Charakterisierung der Vinorin-Synthase aus Rauvolfia serpentina durch Reinigung, Expression, Mutation und Kristallisation

ABSTRACTDie vorliegende Arbeit befasste sich mit der Reinigung,heterologen Expression, Charakterisierung, molekularenAnalyse, Mutation und Kristallisation des EnzymsVinorin-Synthase. Das Enzym spielt eine wichtige Rolle inder Ajmalin-Biosynthese, da es in einerAcetyl-CoA-abhängigen Reaktion die Umwandlung desSarpagan-Alkaloids 16-epi-Vellosimin zu Vinorin unterBildung des Ajmalan-Grundgerüstes katalysiert. Nach der Reinigung der Vinorin-Synthase ausHybrid-Zellkulturen von Rauvolfia serpentina/Rhazya strictamit den fünf chromatographischen TrennmethodenAnionenaustauschchromatographie an SOURCE 30Q, HydrophobeInteraktionen Chromatographie an SOURCE 15PHE,Chromatographie an MacroPrep Ceramic Hydroxyapatit,Anionenaustauschchromatographie an Mono Q undGrößenausschlußchromatographie an Superdex 75 konnte dieVinorin-Synthase aus 2 kg Zellkulturgewebe 991fachangereichert werden.Das nach der Reinigung angefertigte SDS-Gel ermöglichte eineklare Zuordnung der Protein-Bande als Vinorin-Synthase.Der Verdau der Enzymbande mit der Endoproteinase LysC unddie darauffolgende Sequenzierung der Spaltpeptide führte zuvier Peptidsequenzen. Der Datenbankvergleich (SwissProt)zeigte keinerlei Homologien zu Sequenzen bekannterPflanzenenzyme. Mit degenerierten Primern, abgeleitet voneinem der erhaltenen Peptidfragmente und einer konserviertenRegion bekannter Acetyltransferasen gelang es, ein erstescDNA-Fragment der Vinorin-Synthase zu amplifizieren. Mit derMethode der RACE-PCR wurde die Nukleoidsequenzvervollständigt, was zu einem cDNA-Vollängenklon mit einerGröße von 1263 bp führte, der für ein Protein mit 421Aminosäuren (46 kDa) codiert.Das Vinorin-Synthase-Gen wurde in den pQE2-Expressionsvektorligiert, der für einen N-terminalen 6-fachen His-tagcodiert. Anschließend wurde sie erstmals erfolgreich in E.coli im mg-Maßstab exprimiert und bis zur Homogenitätgereinigt. Durch die erfolgreiche Überexpression konnte dieVinorin-Synthase eingehend charakterisiert werden. DerKM-Wert für das Substrat Gardneral wurde mit 20 µM, bzw.41.2 µM bestimmt und Vmax betrug 1 pkat, bzw. 1.71 pkat.Nach erfolgreicher Abspaltung des His-tags wurden diekinetischen Parameter erneut bestimmt (KM- Wert 7.5 µM, bzw.27.52 µM, Vmax 0.7 pkat, bzw. 1.21 pkat). Das Co-Substratzeigt einen KM- Wert von 60.5 µM (Vmax 0.6 pkat). DieVinorin-Synthase besitzt ein Temperatur-Optimum von 35 °Cund ein pH-Optimum bei 7.8.Homologievergleiche mit anderen Enzymen zeigten, dass dieVinorin-Synthase zu einer noch kleinen Familie von bisher 10Acetyltransferasen gehört. Alle Enzyme der Familie haben einHxxxD und ein DFGWG-Motiv zu 100 % konserviert. Basierendauf diesen Homologievergleichen und Inhibitorstudien wurden11 in dieser Proteinfamilie konservierte Aminosäuren gegenAlanin ausgetauscht, um so die Aminosäuren einer in derLiteratur postulierten katalytischen Triade(Ser/Cys-His-Asp) zu identifizieren.Die Mutation aller vorhandenen konservierten Serine undCysteine resultierte in keiner Mutante, die zumvollständigen Aktivitätsverlust des Enzyms führte. Nur dieMutationen H160A und D164A resultierten in einemvollständigen Aktivitätsverlust des Enzyms. Dieses Ergebniswiderlegt die Theorie einer katalytischen Triade und zeigte,dass die Aminosäuren H160A und D164A exklusiv an derkatalytischen Reaktion beteiligt sind.Zur Überprüfung dieser Ergebnisse und zur vollständigenAufklärung des Reaktionsmechanismus wurde dieVinorin-Synthase kristallisiert. Die bis jetzt erhaltenenKristalle (Kristallgröße in µm x: 150, y: 200, z: 200)gehören der Raumgruppe P212121 (orthorhombisch primitiv) anund beugen bis 3.3 Å. Da es bis jetzt keine Kristallstruktureines zur Vinorin-Synthase homologen Proteins gibt, konntedie Struktur noch nicht vollständig aufgeklärt werden. ZurLösung des Phasenproblems wird mit der Methode der multiplenanomalen Dispersion (MAD) jetzt versucht, die ersteKristallstruktur in dieser Enzymfamilie aufzuklären.

Charakterisierung zentraler Enzyme des Ajmalin-Biosynthesewegs aus Rauvolfia serpentina

