerstoffspezies sind. Der gewonnene Befund lässt sich widerspruchsfrei nur unter Annahme einer antioxidativen Wirkung dieser Aminosäure erklären, wie sie erstmals 1996 von R. Levine anhand von Oxidationsmessungen in Modellproteinen postuliert worden war. In der vorliegenden Arbeit wird diese Hypothese nun direkt mittels neuartiger Modellsubstanzen in lebenden Zellen bestätigt. Die durchgeführten bioinformatischen Analysen und zellbiologischen Experimente belegen, dass kollektive Proteinveränderungen die Triebkraft für die Evolution abweichender genetischer Codes sein können.rnDie Bedeutung von oxidativem Stress wurde darüber hinaus auch im Referenzrahmen einer akuten oxidativen Schädigung im Einzelorganismus untersucht. Da oxidativer Stress in der Pathogenese altersassoziierter neurodegenerativer Erkrankungen wie der Alzheimerschen Krankheit prominent involviert zu sein scheint, wurden die Auswirkungungen von Umwelt-induziertem oxidativem Stress auf den histopathologischen Verlauf in einem transgenen Modell der Alzheimerschen Krankheit in vivo untersucht. Dabei wurden transgene Mäuse des Modells APP23 im Rahmen von Fütterungsversuchen einer lebenslangen Defizienz der Antioxidantien Selen oder Vitamin E ausgesetzt. Während die Selenoproteinexpression durch die selendefiziente Diät gewebespezifisch reduziert wurde, ergaben sich keine Anzeichen eines beschleunigten Auftretens pathologischer Marker wie amyloider Plaques oder Neurodegeneration. Es war vielmehr ein unerwarteter Trend hinsichtlich einer geringeren Plaquebelastung in Vitamin E-defizienten Alzheimermäusen zu erkennen. Auch wenn diese Daten aufgrund einer geringen Versuchstiergruppengröße nur mit Vorsicht interpretiert werden dürfen, so scheint doch ein Mangel an essentiellen antioxidativen Nährstoffen die Progression in einem anerkannten Alzheimermodell nicht negativ zu beeinflussen.rn

Metabolismus von Psychopharmaka durch das Cytochrom P450-Enzymsystem im Alter

Altern geht mit einer Reihe physiologischer Veränderungen einher. Da in höherem Lebensalter überdurchschnittlich viele Arzneistoffe eingenommen werden und häufig mehrere Erkrankungen gleichzeitig vorliegen, können Auffälligkeiten in den Arzneimittelkonzentrationen im Blut nicht nur altersbedingt, sondern auch krankheitsbedingt oder durch Arzneimittelwechselwirkungen verursacht sein.rnrnDie vorliegende Arbeit untersucht die Fragestellung, ob der Arzneimittelmetabolismus bei Alterspatenten generell, oder nur bei Patienten mit Multimorbidität und –medikation verändert ist, und in welchem Lebensalter diese Veränderungen einsetzen. Im Mittelpunkt stand dabei die Frage, ob die Aktivitäten distinkter Arzneimittel-abbauender Enzyme der Cytochrom P450-Enzym-Familie (CYP) verändert sind. Da viele Psychopharmaka nur bei Patienten im Alter zwischen 18 und 65 Jahren zugelassen sind, wurde die Hypothese geprüft, dass sich Patienten im Alter über und unter 65 Jahren in ihren Medikamentenspiegeln unterscheiden.rnrnFür die Untersuchungen wurde eine Datenbank aus Blutspiegelmessungen erstellt, die im Rahmen des pharmakotherapiebegleitenden TDM erhoben worden waren. Die Blutspiegel stammten von insgesamt 4197 Patienten, die mit Amisulprid, Aripiprazol, Citalopram, Clozapin, Donepezil, Escitalopram, Mirtazapin, Quetiapin, Risperidon, Sertralin, Venlafaxin oder Ziprasidon behandelt wurden. Die Messungen wurden ergänzt mit Angaben aus den TDM-Anforderungsscheinen bezüglich Tagesdosis, Begleitmedikamenten, Schweregrad der