Molekulare Untersuchung des Wolf-Hirschhorn-Syndroms

Das Wolf-Hirschhorn-Syndrom (WHS) ist ein komplexes und variables Fehlbildungs- Retardierungssyndrom, das durch Deletion in der distalen Chromosomenregion 4p16.3 hervorgerufen wird und dessen Ätiologie und Pathogenese bisher weitgehend unverstanden sind. Die Zielsetzung in der vorliegenden Arbeit bestand in der Identifizierung und vorläufigen Charakterisierung neuer Gene, die an der Entstehung des Syndroms beteiligt sein könnten. Die Wolf-Hirschhorn-Syndrom-kritische Region (WHSCR) konnte zu Beginn der vorliegenden Arbeit auf einen ca. 2 Mb großen Bereich zwischen den Markern D4S43 und D4S142 eingegrenzt werden. Für die Identifizierung neuer Gene wurden zunächst drei größere genomische Cosmid-/PAC-Contigs (I-III) im Bereich der Marker D4S114 bis D4S142 erstellt und mittels Exonamplifikation auf transkribierte Bereiche (Exons) untersucht. Es konnten insgesamt 67 putative 'Exons' isoliert werden, von denen einige bereits bekannten Genen (ZNF141, PDEB, MYL5, GAK, DAGK4 und FGFR3) entsprechen. Zwei dieser Gene konnten im Rahmen dieser Arbeit erstmals (DAGK4) bzw. genauer (GAK) in die distale Region 4p16.3 kartiert werden. Die restlichen Exons können aufgrund von Homologievergleichen und/oder EST-cDNA-Homologien vermutlich neuen Genen oder auch Pseudogenen (z. B. YWEE1hu) zugeordnet werden. Durch die im Verlaufe der vorliegenden Arbeit publizierte weitere Eingrenzung der WHSCR auf einen 165 Kb-großen Bereich proximal des FGFR3-Gens konzentrierten sich weitere Untersuchungen auf die detaillierte Analyse der WHSCR zwischen dem Marker D4S43 und FGFR3. Mit Hilfe von Exonamplifikation bzw. computergestützter Auswertung vorliegender Sequenzdaten aus diesem Bereich ('GRAIL', 'GENSCAN' und Homologievergleiche in den EST-Datenbanken des NCBI) konnten mehrere neue Gene identifiziert werden. In distaler-proximaler Reihenfolge handelt es sich dabei um die Gene LETM1, 51, 43, 45, 57 und POL4P. LETM1 kodiert für ein putatives Transmembran-Protein mit einem Leucin-Zipper- und zwei EF-Hand-Motiven und könnte aufgrund seiner möglichen Beteiligung an der Ca2+-Homeostase und/oder der Signal-transduktion zu Merkmalen des WHS (Krampfanfällen, mentale Retardierung und muskuläre Hypotonie) beitragen. Das Gen 51 entspricht einem in etwa zeitgleich durch Stec et al. (1998) und Chesi et al. (1998) als WHSC1 bzw. MMSET bezeichnetem Gen und wurde daher nicht weiter charakterisiert. Es wird genauso wie das Gen 43, das zeitgleich von Wright et al. (1999b) als WHSC2 beschrieben werden konnte und eine mögliche Rolle bei der Transkriptionselongation spielt, ubiquitär exprimiert. Das in der vorliegenden Arbeit identifizierte Gen 45 zeigt demgegenüber ein ausgesprochen spezifisches Expressionsmuster (in Nervenzellen des Gehirns sowie in Spermatiden). Dies stellt zusammen mit der strukturellen Ähnlichkeit des putativen Genprodukts zu Signalmolekülen einen interessanten Zusammenhang zu Merkmalen des WHS (beispielsweise Kryptorchismus, Uterusfehlbildungen oder auch neurologische Defekte) her. Demgegenüber handelt es sich bei dem Gen 57 möglicherweise um ein trunkiertes Pseudogen des eRFS-Gens auf Chromosom 6q24 (Wallrapp et al., 1998). Das POL4P-Gen schließlich stellt allein aufgrund seiner genomischen Lokalisation sowie seiner möglichen Funktion (als DNA-Polymerase-ähnliches Gen) kein gutes Kandidatengen für spezifische Merkmale des Syndroms dar und wurde daher nicht im Detail charakterisiert. Um die Beteiligung der Gene an der Ätiologie und Pathogenese des Syndroms zu verstehen, ist die Entwicklung eines Mausmodells (über das Einfügen gezielter Deletionen in das Mausgenom) geplant. Um dies zu ermöglichen, wurde in der vorliegenden Arbeit die Charakterisierung der orthologen Region bei der Maus vorgenommen. Zunächst wurden die orthologen Gene der Maus (Letm1, Whsc1, Gen 43 (Whsc2h), Gen 45 und Pol4p) identifiziert. Durch die Erstellung sowie die genaue Kartierung eines murinen genomischen P1/PAC-Klon-Contigs konnte gezeigt werden, daß die murinen Gene Fgfr3, Letm1, Whsc1, Gen 43 (Whsc2h), Gen 45 und Pol4p sowie einige weitere der überprüften EST-cDNA-Klone der Maus in einem durchgehenden Syntänieblock zwischen Mensch (POL4P bis FGFR3) und Maus (Mmu 5.20) enthalten sind, der in seiner genomischen Ausdehnung in etwa den Verhältnissen beim Menschen (zwischen POL4P und FGFR3) entspricht.