In der vorliegenden Arbeit werden verschiedene Enzyme des Ajmalin-Biosynthesewegs aus der Arzneipflanze Rauvolfia serpentina charakterisiert. Dabei handelt es sich einerseits um die Vomilenin-Reduktase und die 2β-(R)-1.2-Dihydrovomilenin-Reduktase. Es wurden Versuche unternommen, diese Enzyme heterolog zu exprimieren. Eine aktive Expression konnte nicht durchgeführt werden, was mit großer Wahrscheinlichkeit auf Modifikationen in der Ursprungspflanze zurückzuführen ist. Allerdings bestehen auch Zweifel, ob es sich bei den Volllängenklonen um die cDNAs der Reduktasen handelte. Zum anderen sollte eine Strukturaufklärung der Vinorin-Synthase im Komplex mit Liganden vorgenommen werden. Die erhaltenen Proteinkristalle stellten sich als derart empfindlich gegenüber Schwankungen ihrer Umgebung und dem Eindringen von Liganden in den Kristall dar, dass eine erfolgreiche Komplexierung und strukturelle Beschreibung durch Röntgenstrukturanalyse nicht möglich war. Weiterhin wurden Mutagenesestudien mit der Vinorin-Synthase durchgeführt. Eine Asparaginsäure bildet eine Salzbrücke mit einem Arginin. Alle durchgeführten Mutationen dieser Asparaginsäure führten zu einem absoluten Aktivitätsverlust. Eine Funktion des Asparagins 277, als mitverantwortliche Aminosäure zur Bindung des Co-Substrats Acetyl-CoA, konnte anhand der Mutagenesestudien ausgeschlossen werden. Weiterhin ist es erstmals gelungen die Polyneuridinaldehyd-Esterase aus Rauvolfia serpentina zu kristallisieren. Schließlich konnte die dreidimensionale Struktur der Polyneuridinaldehyd-Esterase aufgeklärt werden. Es folgte eine Beschreibung struktureller Eigenschaften der Polyneuridinaldehyd-Esterase im Vergleich zu einem Modell, welches durch ein „Molecular Modelling“ erstellt wurde.

Untersuchungen zum Einfluss des HMG-CoA-Reduktase-Inhibitors Lovastatin auf die Toxizität ionisierender Strahlung sowie des Anthrazyklinderivats Doxorubicin im Mausmodell

Hintergund: HMG-CoA-Reduktase-Inhibitoren (Statine) sind klinisch etablierte Cholesterinsenker. Über die Inhibition der intrinsischen Cholesterinbiosynthese hinaus zeigen sie sogenannte pleiotrope biologische Effekte. Ein Großteil dieser Wirkungen wird auf die Inhibition kleiner Ras homologer GTPasen (Rho GTPasen) zurückgeführt. In vitro schützt das Statinderivat Lovastatin (Lova) primäre humane Endothelzellen vor der Zytotoxizität von ionisierender Strahlung (IR) und dem Krebsmedikament Doxorubicin (Doxo). Zielsetzung: Die Relevanz dieser Befunde für ein in vivo Mausmodell sollte in der vorliegenden Arbeit überprüft werden. Dafür wurden BALB/c-Mäuse mit IR oder Doxo behandelt und der Einfluss einer Kobehandlung mit Lova auf verschiedene Toxizitätsendpunkte untersucht (24 h nach einer einzelnen hohen Dosis IR (i), 14 Tage nach zwei geringen Dosen IR (ii), 48 h nach einer einzelnen hohen Dosis Doxo (iii), sowie 8 Tage nach drei niedrigen Dosen Doxo (iv)). Eine mögliche gleichzeitige Protektion von Tumorzellen durch die Statingabe wurde in einem Xenotransplantationsexperiment überprüft (v), in dem das gleiche Behandlungsschema wie bei iv angewendet wurde. Ergebnisse: Es konnte gezeigt werden, dass eine Statinbehandlung Normalgewebe vor Doxo- und IR-induzierter Toxizität schützt, ohne gleichzeitig protektiv auf transformierte Zellen zu wirken. Dieser Effekt ist wahrscheinlich von einer Inhibition der kleinen GTPasen Rac1 und RhoA abhängig und einer daraus folgenden Modifizierung der DNA-Schadensantwort. i: Die Statinvorbehandlung der Mäuse hatte keinen Einfluss auf die Bildung von initialen IR-induzierten DNA-Doppelstrangbrüchen (DSB) in der Leber. Die Lova-Behandlung wirkte sich jedoch auf IR-induzierte Stressantworten aus, was sich in einer Minderung der Expression von Inflammations- und Fibrosesurrogatmarkern in Leber und Darm widerspiegelte. ii: In der Lunge der Tiere wurde ein Anstieg von molekularen Inflammations- und Fibrosesurrogatmarkern detektiert, der bei Statinkobehandlung ausblieb. Zudem verhinderte die Kobehandlung mit Lova eine IR-induzierte Abnahme der Thrombozytenzahl, ohne sich auf die durch IR verringerte Leukozytenzahl im Blut auszuwirken. iii: Die Verabreichung einer hohen Dosis Doxo induzierte DSB-Formation in der Leber. Die Statinvorbehandlung reduzierte deren Menge um ca. 50 %. Dieser genoprotektive Effekt war unabhängig von der Entstehung reaktiver Sauerstoffspezies sowie einer Änderung des Doxo-Imports oder Exports. Die Expression von proinflammatorischen und profibrotischen Genen fiel besonders in der Leber und im Herzen durch die Lova-Kobehandlung geringer aus, als in der nur mit Doxo behandelten Gruppe. Zudem verringerte Lova die durch Doxo induzierte Hochregulation von für den AP1-Komplex kodierenden Genen sowie von Zellzykluskontrollfaktoren. Die Lova-Vorbehandlung führte darüber hinaus im Herzen zu einem reduzierten mRNA-Spiegel der Topoisomerasen II α und β. iv: Es konnten schwere Herz- und Leberschäden detektiert werden (gemessen an Gldh-, Gpt- sowie cTn-I-Serumkonzentrationen), die bei einer Kobehandlung mit dem Statin nicht auftraten. Die Lova-Kobehandlung verhinderte außerdem eine durch die Doxo-Behandlung verringerte Leukozytenzahl. Molekulare Marker für frühe fibrotische Ereignisse, sowie für Inflammation und Hypertrophie waren in der Leber und im Herzen nach der Doxo-Behandlung erhöht. Das Statin war auch hier in der Lage, diese toxischen Wirkungen des Anthrazyklins zu mindern. Auch die Doxo-induzierte Expression von Surrogatmarkern für Zellantworten auf oxidativen Stress wurde in der Leber abgeschwächt. In der Leber und im Herzen wiesen die mit Doxo behandelten Tiere höhere mRNA Spiegel von an Zellzykluskontrolle beteiligten Faktoren sowie von DNA-Reparatur und Fremdstoffmetabolismus assoziierten Genen auf. Am stärksten wurde die Expression von Topoisomerase II alpha - ein molekularer Marker für Zellproliferation und bedeutsame Zielstruktur von Doxo - in der Leber hochreguliert. Die Statin-Kobehandlung verhinderte all diese Doxo-induzierten Expressionsänderungen. Im Gegensatz zur Leber wurde die Top2a-mRNA Menge im Herzen durch die Doxo-Applikation reduziert. Auch hier bewirkte die Kobehandlung mit dem Statin, dass die Expression nahe dem Kontrollniveau blieb. v: Die Kobehandlung mit Lova führte zu keinem Schutz der Tumorzellen vor Doxo, sondern erhöhte sogar dessen antineoplastisches Potential.rnFazit: Die Erkenntnisse aus vorhergegangenen in vitro Versuchen konnten zum großen Teil auf die in vivo Situation im Mausmodell übertragen werden. Sie stehen im Einklang mit Ergebnissen anderer Gruppen, welche die Inhibition kleiner GTPasen mit einer geringeren, durch zytotoxische Substanzen induzierten, Inflammation und Fibrose korrelieren konnten. Eine Kobehandlung mit Lova während einer Krebstherapie erscheint somit als vielversprechende Möglichkeit Doxo- oder IR-induzierte Nebenwirkungen auf Normalgewebe zu mildern.

