Bcl-2-homologe Proteine aus dem Schwamm Geodia cydonium

'Bcl-2-homologe Proteine aus dem Schwamm Geodia cydonium: Klonierung, Charakterisierung und Funktionsanalyse von Apoptose-Regulatoren der Porifera'. Auf der Suche nach der molekularbiologischen Grundlage der Apoptose in den Porifera, dem phylogenetisch ältesten Metazoen-Tierstamm, wurden Mitglieder der apoptoseregulatorischen Bcl?2 Familie unter Anwendung diverser Techniken im Schwamm G. cydonium identifiziert: GCBHP1 und GCBHP2. Detaillierte Analysen offenbarten Bcl-2-charakteristische Signaturen sowie eine durch apoptotische Stimuli induzierbare Expression. Die parallele HSP70-Induktion zeugte von der GCBHP2-Expression als Teil einer antiapoptotischen Streßantwort zum Schutz des Organismus'. Die kontinuierliche Transkription des im Rahmen dieser Arbeit gleichfalls klonierten Proliferationsmarkers SEP1 veranschaulichte zudem die Effektivität dieser Streßreaktion. Mit der Herstellung eines rekombinanten Proteins und der Gewinnung eines Antiserums konnte auch die streßinduzierte Proteinexpression des GCBHP2 verfolgt werden. Zum Zweck der Funktionsstudie wurden Säugetierzellen (HEK-293, NIH/3T3) mit einem GCBHP2-Konstrukt stabil transfiziert und auf die Expression des Schwammproteins untersucht. Diese Zellen unterschieden sich bereits phänotypisch von mock-transfizierten Zellen. Immunzytochemische Untersuchungen enthüllten eine für antiapoptotische Bcl-2 Proteine charakteristische Assoziation mit Mitochondrien. Unter dem Einfluß zweier apoptotischer Stimuli wurde für GCBHP2-transfizierte Zellen eine vierzehn-/sechsmal höhere Vitalität und eine reduzierte Aktivierung der Caspase-Kaskade registriert (im Vergleich zu mock-transfizierten Kontrollen). Somit wurde der antiapoptotische Charakter des GCBHP2 und die Existenz apoptotischer Mechanismen in den Porifera bestätigt.

Die Rolle des anti-apoptotischen Proteins Mcl-1 für die Leber und das hepatozelluläre Karzinom

Myeloid cell leukemia-1 (Mcl-1) ist ein anti-apoptotisches Mitglied der Bcl-2-Proteinfamilie. Als solches ist es in der Lage, die mitochondriale Aktivierung während der Apoptose zu hemmen. Dadurch schützt es Zellen bei zellulärem Stress (wie z.B. Differenzierung, Proliferation oder Virusinfektion) vor Apoptoseinduktion. Aufgrund dieser Eigenschaft ist es unabkömmlich während der Embryogenese und in verschiedenen hämatopoetischen Zellpopulationen. Des Weiteren ist Mcl-1 als Protoonkogen in verschiedenen humanen Tumorentitäten verstärkt exprimiert und kann so zu einer verminderten Apoptosesensitivität von Tumorzellen beitragen. Auch primäre humane Hepatozyten können nach Mcl-1-Induktion durch Wachstumsfaktorbehandlung gegenüber CD95-vermittelter Apoptose geschützt werden. Daher sollte untersucht werden, welche Bedeutung Mcl-1 im hepatozellulären Karzinom (HCC) und in der gesunden Leber einnimmt. Hierzu wurde zunächst humanes HCC-Gewebe hinsichtlich der Expression von Mcl-1 untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass Mcl-1 sowohl auf mRNA- als auch auf Protein-Ebene in HCC-Gewebe verstärkt exprimiert ist im Vergleich zu benachbartem Normalgewebe. Auch in verschiedenen HCC-Zelllinien konnte eine starke Mcl-1-Expression nachgewiesen werden. Diese war vor allem über den PI3K/Akt-Signalweg reguliert. Eine Hemmung dieses Signalwegs führte zu einer Reduktion der Mcl-1-Expression und so zu einer Sensitivierung der Zellen gegenüber verschiedenen Chemotherapeutika und zielgerichteten Therapien. Des Weiteren wurde die Mcl-1-Expression spezifisch durch RNA-Interferenz gehemmt. Auch hier konnte gezeigt werden, dass Zellen mit unterdrückter Mcl-1-Expression deutlich sensitiver gegenüber verschiedenen Apoptose-induzierenden Substanzen reagierten. Eine kombinierte Hemmung der Mcl-1-Expression und der PI3-Kinase führte schließlich zu einer nochmals verstärkten Sensitivierung. Im Gegensatz dazu führte eine Überexpression von Mcl-1 zu einer Hemmung der Apoptoseinduktion. Im zweiten Teil der Arbeit wurde eine Mauslinie etabliert, welche spezifisch in Hepatozyten kein Mcl-1 exprimiert, um so die Bedeutung von Mcl-1 für die Leber in vivo zu untersuchen. Es zeigte sich, dass Mcl-1flox/flox-AlbCre-Mäuse bereits im Alter von acht Wochen eine verminderte Lebergröße aufweisen. Dies wurde verursacht durch spontane Apoptoseinduktion in den Mcl-1 negativen Hepatozyten. Hierdurch kam es zu einer Leberschädigung, ersichtlich durch erhöhte Transaminasenwerte, erhöhte Caspase-3-Aktivierung, und Schädigung der Gewebsstruktur. Zudem war als kompensatorischer Effekt die Zellproliferation erhöht, ohne dass sich jedoch das Lebergewicht an das von Kontrolltieren anglich. Interessanterweise kam es in Mcl-1flox/flox-AlbCre-Mäusen als Folge der chronischen Leberschädigung zur Entwicklung einer Leberfibrose, ersichtlich durch eine verstärkte Collageneinlagerung. Weiterhin reagierten Mcl-1flox/flox-AlbCre-Mäuse wesentlich empfindlicher gegenüber Todesrezeptor-vermittelter Apoptose. Diese Daten zeigen zum einen, dass Mcl-1 zur Apoptoseresistenz von HCC-Zellen beitragen kann. Zielgerichtete Therapien, welche die Expression von Mcl-1 hemmen, könnten folglich für die Therapie des HCCs von Interesse sein. Des Weiteren konnte in dieser Arbeit zum ersten Mal gezeigt werden, dass Mcl-1 ein zentraler anti-apoptotischer Faktor für Hepatozyten in vivo ist.