Charakterisierung der neuroprotektiven Eigenschaften des Corticotropin-Releasing-Hormons

Das Corticotropin Releasing Hormon (CRH) ist ein zentraler Mediator des neuroendokrinen Systems von Säugetieren und kontrolliert die physiologische Stressreaktion des Körpers. Zudem zeigten in vitro Daten, dass es Neuroprotektion gegenüber oxidativem Stress induzieren kann. In der vorliegenden Arbeit konnte erstmals ein neuroprotektiver Effekt des CRH in vivo gezeigt werden. Die Überexpression des CRH im ZNS von Mäusen konnte Nervenzellen in vivo vor Exzitotoxizität schützen; nach Injektion des Exzitotoxins Kainat verkürzte die CRH-Überexpression die Dauer der epileptischen Anfälle, schützte die Neurone der betroffenen Hippocampusregion vor Zelltod und verhinderte die bei Exzitotoxizität und vielen neurodegenerativen Erkrankungen auftretende Neuroinflammation. Desweiteren konnten in CRH-überexprimierenden Tieren erhöhte BDNF-Proteinspiegel nachgewiesen werden. BDNF, ein bedeutender neurotropher Faktor im ZNS, vermittelt daher teilweise die CRH-induzierte Neuroprotektion gegenüber der Exzitotoxizität in vivo. Im Rahmen dieser Arbeit wurde mit Connexin43, dem Haupt-Gap Junction-Protein der Astrozyten, ein neues CRH-Zielgen im ZNS identifiziert. Es konnte erstmals gezeigt werden, dass CRH sowohl die Expression des Connexin43-Gens als auch den Connexin43-Proteinspiegel in vitro und in vivo erhöht. Diese Effekte werden über die Aktivierung des CRH-Rezeptor 1 und nachfolgend der PKA- und MAPK-Signalwege vermittelt. In Übereinstimmung mit der Hochregulation des Connexin43-Proteinspiegels verstärkte CRH auch die interzelluläre Kommunikation über Gap Junctions. Physiologisch hat diese CRH-induzierte Verstärkung der astrozytären Gap Junction-Kommunikation eine große Bedeutung für die Neuroprotektion, da eine Hochregulation der interzellulären Kommunikation schnell toxische Moleküle verdünnt, Energiesubstrate und protektive Faktoren verteilt und Ionen abpuffert. Dadurch werden Schädigungen durch oxidativen Stress in den Zellen reduziert, was über die Analyse der Proteincarbonylierung gezeigt wurde. Die Relevanz der astrozytären Gap Junction-Kommunikation für das Überleben der Neurone konnte in organotypischen hippocampalen Schnitten und in Neuron-Astrozyten-Co-Kulturen deutlich gemacht werden. Die im Rahmen der vorliegenden Arbeit gewonnenen Daten zeigen, dass die Stress-induzierte Sekretion von CRH im ZNS zur verstärkten Expression neuroprotektiver Moleküle wie BDNF und Connexin43 beiträgt. Diese vermögen Neurone gegenüber toxischen Einflüssen zu schützen und zum Erhalt ihrer Funktion beizutragen. Die protektiven CRH-Effekte könnten speziell bei chronischen neurodegenerativen Krankheiten wie der Alzheimerschen Demenz und der Parkinsonschen Krankheit hilfreich sein.