Reinigung der Vinorin-Synthase aus Zellkulturen von Rauvolfia serpentina

Abstrakt - DeutschThema: Reinigung der Vinorin-Synthase aus Zellkulturen von Rauvolfia serpentina Die Arbeit befaßte sich mit der Reinigung und Charakterisierung des Enzyms Vinorin-Synthase aus Zellkulturen von Rauvolfia serpentina. Dieses Acetyl-Coenzym-A-abhängige Enzym katalysiert im Biosyntheseweg des Alkaloids Ajmalin die Umwandlung von 16-epi-Vellosimin zu Vinorin. Mit Hilfe eines neu entwickelten Enzymaktivitätstests ist eine einfache und schnelle qualitative sowie quantitative Bestimmung der Aktivität der Vinorin-Synthase möglich. Das Molekulargewicht der Vinorin-Synthase wurde durch Größenausschlußchromatographie an Superdex 75 zu 43 kD ermittelt. Das entwickelte Reinigungsschema mit den vier säulenchromatographischen Reinigungsschritten Anionenaustauschchromatographie an SOURCE 30Q, Chromatographie an Hydroxyapatit, Anionenaustauschchromatographie an Mono Q und Chromatofokussierung an Mono P führte zu einer 340fachen Anreicherung der Vinorin-Synthase. Das nach der Reinigung durchgeführten gelelektrophoretischen Untersuchungen ermöglichten keine Zuordnung einer Bande zur Bande der Vinorin-Synthase. Mögliche Ursachen für die Nichtzuordnung einer Bande im SDS-Gel zur Vinorin-Synthase sind in einer möglichen Überlagerung eines Fremdprotein mit der Vinorin-Synthase, eine niedrige Expression der Vinorin-Synthase, die eine deutlich bessere Anreicherung erfordern würde oder der Aufbau des Proteins aus Untereinheiten, in die es während der Behandlung mit SDS zerfällt, gegeben.

Untersuchungen zur induzierbaren Expression des Adhäsionsmoleküls E-Selektin und dessen potentieller Bedeutung bei der Tumormetastasierung

In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass sowohl die durch TNFalpha-, als auch durch Röntgenstrahlen vermittelte Expression des Adhäsionsmoleküls E-Selektin in Endothelzellen durch kleine GTPasen der Rho-Proteinfamilie reguliert ist. Hemmung dieser kleinen G-Proteine z.B. durch HMG-CoA Reduktase-Inhibitoren (Statine) oder clostridiale Toxine führt zu verminderter Expression von E-Selektin in humanen Endothelzellen (HUVEC; EA.hy-926). Aus den in der Arbeit erhaltenen Ergebnissen kann außerdem die Schlussfolgerung gezogen werden, dass die Regulation der zytokininduzierten E-Selektin-Genexpression von der gamma-Strahlen-vermittelten Expression des E-Selektingens differiert. Für die strahleninduzierte endotheliale E-Selektin-Expression scheint beispielsweise der Transkriptionsfaktor AP-1 als ein weiterer Kontrollfaktor neben NF-kappaB zu fungieren. Des Weiteren konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass eine gesteigerte E-Selektin-Proteinexpression mit erhöhter Tumorzelladhäsion und -transmigration an bzw. durch humane Endothelzellen korreliert. Hemmung der TNFalpha- bzw. gamma-Strahlen-induzierten Expression von E-Selektin durch Statine oder Retinsäuren ist ausreichend, sowohl Tumorzelladhäsion als auch Tumorzelldiapedese zu reduzieren. Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass das Adhäsionsmolekül E-Selektin eine vielversprechende Zielstruktur ist, über deren kontrollierte Beeinflussung es auch in vivo möglich sein sollte, das Risiko der Metastasierung zu reduzieren. Mit Statinen und Retinsäurederivaten wurden somit Pharmaka identifiziert, die durch Hemmung der Rho-regulierten E-Selektin-Expression der Tumorzellmetastasierung vorbeugen könnten. Um diese Hypothese in zukünftigen tierexperimentelle Studien zu bestätigen, wurde im Rahmen dieser Arbeit mit der Generierung transgener Tiermodelle begonnen.