Erkrankung, Therapieerfolg und Verträglichkeit der Medikation. Zusätzlich wurden klinische Befunde der Leber- und Nierenfunktion einbezogen, sowie Angaben zur Berechnung des BMI. Die in vivo-CYP-Enzymaktivitäten wurden anhand von metabolischen Ratios (Serumkonzentrationen Metabolit/ Serumkonzentration Muttersubstanz) beurteilt.rnrnIm Mittel stieg der Schweregrad der Erkrankung mit dem Alter und der Therapieerfolg verschlechterte sich. Dies betraf im Einzelnen nur Patienten, die mit Amisulprid oder Clozapin behandelt worden waren. Ältere Patienten litten häufiger an Nebenwirkungen als jüngere.rnUnter Aripiprazol, Quetiapin, Sertralin und Venlafaxin erreichten Alterspatienten mit niedrigeren Tagesdosen gleiche Therapieerfolge wie jüngere Patienten.rnPatienten, die mit Clozapin oder Amisulprid behandelt wurden, zeigten im Alter schlechtere Behandlungserfolge bei gleicher (Clozapin) bzw. niedrigerer (Amisulprid) Tagesdosis.rnTherapieerfolg und mittlere Tagesdosis änderten sich bei Patienten, die Ziprasidon, Donepezil, Citalopram, Escitalopram und Mirtazapin einnahmen, nicht altersabhängig.rnrnAltersabhängige Unterschiede der Serumspiegel zeigten sich für Amisulprid, Aripiprazol, Donepezil, Mirtazapin, Desmethylmirtazapin, Quetiapin und DesmethylsertralinrnAllerdings lagen die Altersgrenzen außer bei Donepezil deutlich niedriger als die gängig angenommene, nämlich bei 35 Jahren (Aripiprazol), 70 Jahren (Donepezil), 55 Jahren (D-Sertralin), 41 Jahren (Amisulprid), 49 Jahren (Quetiapin) und 58 Jahren (Mirtazapin).rnEs bestand kein Zusammenhang zwischen dem Auftreten veränderter Serumspiegel im Alter und dem Verteilungsvolumen, der Plasmaproteinbindung oder der Eliminationshalbwertszeit der untersuchten Wirkstoffe.rnrnBei Patienten ohne Comedikation fand sich in keinem Fall eine altersabhängige Veränderung der Ratio. Es ergab sich daher kein Hinweis auf eine Veränderung der CYP-Aktivität im Alter. Die Einnahme von Comedikation nahm mit dem Alter zu, hierfür ließ sich eine Altersgrenze von 49 Jahren definieren. Unter Polytherapie wurden Veränderungen der CYP-Aktivität beobachtet.rnrnDer Einfluss veränderter Leber- oder Nierenfunktion auf die Biotransformation von Pharmaka wurde anhand von Serumspiegeln von Patienten, die mit Donepezil, Venlafaxin, Citalopram oder Escitalopram behandelt wurden, untersucht. rnBei keinem Wirkstoff wurden unter auffälligen Leber- oder Nierenparametern signifikant veränderte Serumspiegel gemessen.rnEine Abhängigkeit der Serumspiegel vom Körpergewicht wurde nur für Desmethylsertralin gefunden. Die Spiegel waren bei Patienten mit einem Body Mass Index unter 20 signifikant höher als bei Patienten mit einem Index über 20. Aufgrund der kleinen Fallgruppe und der Tatsache, dass der Serumspiegel der Muttersubstanz nicht stieg, konnte nicht zwingend von einem Alterseinfluss aufgrund der veränderten Körperzusammensetzung ausgegangen werden.rnInsgesamt ergaben sich aus den Untersuchungen Hinweise auf moderate altersabhängige Veränderungen der Pharmakokinetik. Es ließen sich allerdings keine allgemeinen Dosierempfehlungen für Alterspatienten ableiten. Es zeigte sich jedoch, dass mit altersabhängigen Veränderungen der Pharmakokinetik bereits nach dem 50. Lebensjahr zu rechnen ist. Weitere Untersuchungen sollten auch den Alterseffekt auf gastrointestinale Transporter einbeziehen, die die aktive Aufnahme von Arzneistoffen ins Blut bewerkstelligen. Unklar ist auch die Rolle des Alterns auf die Aktivität des P-Glykoproteins. rn