Vorkommen und Charakterisierung von Ecdysiotropinen bei männlichen Imagines der Mittelmeerfeldgrille Gryllus bimaculatus de Geer

Das Vorkommen von Häutungshormonen in adulten Insekten, insbesondere solcher, die eine lange Imaginalphase durchlaufen, wirft die Frage nach der Regulation der Ecdysteroidsynthese außerhalb der Prothorakaldrüse auf. Unter diesem Gesichtspunkt kann Gryllus bimaculatus mit einem ausgesprochen langen Adultstadium und rapiden zeitlichen Veränderungen des Ecdysontiters als ein geeignetes Versuchsobjekt angesehen werden.Der vorliegenden Dissertation liegt die Arbeitshypothese zugrunde, daß die Ecdysteroid-Synthese bzw. Sekretion von Adultgeweben in männlichen Imagines der Mittelmeerfeldgrille durch Neuropeptide hormonell reguliert wird. Als Quelle für die Ecdysteroidsynthese wurde auf Grund immunohistochemischer Befunde sowie der Ergebnisse von Sekretionsprofil-Analysen unter anderem die Oenocyten in Betracht gezogen.Zur Überprüfung dieser Hypothese wurde ein in vitro Bioassay entwickelt, der es ermöglichte, die Wirkung von extrahierten Substanzen auf die Hormonsynthese mittels RIA/HPLC zu bestimmen. Aus Köpfen adulter G. bimaculatus ließen sich durch HP-SEC Faktoren isolieren, die die Ecdysteroidsekretion in Oenocyten und Tergiten stimulierten, die aber keinen Einfluß auf die Hormonsekretion von Fettgewebe sowie der Prothorakaldrüsen hatten. Die Wirkung des aufgereinigten Extraktes in Oenocyten war zeit- und dosis-abhängig. Die ecdysiotropen Faktoren besaßen ein Molekulargewicht zwischen 26,5 und 30 kDa. Die Größe der Molmasse der ecdysiotropen Faktoren entsprach somit bei adulten männlichen Grillen etwa dem des Neurohormons PTTH bei Lepidopteren. Dennoch zeigten Antikörper, die gegen PTTH von Bombyx mori gerichtet waren im Western-Blot keine Bindung an Gryllus bimaculatus Kopfextrakte. Die Sekretionsprodukte von Oenocyten, die mit Ecdysiotropinen behandelt waren, wurden durch RP- und NP-HPLC identifiziert. Es konnten zwei zusätzliche Peaks neben einem deutlichen Anstieg von 20-Hydroxyecdyson nachgewiesen werden. Auf Grund identischer Retentionszeiten mit Referenzsubstanzen handelt es sich bei einem Peak vermutlich um Makisteron A.Obwohl die Applikation von Azadirachtin in G. bimaculatus zu einer Senkung des Hämolymph-Ecdysteroidgehalts führte, konnte keine Anreicherung von Ecdysiotropinen erzielt werden.Die die Ecdysteroidsekretion-beeinflussenden Faktoren waren resistent gegen Kochen und Alkylierung aber nicht stabil gegen Reduzierung durch DTT und Behandlung mit Neuramidase. Damit konnte gezeigt werden, daß das Vorhandensein von Disulfidbrücken und Oligosaccharidketten für die biologische Aktivität notwendig ist.Die Aminosäuresequenz-Analyse und der enzymatische Verdau der stimulierenden Faktoren durch Exopeptidasen wiesen auf geschützte N- und C-Termini hin. Ferner wurden einige interne Peptidfragmente von fünf Proteinbanden sequenziert, die keine Homologie zu bereits bekannten regulatorischen Neuropeptiden zeigten. Als einziges bekanntes Protein aus diesem Bereich konnte das „14-3-3-like Protein“ mit Hilfe MALDI-MS identifiziert werden.Die Stimulierung der Ecdysteroidsekretion in Oenocyten von G. bimaculatus durch Oenocyten-stimulierende Faktoren (OSF) aus Kopfextrakten konnte mittels Signalstoff-Effektoren in vitro nachgeahmt werden. Außerdem wurde mit Hilfe eines RRA nachgewiesen, daß der intrazelluläre cAMP-Spiegel von Oenocyten durch OSF erhöht wird. Daraus kann geschlossen werden, daß cAMP als „Second Messenger“ an der Wirkung der OSF beteiligt ist. Calcium-Ionen schienen für die Ecdysteroidsekretion notwendig zu sein. Allerdings führte eine artifizielle Erhöhung der intrazellulären Calcium-Konzentration durch das Ionophor Ionomycin zu einer Hemmung der Sekretion. Schließlich wird ein Modell zur Erklärung des Wirkmechanismus von OSF in Gryllus bimaculatus postuliert und diskutiert.