Zuckertransport und Regulation des Hexosestoffwechsels bei Oenococcus oeni

Das Milchsäurebakterium Oenococcus oeni, welches für den biologischen Säureabbau im Wein eingesetzt wird, verstoffwechselt Hexosen über den Phosphoketolaseweg. Dabei können beträchtliche Mengen Acetat entstehen. Die Ursachen dafür wurden untersucht, insbesondere der Fructosestoffwechsel. Außerdem wurde der Hexosetransport untersucht, über den bei O. oeni noch nichts bekannt war. Die Aufnahme von Hexosen in die Zelle erfolgt mit hoher Affinität (KM=10 µM) über einen Symport mit H+, aber mit sehr niedriger spezifischer Aktivität (Vmax=9 U / g TG). Zusätzlich werden Hexosen mit ausreichender Aktivität über (vermutlich erleichterte) Diffusion in die Zelle transportiert, allerdings nur bei hohen Hexosekonzentrationen. Es wurden Gene gefunden, die für ein Hexose- Phosphotransferasesystem kodieren, welches in O. oeni keine bedeutende Rolle beim Transport spielt, aber vermutlich eine regulative Funktion hat. Zur Bildung von Essigsäure tragen verschiedene Faktoren bei: Der Ethanolweg, der in der heterofermentativen Milchsäuregärung die Reoxidation von NAD(P)H bewerkstelligt, ist durch die niedrige spezifische Aktivität der Acetaldehyddehydrogenase limitiert. Diese Limitierung wird noch verstärkt, wenn die zellulären Gehalte von Coenzym A aufgrund von Pantothensäuremangel niedrig sind. O. oeni umgeht durch Bildung von Erythrit die Limitierung, und Acetylphosphat wird nicht zu Ethanol reduziert, sondern als Acetat ausgeschieden. Bei Cofermentation von Hexosen mit externen Elektronenakzeptoren, wie Fructose, Pyruvat oder Sauerstoff, werden letztere zur Reoxidation von NAD(P)H genutzt, und als Folge wird Acetat ausgeschieden. Der Fluss von Fructose in den Phosphoketolaseweg wird durch das Enzym Phosphoglucoseisomerase verhindert, wenn dieses durch 6-Phosphogluconat gehemmt wird. Als Konsequenz wird Fructose im Mannitweg reduziert, was die Bildung von Essigsäure im Phosphoketolaseweg fördert. Bei niedrigen Wachstums- und Stoffwechselraten, z.B. bei C-Limitierung, ist der Ethanolweg nicht limitierend für den Stoffwechsel, und Hexosen werden über heterofermentative Milchsäuregärung umgesetzt, ohne daß Acetat entsteht. Pyruvat kann gleichzeitig als Elektronenakzeptor und als Energiequelle dienen: O. oeni ist in der Lage, Pyruvat mittels Disproportionierung zu Lactat und Acetat+CO2 zu fermentieren, und dabei Energie zu konservieren (0,5 ATP / Pyruvat).

Atherosklerose und Apoptose

Subendothelial in den Arterienwänden abgelagertes LDL kann einer enzymatischen Modifikation unterliegen, die es in einen cytotoxischen Partikel überführt. In vitro Behandlung von LDL mit Proteasen (Trypsin) und Cholesterinesterase führt zu einem dem läsionalen LDL ähnlichen Produkt. Die Behandlung von humanen Endothelzellen mit enzymatisch verändertem LDL (E-LDL), das einen hohen Gehalt an freiem Cholesterin und freien Fettsäuren aufweist, führt zur Auslösung der Apoptose via ASK1 (apoptosis signal-regulating kinase 1) –abhängiger p38-Phosphorylierung. Durch eine Aktivierung der Effektor-Caspasen-3/-7 kommt es zur Fragmentierung der DNA und zur Spaltung des nukleären Enzyms Poly-(ADP-ribose)-Polymerase. Phosphatidylserin ist an der äußeren Zellmembran mittels Annexin-Bindung detektierbar. Natives oder oxidiertes LDL induziert bei gleicher Konzentration keinen programmierten Zelltod. In Depletions- und Rekonstitutionsexperimenten wurden freie Fettsäuren aus E-LDL als Auslöser der Apoptose identifiziert. In nativem LDL ist der Anteil an freien Fettsäuren gering, deshalb ist das Lipoprotein nicht cytotoxisch. E-LDL induziert weiterhin eine Erhöhung bzw. eine Hemmung der transkriptionellen Aktivität eines AP-1- bzw. NF-κB-Luciferase Reporterplasmids. Die Ausschaltung von ASK1 mittels RNA-Interferenz bzw. die Hemmung von p38 mit dem Inhibitor SB203580 rettet die Zellen vor dem programmierten Zelltod. E-LDL kann in Endothelzellen oxidativen Stress auslösen. Durch Vorbehandlung mit N-Acetyl-Cystein wird die Aktivierung sowohl von ASK1 als auch von p38 unterdrückt.

Oxidierte Kohlenwasserstoffe in der oberen Troposphäre: Kinetische Untersuchungen zum Abbau und Einfluss auf HO x und Ozon-Chemie