In vitro modulation of epileptiform activity in the hippocampal formation of immature rodents by GABAergic antagonists, dopamine and methylxanthines

Während des frühen Lebens stellen epileptische Anfälle schwere neurologische Zustände dar, weil sie ein großer Risikofaktor für die Manifestation der Epilepsie sind und eine hohe pharmakologische Resistenz zeigen. In meiner Doktorarbeit konzentrierte ich mich auf die Frage, wie verschiedene Neurotransmitter-Systeme und klinisch verwendete Medikamente epileptiforme Entladungen im perinatalen Hippocampus beeinflussen. rnIm ersten Teil meines Projektes untersuchte ich die Wirkung von GABA-Antagonisten und Modulatoren, die zwischen phasischen und tonischen GABAergen Strömen differenzieren, auf Feldpotentialaktivität in Hippocampusschnitten. Diese Experimente zeigten, dass im unreifen Hippocampus synaptische GABAerge Aktivität benötigt wird, um die Erregbarkeit zu begrenzen, während tonische GABAerge Ströme die Erregbarkeit verstärken können. Dies könnte darauf hinweisen, dass Antiepileptika mit einer höheren Spezifität für synaptische GABAA-Rezeptoren wirksamer zur Behandlung von epileptischen Anfällen bei Neugeborenen sein können. rnUm den Einfluss von Dopamin auf die Erregbarkeit des unreifen Hippocampus herauszufinden, untersuchte ich im zweiten Teil meiner Arbeit die Wirkung von verschiedenen Dopaminkonzentrationen und spezifische Agonisten und Antagonisten der Dopamin-Rezeptor-Subtypen auf epileptiforme Entladungen. Diese Experimente zeigten, dass niedrige Dopamin Konzentrationen eine antikonvulsive Wirkung haben, welche vom D2-ähnliche-Rezeptor-Agonisten Quinpirol nachgeahmt werden kann, während höhere Dopamin-Konzentrationen eine prokonvulsive Wirkung über Aktivierung von D1-ähnlichen Rezeptoren hervorrufen. Obwohl unsere Untersuchungen eine mögliche Verwendung von D2-ähnlichen Rezeptor-Agonisten zur Kontrolle epileptischer Anfälle in Neugeborenen nahelegen, müssen mögliche negative Auswirkungen von DAergen Agonisten und Antagonisten auf die neuronale Entwicklung berücksichtigt werden.rnIm dritten Teil meiner Arbeit untersuchte ich welche Konzentrationen von Methylxanthinen epileptische Anfälle in Hippocampuspreparationen auslösen die synaptische Übertragungen verändern können. Diese Experimente zeigten, dass sowohl Theophyllin als auch Koffein in höheren Konzentrationen die basale synaptische Übertragungen in der CA1-Region des Hippocampus modifizieren und epileptiforme Entladungen provozieren. Die Auswirkungen auf die postsynaptischen Antworten und spontanen epileptiformen Entladungen durch Koffein waren weniger ausgeprägt, was darauf hindeutet, dass diese Substanz potentiell vorteilhafter für therapeutische Anwendungen bei Frühgeborenen sein kann. rnZusammenfassend bereichern die Ergebnisse meiner Studie erheblich unser Wissen über die zugrunde liegenden Mechanismen epileptiformer Aktivität im unreifen Hippocampus und den therapeutischen Einsatz von Methylxanthinen und Pharmaka, die auf das GABAerge und DArge System einwirken.rnrn