Identifizierung chemischer Transportinhibitoren zur Modulation (patho)biologischer Genprodukte

Die intrazelluläre Lokalisation von Proteinen und Makromolekülen unterliegt in Eukaryoten einer strengen Regulation. Insbesondere erlaubt die Kompartimentierung eukaryotischer Zellen in Zellkern und Zytoplasma den simultanen Ablauf räumlich getrennter biochemischer Reaktionen, und damit die unabhängige Regulation zellulärer Programme. Da trotz intensiver Forschungsbemühungen bis dato die molekularen Details sowie die (patho)biologische Bedeutung von Kern-Zytoplasma-Transportprozessen noch immer nicht vollkommen verstanden sind, wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit ein Fokus auf die Identifizierung von chemischen Transportinhibitoren gelegt. Das zu diesem Zweck entwickelte Translokations-Biosensor-System basiert auf der Kombination von autofluoreszierenden Proteinen, sowie spezifisch ausgewählten Kernexport- und Kernimportsignalen. Nach Etablierung geeigneter Zellmodelle, die effizient und stabil die Translokations-Biosensoren exprimieren, wurde die 17 000 Substanzen umfassende Bibliothek der ChemBioNet-Initiative nach Kernexportinhibitoren mittels einer Fluoreszenzmikroskopie-basierten Hochdurchsatzanalyse-Plattform durchmustert. Zunächst wurden Translokations-Algorithmen, welche eine zuverlässige automatisierte Erkennung von Zellkern und Zytoplasma erlauben, optimiert. Im Folgenden konnten acht neue niedermolekulare Kernexport-Inhibitoren identifiziert werden, die sich in der Stärke, der Geschwindigkeit, sowie in der Beständigkeit der vermittelten Inhibition unterscheiden. Die Aktivität der Inhibitoren konnte auf den isolierten nukleären Exportsignalen (NES) von HIV-1 Rev und Survivin als auch auf den entsprechenden Volllängeproteinen mittels Mikroinjektionsexperimenten sowie durch umfassende in vitro und biochemische Methoden bestätigt werden. Zur Untersuchung der funktionellen Einheiten der Inhibitoren wurden homologe Substanzen auf Ihre Aktivität hin getestet. Dabei konnten für die Aktivität wichtige chemische Gruppen definiert werden. Alle Substanzen stellen neue Inhibitoren des Crm1-abhängigen Exports dar und zeigen keine nachweisbare NES-Selektivität. Interessanterweise konnte jedoch eine zytotoxische und Apoptose-induzierende Wirkung auf verschiedene Krebszellarten festgestellt werden. Da diese Wirkung unabhängig vom p53-Status der Tumorzellen ist und die Inhibitoren C3 und C5 die Vitalität nicht-maligner humaner Zellen signifikant weniger beeinträchtigen, wurden diese Substanzen zum internationalen Patent angemeldet. Da der nukleäre Export besonders für Tumorzellen einen wichtigen Überlebenssignalweg darstellt, könnte dessen reversible Hemmung ausgenutzt werden, um besonders in Kombination mit gängigen Krebstherapien eine therapeutisch relevante Tumorinhibition zu erzeugen. Eine weitere Anwendungsmöglichkeit der neuen Exportinhibitoren ist auf dem Gebiet der Infektionskrankheiten zu sehen, da auch die Aktivität des essentiellen HIV-1 Rev-Proteins inhibiert wird. Zusätzlich konnte in der Arbeit gezeigt werden, dass der zelluläre Kofaktor des Crm1-abhängigen Exports des HIV-1 Rev-Proteins, die RNA-Helikase DDX3, ein eigenes NES enthält. Der Nachweis einer direkten Interaktion des HIV-1 Rev- mit dem DDX3-Protein impliziert, dass multiple Angriffstellen für chemische Modulatoren hinsichtlich einer antiviralen Therapie gegeben sind. Da die Vielfalt des chemischen Strukturraums es unmöglich macht diesen experimentell vollständig zu durchmustern, wurden im Rahmen dieser Arbeit auch Naturstoffe als vielversprechende Wirkstoffquelle untersucht. Um zukünftig umfassend bioaktive Substanzen aus diesen hochkomplexen Stoffgemischen experimentell identifizieren zu können, wurde eine Fluoreszenzmikroskopie-basierte Hochdurchsatzanalyse-Plattform am Mainz Screening Center (MSC) etabliert. Damit konnte bereits ein weiterer, bisher unbekannter Exportinhibitor aus Cyphellopsis anomala identifiziert werden. Neben einer Anwendung dieser Substanz als chemisches Werkzeug zur Aufklärung der Regulation von Transportvorgängen, stellt sich auch die evolutionsbiologisch relevante Frage, wie es dem Pilzproduzenten gelingt die Blockierung des eigenen Kernexports zu umgehen. Weiterführende Projekte müssen sich neben der Aufklärung der molekularen Wirkmechanismen der gefundenen Substanzen mit der Identifizierung spezifischer chemischer „Funktionseinheiten“ beschäftigen. Neben einem verbesserten mechanistischen Verständnis von Transportvorgängen stellen die erarbeiteten Transportinhibitoren Vorstufen zur Weiterentwicklung möglicher Wirkstoffe dar. Die im Rahmen dieser Arbeit etablierte Technologie-Plattform und molekularen Werkzeuge stellen darüber hinaus eine wichtige Voraussetzung dar, um eine systematische Suche nach möglichen Wirkstoffen im Forschungsfeld der „Chemischen Biomedizin“ voranzutreiben.