Der erste Teil dieser Arbeit befasst sich mit der Kinetik der Reaktion des OH-Radikals mit Glykolaldehyd (HOCH2CHO). Die Geschwindigkeitskonstante k1 wurde für diese Reaktion temperaturabhängig bestimmt. Durch gepulste Photolyse wurden OH-Radikale erzeugt. Anschließend wurde die laserinduzierte Fluoreszenz der OH-Radikale bei 309 nm detektiert. Die ermittelte Geschwindigkeitskonstante k1 für die Reaktion von OH mit HOCH2CHO von (8,0 ± 0,8) x 10-12 cm3 Teilchen-1 s-1 erweist sich für den Temperaturbereich von 240 K < T < 362 K als temperaturunabhängig. Zwischen 60 und 250 Torr kann zudem keine Druckabhängigkeit für k1 beobachtet werden. Die unerwartet niedrigere Geschwindigkeitskonstante für die betrachtete Reaktion im Vergleich zur Reaktion von OH mit CH3CHO konnte anhand von Überlegungen zur Korrelation zwischen der C-H-Bindungsstärke und dem H-Abstraktionskanal erklärt werden. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Photochemie von Aceton (CH3C(O)CH3), Methylethylketon (C2H5C(O)CH3, MEK) und Acetylbromid (CH3C(O)Br) betrachtet. Für die Photolyse von Aceton (bei 248 nm und 266 nm), MEK (bei 248 nm) und Acetylbromid (bei 248 nm) wurden bei 298 ± 3 K druckabhängig zwischen 5 und 1600 Torr N2 Quantenausbeuten für die Methylbildung (Phi(CH3)) bestimmt. Nach gepulster Photolyse der betrachteten Moleküle wurden die transienten Absorptionssignale der Methylradikale bei 216,4 nm verfolgt. Die Quantenausbeuten wurden relativ zur Photolyse von Methyliodid (CH3I) unter gleichen Reaktionsbedingungen ermittelt. Die erhaltenen Quantenausbeuten für CH3-Radikale nehmen für die beiden Systeme Aceton / 248 nm (Phi(CH3, Aceton) = 1,42 – 0,99) und MEK / 248 nm (Phi(CH3, MEK) = 0,45 – 0,19) druckabhängig zu hohen Drücken ab. Die Druckabhängigkeit von Phi(CH3) wird auf die Konkurrenz zwischen Stoßrelaxation und Dissoziation der schwingungsangeregten Acetylradikale (CH3CO#) zurückgeführt. Für das System Aceton / 266 nm wird keine Druckabhängigkeit von Phi(CH3) = 0,93 ± 0,1 beobachtet. Dies wird damit erklärt, dass CH3CO# nicht genügend Energie besitzt, um die Barriere zur Dissoziation zu überschreiten. Bei der Photolyse von Acetylbromid bei 248 nm wird druckunabhängig Phi(CH3) = 0,92 ± 0,10 bestimmt. In diesem System dissoziieren die schwingungsangeregten Acetylradikale bei allen Drücken vollständig. Bei 266 nm wurde die Gesamtquantenausbeute für die Photodissoziation von Aceton (Phi(diss, 266nm)) bestimmt. Die nach Photolyse erhaltenen Methyl - und Acetylradikale wurden nach Titration mit Br2 durch die Resonanzfluoreszenz der Bromatome detektiert. Phi(diss, 266nm) wurde mit 0,92 ± 0,07 bestimmt.

Identifizierung von Hexosecarriern und Regulation des Phosphoketolasewegs in Oenococcus oeni

Oenococcus oeni ist ein heterofermentatives Milchsäurebakterium, das Hexosen über den Phosphoketolaseweg zu Lactat, Acetyl-P und CO2 umsetzt. In Anhängigkeit von der C-Quelle werden Ethanol, Acetat, Mannit und geringe Mengen an Erythrit gebildet. Im Genom von O. oeni PSU-1 wurden neun Gene für sekundäre Carrier identifiziert, die aufgrund ihrer Sequenz und Lage im Genom als Kandidaten für Hexosecarrier in Frage kommen. In Stamm O. oeni B1 wurde die Expression der Gene OEOE_0819 und OEOE_1574 stark durch Glucose induziert. Die Gene konnten jedoch Hexosetransport-Defektmutanten von E. coli nicht komplementieren. Die deutliche Induktion der Gene deutet auf ihre Funktion im Hexosetransport hin. Bei den Carriern 819 und 1574 handelt es sich vermutlich um früher identifizierte Δp-getriebene sekundäre Hexosetransporter. Die Expression der Kandidaten zeigte teilweise Unterschiede bei verschiedenen O. oeni Stämmen. Auch die Funktion von Phosphotransferasesystemen bei der Aufnahme von Hexosen wurde durch Expressionsmessungen untersucht. Einige Systeme weisen Ähnlichkeit zu Glucose- und Fructose-transportierenden Systemen auf und kommen als Aufnahmesysteme für Hexosen in Frage. Das Phosphotransferasesystem OEOE_0464-0466 wird besonders durch Fructose induziert. O. oeni bildet in Abhängigkeit von der C-Quelle unterschiedliche Wege zur Reoxidation des im zentralen Phosphoketolaseweg entstandenen NAD(P)H aus. Die Regulation des Zentralstoffwechsels und des peripheren Stoffwechsels wurde durch Bestimmung der relativen Genexpression und durch Proteomanalysen untersucht. Die Anwesenheit von Citrat und Pyruvat ändert die Expression der Gene deutlich. Bei Zucht mit Ribose, Glucose oder Fructose jedoch bleibt die der meisten Gene konstant. Am stärksten wird der Ethanolweg reguliert, der hauptsächlich nach Zucht mit Glucose zur Reoxidation des NAD(P)H genutzt wird. Die Expression des adhE-Gens der Acetaldehyd- und Alkohol-Dehydrogenase nimmt bei Zucht auf anderen C-Quellen stark ab. Pyruvat ist ein zentrales Intermediat des Energiestoffwechsels und Ausgangsprodukt für Reaktionen des Bausstoffwechsels. Die Expression einiger Pyruvat-liefernder und Pyruvat-verbrauchender Reaktionen wurde bestimmt, um so die Entstehung und den Verbrauch des Pyruvats abhängig von der Stoffwechselsituation beurteilen zu können.

Bedeutung von Rho-GTPasen bei der Regulation zellulärer Antworten auf genotoxischen Stress