Behavioural analysis of mouse mutants with altered neuronal and glial genes

Im ersten Teil dieser Doktorarbeit beabsichtigte meine Arbeit, die funktionelle Beteiligung des CB1 Rezeptors, einer Hauptkomponente des neuronalen Endocannabinoid-Systems (ECS), an der Ausbildung von verschiedenen Verhaltensphänotypen mit Hilfe von konditionalen Mausmutanten, denen der CB1 Rezeptor auf verschiedenen neuronalen Unterpopulationen fehlt, aufzuschlüsseln und zu untersuchen. Verschiedene Verhaltensmodelle wurden hierzu getestet. Dabei lag der Fokus dieser Arbeit auf der CB1f/f;D1-Cre Mauslinie, welche der CB1 Rezeptor auf den D1 Rezeptor exprimierenden Neuronen des Striatums fehlt. Ich konnte zeigen, dass der Verlust des CB1 Rezeptors auf diesen Neuronen keinen Einfluss auf basale neurologische Funktionen, Gewicht, Bewegung, Exploration, Sozialverhalten, Angst und Stressbewältigung der Tiere hat, jedoch eine Beteiligung an der Entwicklung von Suchtverhalten gegeben ist. Bei Betrachtung des Kokain-induzierten Suchtverhaltens zeigten die konditionalen Mausmutanten eine reduzierte Suchtanfälligkeit sowohl im Vergleich zu Tieren mit einem totalen CB1 Rezeptor Verlust in allen Körperzellen, als auch zu genetisch unveränderten Kontrollmäusen beider Linien.rnDes Weiteren zeigen die Ergebnisse dieser Studie eine große, aber gegensätzliche Beteiligung des ECS bei der Regulation von Exploration in Abhängigkeit des Verlustes des CB1 Rezeptors auf GABAergen Neuronen des Vorderhirns und kortikalen glutamatergen Neuronen, jedoch nicht auf striatalen Neuronen alleine. Zusätzlich war ich in der Lage, die Wichtigkeit des genetischen Hintergrunds von Mauslinien nicht nur auf die Ausbildung von spezifischen Verhaltensphänotypen, sondern auch auf die Genexpression zu zeigen.rnIn dem zweiten Teil dieser Arbeit, in dem ich mich auf die Funktion von Gliazellen konzentrierte, wurden ebenfalls Mausmutanten in verschiedenen Verhaltensmodellen getestet. Ein genetisches Auslöschen des NG2 Glykoproteins in Gliazellen sorgt in den Knock-out Mäusen für ein schlechteres Hörvermögen und ein reduziertes Depressionsverhalten im Vergleich zu ihren Wildtyp-Kontrollmäusen. Interessanterweise zeigten diese Tiere auch eine reduzierte Empfänglichkeit bei chemisch induzierten epileptischen Krämpfen, was eine Rolle des NG2 Glykoproteins bei der Kontrolle der glutamatergen Homöostase vorschlägt, die wahrscheinlich durch Strukturänderungen der Neuron-Glia-Synapse verursacht wird. rn

Modulation of network excitability and epileptiform activity in the hippocampus of immature rats by the activation of GlyRs

Epileptic seizures are the manifestations of epilepsy, which is a major neurological disorder and occurs with a high incidence during early childhood. A fundamental mechanism underlying epileptic seizures is loss of balance between neural excitation and inhibition toward overexcitation. Glycine receptor (GlyR) is ionotropic neurotransmitter receptor that upon binding of glycine opens an anion pore and mediates in the adult nervous system a consistent inhibitory action. While previously it was assumed that GlyRs mediate inhibition mainly in the brain stem and spinal cord, recent studies reported the abundant expression of GlyRs throughout the brain, in particular during neuronal development. But no information is available regarding whether activation of GlyRs modulates neural network excitability and epileptiform activities in the immature central nervous system (CNS). Therefore the study in this thesis addresses the role of GlyRs in the modulation of neuronal excitability and epileptiform activity in the immature rat brain. By using in vitro intact corticohippocampal formation (CHF) of rats at postnatal days 4-7 and electrophysiological methods, a series of pharmacological examinations reveal that GlyRs are directly implicated in the control of hippocampal excitation levels at this age. In this thesis I am able to show that GlyRs are functionally expressed in the immature hippocampus and exhibit the classical pharmacology of GlyR, which can be activated by both glycine and the presumed endogenous agonist taurine. This study also reveals that high concentration of taurine is anticonvulsive, but lower concentration of taurine is proconvulsive. A substantial fraction of both the pro- and anticonvulsive effects of taurine is mediated via GlyRs, although activation of GABAA receptors also considerably contributes to the taurine effects. Similarly, glycine exerts both pro- and anticonvulsive effects at low and high concentrations, respectively. The proconvulsive effects of taurine and glycine depend on NKCC1-mediated Cl- accumulation, as bath application of NKCC1 inhibitor bumetanide completely abolishes proconvulsive effects of low taurine and glycine concentrations. Inhibition of GlyRs with low concentration of strychnine triggers epileptiform activity in the CA3 region of immature CHF, indicating that intrinsically an inhibitory action of GlyRs overwhelms its depolarizing action in the immature hippocampus. Additionally, my study indicates that blocking taurine transporters to accumulate endogenous taurine reduces epileptiform activity via activation of GABAA receptors, but not GlyRs, while blocking glycine transporters has no observable effect on epileptiform activity. From the main results of this study it can be concluded that in the immature rat hippocampus, activation of GlyRs mediates both pro- and anticonvulsive effects, but that a persistent activation of GlyRs is required to prevent intrinic neuronal overexcitability. In summary, this study uncovers an important role of GlyRs in the modulation of neuronal excitability and epileptiform activity in the immature rat hippocampus, and indicates that glycinergic system can potentially be a new therapeutic target against epileptic seizures of children.