Modulation of apoptosis by endogenously produced nitric oxide

Untersuchungen zur Expression der induzierbaren NO-Synthetase (NOS2) belegen eine häufige Expression dieses Enzyms in Tumoren unterschiedlicher Gewebe. Bislang ist jedoch ungeklärt, ob die Expression der NOS2 in Tumorzellen die apoptotische Eliminierung durch zytotoxische T-Zellen beeinflussen kann. In der vorliegenden Arbeit wurden die Folgen einer endogenen NO-Synthese auf die Apoptosesensitivität von HEK293-Zellen untersucht. Um primäre NO-Wirkungen von NO-induzierten, sekundären (kompensatorischen) Veränderungen zu trennen, wurde mit einem induzierbaren Vektorsystem gearbeitet. Die NOS2 wurde zunächst unter der Kontrolle eines Ecdyson-sensitiven Promoters in HEK293-Zellen kloniert. Es konnten regulierbare NOS2-Klone selektiert werden, die nach Ponasteronbehandlung dosisabhängig die NOS2 exprimieren und NO synthetisieren. Die NOS2-Expression wurde durch Western Blot Analyse und Immunfluoreszenzfärbung dargestellt und die NO-Produktion mit Hilfe der Griess-Reaktion gemessen. An den NOS2-induzierten Zellen wurde dann der Einfluss von NO auf die CD95-vermittelte Apoptose analysiert. Es zeigte sich nach Stimulation des CD95-Rezeptors eine deutliche Korrelation der Apoptoserate mit der NOS2-Expression. In Kokulturexperimenten mit Peptid-spezifischen zytotoxischen T-Zellen zeigte sich, dass NO-produzierende Zielzellen effektiver eliminiert werden konnten. Auch nach Behandlung der Zellen mit TRAIL ergab sich eine höhere Apoptoserate in NO-produzierenden Zellen. Die weitere Analyse der durch NO beeinflussten Signalwege ergab eine Beteiligung von ER-Stress-vermittelten Apoptosewegen. Dies zeigte sich an der Hochregulation des ER-Stress-Proteins Grp78 (BiP) nach NOS2-Expression und der Spaltung der am ER-lokalisierten Caspase-4. Darüber hinaus konnte der schnellere Verlust des mitochondrialen Membranpotentials in Abhängigkeit von der NOS2-Expression nachgewiesen werden. Weiterhin wurde die Wirkung einer dauerhaften NO-Exposition auf die Apoptosesensitivität der Zellen untersucht. Auch ohne zusätzliche CD95-Stimulation induzierte eine kontinuierliche NOS2-Expression nach wenigen Tagen in den EcR293-NOS2-Zellen Apoptose. Diese Dauerbehandlung führte zum nahezu vollständigen Absterben der Kulturen. Einige Zellen überlebten jedoch diese Behandlung und wuchsen zu Zellklonen. Diese NO-resistenten Klone konnten isoliert werden. Sie zeigten eine zusätzliche Resistenz für CD95-vermittelte Apoptosesignale und waren besser vor dem Angriff Peptid-spezifischer CTLs geschützt. Die Apoptoseresistenz blieb auch nach längerer Kultur erhalten und scheint auf NO-induzierter Genotoxizität zu beruhen. Anhand dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass allein durch chronische NO-Behandlung eine Selektion apoptoseresistenter Zellen stattfinden kann.