SAPK/JNK regulieren nach genotoxischem Stress eine Vielzahl von Zielsubstraten, die bedeutsam für Reparatur und Überleben der Zelle sind, somit nehmen sie Einfluss auf das zelluläre Schicksal der Zelle. Ob DNA-Schäden eine Phosphorylierung von Stress-Kinasen nach sich ziehen ist bisher noch wenig untersucht. Mit reparaturdefizienten Zellen wurde der Einfluss von DNA-Schäden, durch Cisplatin/Transplatin/UV-C, auf die SAPK/JNK Aktivierung untersucht. Die Aktivierung der Stress-Kinasen erfolgte agenzspezifisch und abhängig von verschieden Reparaturfaktoren. Die Aktivierung korrelierte in reparaturdefizienten Zellen teilweise mit dem späten Auftreten von DNA-Strangbrüchen, war jedoch unabhängig von erhöhten initialen DNA-Schäden. Diese Befunde zeigten, dass die späte Aktivierung der SAPK/JNK DNA-schadensabhängig verläuft und das Cisplatin und Transplatin bei Verwendung von äquitoxischen Dosen zu einer vergleichbaren Aktivierung von SAPK/JNK führten. Die Hemmung der Rho-GTPasen sowohl durch Statine als auch mittels Clostridium difficile Toxin B zeigte weiterhin, dass Rho-GTPasen möglicherweise die späte DNA-schadensabhängige Aktivierung der Stress-Kinasen vermitteln. Die Hemmung von Rho-GTPasen durch physiologisch relevante Konzentrationen von Statinen führte in primären humanen Endothelzellen (HUVECs) zu einer Protektion vor IR-Strahlung und Doxorubicin. In beiden Fällen konnte eine Hemmung des pro-apoptotischen Transkriptionsfaktors p53 sowie der Chk1, welche einen Zellzyklusarrest reguliert, mit der Statin-Behandlung erreicht werden. Effektor-Caspasen wurden dabei durch den HMG-CoA-Reduktase Hemmer nicht beeinflusst. Ausschließlich bei dem Statin-vermittelten Schutz vor Doxorubicin kam es zu einer Reduktion von initialen DNA-Schäden, in Form von DNA-Strangbrüchen. Die IR-induzierten Strangbrüche in der DNA blieben von der Statin-Inkubation hingegen unbeeinflusst. Aufgrund ihrer protektiven Eigenschaften gegenüber IR- und Doxorubicin-induzierter Zytotoxizität in Endothelzellen und ihrer pro-apoptotischen Wirkung auf Tumorzellen könnten Statine möglicherweise die unerwünschten Nebenwirkungen von Zytostatika und einer Strahlentherapie günstig beeinflussen

Mucinartige Glycopeptide als Inhibitoren selektinvermittelter Zelladhäsionsprozesse

Es wurden Glycopeptide mit einer Partialsequenz aus der N-terminalen Domäne des natürlichen Selektinliganden PSGL-1 synthetisiert, welche prinzipiell als kompetitive Inhibitoren unerwünschter selektinvermittelter Zelladhäsionsphänomene fungieren könnten. Grundsätzlich könnte es möglich sein, auf diesem Wege entsprechende chronisch entzündliche Krankheiten wie rheumatoide Arthritis zu behandeln und bestimmte akut eintretende schwere Schädigungen von gesundem Gewebe sowie die Metastasenbildung maligner Tumore zu unterdrücken. Das tatsächliche Potential der hergestellten Glycopeptide als Liganden der Selektine kann nun in biologischen Tests geprüft werden. Der gewählte Ausschnitt aus dem P-Selektin-Glycoprotein-Liganden-1 (PSGL-1) reicht von Tyr48 bis Pro59 und umfasst so sämtliche Aminosäurereste der Sequenz, die für das Auftreten einer hochaffinen Rezeptorbindung erforderlich sind. Dabei ist die Seitenkette von Thr57 mit einem O-Glycan modifiziert, welches das in natürlichen Selektinliganden häufig vorkommende Tetrasaccharid Sialyl-Lewisx bzw. ein Mimetikum desselben enthält und die für Mucine typische Form der Anbindung an das peptidische Rückgrat über eine N-Acetyl-α-D-galactosamineinheit aufweist. Zum Aufbau der komplexen Glycopeptidstrukturen wurde zunächst eine Strategie für die Synthese des an die Hydroxylaminosäure gebundenen Oligosaccharids im Gramm-Maßstab ausgearbeitet. Dabei kam der Wahl eines geeigneten Schutzgruppenmusters besondere Bedeutung zu. Das entwickelte Konzept basiert allein auf chemischen Methoden und ermöglicht die parallele Herstellung potentieller Mimetika. So wurde in dieser Arbeit L-Fucose durch D-Arabinose und N-Acetyl-D-neuraminsäure durch (S)-Cyclohexylmilchsäure ersetzt. Die erhaltenen Glycosylaminosäure-Bausteine wurden schließlich in die Glycopeptid-synthesen an der festen Phase eingebracht, welche nach vollständiger Deblockierung die gewünschten Zielverbindungen lieferten.rn

Derivate des Ionentransporters Valinomycin

In der vorliegenden Arbeit wurden Derivate des Ionentransporters Valinomycin synthetisiert und als Sensorelemente in Modellmembransysteme inkorporiert. Als Modellmembranen wurden festkörpergestützte Lipiddoppelschichten (tBLMs, tethered bilayer lipid membranes) verwendet. rnValinomycin transportiert selektiv Kalium-Ionen durch Membranen, was durch einen Rückgang des Widerstandes über elektrochemische Messmethoden nachgewiesen werden kann. Es ist ein zyklisches Dodecadepsipeptid, das aus zwei verschiedenen Aminosäuren (L- und D-Valin) und  Hydroxysäuren (L Milchsäure und D Hydroxyisovaleriansäure) besteht. In dieser Arbeit wurde ein L Valin durch ein L-Lysin ausgetauscht, um eine freie Aminogruppe zum Anbinden verschiedenster Liganden zu erhalten. rnDie Synthese erfolgte in Lösung über einen linearen Decadepsipeptid-Precursor, hierbei wurde hauptsächlich mit Benzyl- und Boc-Schutzgruppen gearbeitet. An den Precursor wurden dann unterschiedlich modifizierte Lysin-Didepside gebunden und das daraus erhaltene lineare Dodecadepsipeptid zyklisiert.rnInsgesamt wurden sechs verschiedene Derivate synthetisiert, deren Ionentransportfähigkeit mit Hilfe eines angebundenen Liganden blockiert wurde. Diese Blockade kann entweder mechanisch durch Festhalten des Ionencarriers an der Oberfläche der Membran oder chemisch durch Einbringen einer Ladung erfolgen, da geladene Moleküle eine Membran nicht überwinden können. rnAcetyl-Lysin-Valinomycin wurde als Testsystem hergestellt, um zu zeigen, dass die Synthese einen funktionsfähigen Ionencarrier ergeben hatte. Im nächsten Schritt wurde Lysin-Valinomycin mit freier Aminogruppe synthetisiert, um es als pH-Sensor zu nutzen und damit zu überprüfen, ob das chemische Einbringen einer Ladung möglich ist. Es konnte ein pH abhängiger Kalium-Transport nachgewiesen werden, die Blockade der Ionentransportfähigkeit über eine eingebrachte Ladung ist somit möglich. rnAuf dem gleichen Konzept beruht Ferrocen-Valinomycin. Wird der Ferrocen-Ligand oxidiert, liegt eine positive Ladung vor und der Ionencarrier kann die Membran nicht mehr überwinden. Eine Reduktion macht diesen Prozess reversibel. Ferrocen-Valinomycin konnte innerhalb einer tBLM chemisch oxidiert und reduziert werden, dieses System kann somit als chemischer Redox-Sensor eingesetzt werden.rnEine mechanische Blockade liegt dem Biotin- und dem Sulfonamid-Valinomycin zugrunde. Dabei soll die Zugabe von Streptavidin bzw. BCA II (bovine Carboanhydrase) den Ionentransport durch die Membran stoppen. Beide Valinomycin-Derivate zeigten aber keine Ionentransportfähigkeit, eine Inkorporation in tBLMs konnte jedoch über SPR gezeigt werden. rnDie Synthese eines fluoreszenz-markierten (FITC) Valinomycins ergab zwar auch keinen transportfähigen Ionencarrier, aber mit diesem Derivat konnte der Diffusionskoeffizient von Valinomycin in sBLMs mit Hilfe von Fluorescence Recovery after photobleaching (FRAP) bestimmt werden.rn