Targeting neuronal populations by AAV-mediated gene transfer for studying the endocannabinoid system

The cannabinoid type 1 (CB1) receptor is involved in a plethora of physiological functions and heterogeneously expressed on different neuronal populations. Several conditional loss-of-function studies revealed distinct effects of CB1 receptor signaling on glutamatergic and GABAergic neurons, respectively. To gain a comprehensive picture of CB1 receptor-mediated effects, the present study aimed at developing a gain-of-function approach, which complements conditional loss-of-function studies. Therefore, adeno-associated virus (AAV)-mediated gene delivery and Cre-mediated recombination were combined to recreate an innovative method, which ensures region- and cell type-specific transgene expression in the brain. This method was used to overexpress the CB1 receptor in glutamatergic pyramidal neurons of the mouse hippocampus. Enhanced CB1 receptor activity at glutamatergic terminals caused impairment in hippocampus-dependent memory performance. On the other hand, elevated CB1 receptor levels provoked an increased protection against kainic acid-induced seizures and against excitotoxic neuronal cell death. This finding indicates the protective role of CB1 receptor on hippocampal glutamatergic terminals as a molecular stout guard in controlling excessive neuronal network activity. Hence, CB1 receptor on glutamatergic hippocampal neurons may represent a target for novel agents to restrain excitotoxic events and to treat neurodegenerative diseases. Endocannabinoid synthesizing and degrading enzymes tightly regulate endocannabinoid signaling, and thus, represent a promising therapeutic target. To further elucidate the precise function of the 2-AG degrading enzyme monoacylglycerol lipase (MAGL), MAGL was overexpressed specifically in hippocampal pyramidal neurons. This genetic modification resulted in highly increased MAGL activity accompanied by a 50 % decrease in 2-AG levels without affecting the content of arachidonic acid and anandamide. Elevated MAGL protein levels at glutamatergic terminals eliminated depolarization-induced suppression of excitation (DSE), while depolarization-induced suppression of inhibition (DSI) was unchanged. This result indicates that the on-demand availability of the endocannabinoid 2-AG is crucial for short-term plasticity at glutamatergic synapses in the hippocampus. Mice overexpressing MAGL exhibited elevated corticosterone levels under basal conditions and an increase in anxiety-like behavior, but surprisingly, showed no changes in aversive memory formation and in seizure susceptibility. This finding suggests that 2 AG-mediated hippocampal DSE is essential for adapting to aversive situations, but is not required to form aversive memory and to protect against kainic acid-induced seizures. Thus, specific inhibition of MAGL expressed in hippocampal pyramidal neurons may represent a potential treatment strategy for anxiety and stress disorders. Finally, the method of AAV-mediated cell type-specific transgene expression was advanced to allow drug-inducible and reversible transgene expression. Therefore, elements of the tetracycline-controlled gene expression system were incorporated in our “conditional” AAV vector. This approach showed that transgene expression is switched on after drug application and that background activity in the uninduced state was only detectable in scattered cells of the hippocampus. Thus, this AAV vector will proof useful for future research applications and gene therapy approaches.