Regulation der Selenoproteinsynthese durch den Mevalonatweg

Im Rahmen dieser Arbeit sollte der Einfluss des Mevalonatpfads auf die Expression von Selenoproteinen untersucht werden. Im Mevalonatpfad, einem universellen Stoffwechselweg eukaryontischer Zellen, entstehen neben Cholesterol auch verschiedene Isoprenoide, die z.B. für die post-transkriptionelle Modifikation der Selenocystein-tRNA herangezogen werden. Selenocystein ist funktioneller Bestandteil von Selenoproteinen, welche häufig in den Abbau von oxidativem Stress involviert sind. rnDer Mevalonatpfad wird hauptsächlich durch die HMG-CoA-Reduktase (HMGCR) reguliert. Pharmaka vom „Statin“-Typ gelten als wirkungsvolle kompetitive Inhibitoren dieses Enzyms und finden ihren Einsatz bei Patienten zur Behandlung von Hypercholesterolämie, welche eine Grundlage für vaskuläre Krankheiten bildet. Trotz der allgemein guten Verträglichkeit der Statine treten jedoch auch unerwünschte Nebeneffekte, wie Erhöhung der Leberenzyme oder Myopathien auf, deren biochemischer Hintergrund bislang noch im Dunkeln liegt. rnDie in dieser Arbeit durchgeführten Experimente belegen, dass Atorvastatin, Cerivastatin und Lovastatin in klinisch relevanten Dosen die Synthese bestimmter Selenoproteine, wie der Glutathionperoxidase (GPx), in klonalen humanen Hepatocyten post-transkriptionell unterdrücken, wodurch die Zellen anfälliger für oxidativen Stress in Form von Peroxiden werden. Dieser Mechanismus könnte eine Erklärung für die häufig beobachteten abnormen Leberwerte von Statin-behandelten Patienten darstellen.rnEndogenes Cholesterol gilt ebenfalls als potenter Inhibitor der HMGCR. Die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse zeigen, dass Cholesterol in verschiedenen Formen, als Low-Density-Lipoprotein (LDL), als 25-Hydroxycholesterol, und als Methylcyclodextrin-Komplex in unterschiedlichen humanen Zelltypen die Selenoproteinsynthese ebenfalls unterdrücken. Der negative Zusammenhang zwischen Cholesterol und bestimmten Selenoproteinen konnte auch in vivo beobachtet werden. In juvenilen Mäusen konnte gezeigt werden, dass ein Knockout des LDL-Rezeptors sowie auch ein Knockout von Apolipoprotein E zu einer Senkung des Lebercholesterols führte, was in einer Zunahme der GPx in der Leber resultierte.rnDie vorliegenden Daten belegen erstmals einen direkten und funktionellen Zusammenhang zwischen dem Mevalonatpfad und der Selenoproteinsynthese. Unterdrückung dieses Pfades, entweder durch exogene Substanzen wie Statine, oder durch endogene Substanzen wie Cholesterol, hat offenbar zur Folge, dass essentielle Zwischenprodukte für die Modifizierung der Selenocystein-tRNA fehlen, was in einer post-transkriptionellen Verminderung der induzierbaren Selenoproteine resultiert. Dies könnte die biochemische Grundlage für einen Teil der vielfältigen gesundheitlich negativen Auswirkungen schon geringfügig erhöhter Cholesterolspiegel sein.

Synthese von Sialyl-Lewis-X-Mimetika durch stereoselektive ortho-C-Glycosylierung von Phenolen

Ziel der Arbeit war es, Sialyl-LewisX-Mimetika auf Basis ortho-C-glycosylierter Phenole als Inhibitoren für die Selektin-Ligand-Wechselwirkungen zu synthetisieren. Dazu wurde zunächst die Stereoselektivität der ortho-C-Mannosylierung untersucht. Dabei wurde gezeigt, dass bei der Umsetzung von Phenolen mit dem benzylgeschützten Mannosyl-trichloracetimidat in Gegenwart von TMSOTf selektiv das β-C-Mannosid erhalten wurde. Gleichzeitig konnte anhand der NMR-spektroskopischen Untersuchungen nachgewiesen werden, dass die in der Literatur beschriebenen α-C-Mannoside von Phenolen tatsächlich β-konfiguriert sind. Wenn Naphthole als Glycosylakzeptoren verwendet wurden, konnten durch Modifikation des Promotors auch die für die Synthese der Mimetika benötigten α-C-Mannoside erhalten werden, wobei ZnCl2 als Promotor die besten Ergebnisse lieferte. Allerdings zeigten die synthetisierten α-C-Mannoside und α-C-Galactoside eine Inversion des Pyranoseringes und lagen in der ungewöhnlichen 1C4-Konformation vor.rnAnschließend konnte auf diese Weise das durch Docking-Studien gefundene Mimetikum (2S)-3-Cyclohexyl-2-[7-hydroxy-8-(α-D-mannosyl)naphthalin-2-yloxy]propionsäure syntheti-siert werden. Es besaß jedoch in Zelladhäsionstests keine ausreichende Aktivität bei der Inhibierung der Selektin-Ligand-Wechselwirkung. Bei den ursprünglichen Dockingstudien war allerdings von der gewohnten 4C1-Konformation ausgegangen worden. Spätere NMR-Experimente und DFT-Berechnungen zeigten, dass das Mimetikum tatsächlich in der 1C4-Konformation vorlag und es deshalb nicht aktiv war. Die synthetisierten Stereo- und Regioisomere zeigten in Zelladhäsionstests ebenfalls keine Aktivität.rnVersuche, die α-1-C-Mannosylnaphthole zu den benötigten 1-C-2-O-Diglycosyl-naphthalinen umzusetzen waren nicht erfolgreich, da die phenolische OH-Gruppe sterisch zu sehr abgeschirmt war, um unter milden Reaktionsbedingungen glycosyliert zu werden, bzw. die α-1-C-Mannosylnaphthaline unter drastischeren Reaktionsbedingungen nicht stabil waren. Daher wurde 1-(2′,3′,4′,6′-Tetra-O-benzyl-β-D-galactopyranosyl)-2-naphthol mit 2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-α-D-mannopyranosyl-trichloracetimidat in Gegenwart von TMSOTf zum ersten synthetischen 1-C-2-O-Diglycosyl-phenol umgesetzt. Nach Abspaltung der Schutzgruppen sollte das erhaltene 1-Galactosyl-2-O-mannosyl-naphthalin enzymatisch zum Sialyl-LewisX-Mimetikum verlängert werden. Es wurde vom Enzym jedoch nicht als Substrat erkannt. Versuche zur chemischen Anbindung des Säurebausteins stehen noch aus.rn

Methods and strategies to identify the mode of action of phytoactive compounds

Small molecules affecting biological processes in plants are widely used in agricultural practice as herbicides or plant growth regulators and in basic plant sciences as probes to study the physiology of plants. Most of the compounds were identified in large screens by the agrochemical industry, as phytoactive natural products and more recently, novel phytoactive compounds originated from academic research by chemical screens performed to induce specific phenotypes of interest. The aim of the present PhD thesis is to evaluate different approaches used for the identification of the primary mode of action (MoA) of a phytoactive compound. Based on the methodologies used for MoA identification, three approaches are discerned: a phenotyping approach, an approach based on a genetic screen and a biochemical screening approach.rnFour scientific publications resulting from my work are presented as examples of how a phenotyping approach can successfully be applied to describe the plant MoA of different compounds in detail.rnI. A subgroup of cyanoacrylates has been discovered as plant growth inhibitors. A set of bioassays indicated a specific effect on cell division. Cytological investigations of the cell division process in plant cell cultures, studies of microtubule assembly with green fluorescent protein marker lines in vivo and cross resistant studies with Eleusine indica plants harbouring a mutation in alpha-tubulin, led to the description of alpha-tubulin as a target site of cyanoacrylates (Tresch et al., 2005).rnII. The MoA of the herbicide flamprop-m-methyl was not known so far. The studies described in Tresch et al. (2008) indicate a primary effect on cell division. Detailed studies unravelled a specific effect on mitotic microtubule figures, causing a block in cell division. In contrast to other inhibitors of microtubule rearrangement such as dinitroanilines, flamprop-m-methyl did not influence microtubule assembly in vitro. An influence of flamprop-m-methyl on a target within the cytoskeleton signalling network could be proposed (Tresch et al., 2008).rnIII. The herbicide endothall is a protein phosphatase inhibitor structurally related to the natural product cantharidin. Bioassay studies indicated a dominant effect on dark-growing cells that was unrelated to effects observed in the light. Cytological characterisation of the microtubule cytoskeleton in corn tissue and heterotrophic tobacco cells showed a specific effect of endothall on mitotic spindle formation and ultrastructure of the nucleus in combination with a decrease of the proliferation index. The observed effects are similar to those of other protein phosphatase inhibitors such as cantharidin and the structurally different okadaic acid. Additionally, the observed effects show similarities to knock-out lines of the TON1 pathway, a protein phosphatase-regulated signalling pathway. The data presented in Tresch et al. (2011) associate endothall’s known in vitro inhibition of protein phosphatases with in vivo-effects and suggest an interaction between endothall and the TON1 pathway.rnIV. Mefluidide as a plant growth regulator induces growth retardation and a specific phenotype indicating an inhibition of fatty acid biosynthesis. A test of the cuticle functionality suggested a defect in the biosynthesis of very-long-chain fatty acids (VLCFA) or waxes. Metabolic profiling studies showed similarities with different groups of VLCFA synthesis inhibitors. Detailed analyses of VLCFA composition in tissues of duckweed (Lemna paucicostata) indicated a specific inhibition of the known herbicide target 3 ketoacyl-CoA synthase (KCS). Inhibitor studies using a yeast expression system established for plant KCS proteins verified the potency of mefluidide as an inhibitor of plant KCS enzymes. It could be shown that the strength of inhibition varied for different KCS homologues. The Arabidopsis Cer6 protein, which induces a plant growth phenotype similar to mefluidide when knocked out, was one of the most sensitive KCS enzymes (Tresch et al., 2012).rnThe findings of my own work were combined with other publications reporting a successful identification of the MoA and primary target proteins of different compounds or compound classes.rnA revised three-tier approach for the MoA identification of phytoactive compounds is proposed. The approach consists of a 1st level aiming to address compound stability, uniformity of effects in different species, general cytotoxicity and the effect on common processes like transcription and translation. Based on these findings advanced studies can be defined to start the 2nd level of MoA characterisation, either with further phenotypic characterisation, starting a genetic screen or establishing a biochemical screen. At the 3rd level, enzyme assays or protein affinity studies should show the activity of the compound on the hypothesized target and should associate the in vitro effects with the in vivo profile of the compound.