Analyse der Mechanismen zur Regulation der Zellzyklus-abhängigen Stabilität der MARCKS-mRNA

Die Expression des PKC-Hauptsubstrates MARCKS (myristoylated alanine-rich C kinase substrate) wird in Swiss 3T3-Fibroblasten in Abhängigkeit des Zellzyklus durch Variation der mRNA-Stabilität reguliert. In der vorliegenden Arbeit wurde die Beteiligung der 3' nichttranslatierten Region (3'UTR) der MARCKS-mRNA an der Stabilitätskontrolle analysiert. Durch Einsatz der RNase/EMSA-Technik konnten zwei cis-Elemente der MARCKS 3'UTR identifiziert und lokalisiert werden, die mit RNA-bindenden Swiss 3T3-Proteinen (trans-Faktoren) interagieren. Diese neu identifizierten cis-Elemente sind AU-reiche Elemente (ARE) der Klasse III, da sie sehr große Sequenzhomologie zu ARE dieser Klasse aufweisen und der MARCKS 3'UTR, wie für ARE typisch, Instabilität vermitteln.Durch UV-crosslinking wurden vier Proteine mit Molekülmassen von 55, 40, 36 und 30 kDa nachgewiesen, die spezifisch an das 52nt lange Haupt-ARE (MARCKS 52nt) mit unterschiedlicher Affinität binden konnten. Mit Hilfe von rekombinant hergestellten ELAV/Hu-Proteinen und einem ELAV/Hu-spezifischen, affinitätsgereinigten Antiserum konnte eines der vier Proteine (p36) als das ELAV/Hu-Protein HuR identifiziert werden. Die Funktion der ELAV/Hu-Proteine für die Stabilitätskontrolle der MARCKS-mRNA ließ sich durch transiente und stabile Transfektion von HuR und neuronenspezifischem HuD mit dem Tetracyclin induzierbaren Expressionssystem (Tetoff) in Swiss 3T3- bzw. MEF/3T3-Tetoff-Zellen verdeutlichen: Durch Überexpression von HuR und HuD wurde die wachstumsinduzierte Destabilisierung der MARCKS-mRNA bei Wiedereintritt der Zellen in den Zellzyklus unterbunden.

Morphologischer und biochemischer Aufbau von Silikatnadeln der Hexactinelliden am Beispiel von Monorhaphis chuni

Schon 1904 beschrieb Schulze den Aufbau von Silikatnadeln des Schwammes Monorhaphis chuni, eines Mitglieds der zweiten Familie von biosilifizierenden Schwämmen, den Hexactinelliden (Glasschwämmen). Weitergehende morphologische Untersuchungen und biochemische Analysen insbesondere mit modernen Methoden wurden an Hexactinelliden bisher kaum durchgeführt. Ziel der vorliegenden Arbeit bestand deshalb darin, Untersuchungen zur Morphologie, der chemischen Zusammensetzung, der Verteilung und Charakterisierung der beteiligten anorganischen und organischen Komponenten sowie einen molekularbiologischer Nachweis der Existenz von Silicatein in Hexactinelliden durchzuführen. Für diese Untersuchungen wurden zwei Spezies verwendet: Monorhaphis chuni und Crateromorpha meyeri. Mittels Elektronen-Mikrosonden-Technik wurde an Querschnitten der Pfahlnadel von M. chuni die Verteilung der Elemente innerhalb der Nadel untersucht. Am äußeren Rand der Nadel (150 µm) traten im Vergleich zur Nadelmitte prägnante Unterschiede in der Konzentration von Kaliumoxid und Natriumoxid auf. Diese Ergebnisse deuten auf das Vorhandensein eines ähnlichen Transportsystems zur Anreicherung von Silizium/Silikat bei der Nadelbildung hin, wie es bereits in S. domuncula bekannt ist. Mit elektronen- und lichtmikroskopischen Untersuchungen wurden die organischen Substanzen der Silikatnadel nachgewiesen und deren Verteilung innerhalb dieser Nadeln analysiert. In der lamellaren Zone befindet sich, eine säurelabile organische Netzstruktur, sowie eine, die Silikatschichten durchspannende, säulenähnliche Struktur. Im Axialzylinder zeigt das organische Material eine leicht verzweigte fibrilläre Anordnung. Mit biochemischen Verfahren wurden die organischen Komponenten der Nadeln detaillierter untersucht. Mehrere Proteine mit Molekulargewichten von 17, 24, 27 ,30, 36 und 70 kDa wurden durch gelelektrophoretische Analysen von Material der Pfahlnadel identifiziert. Die Analyse isolierter Anteile der lamellaren Zone zeigte ausschließlich ein 27 kDa Protein. Die restlichen Proteinbanden konnten hier nicht nachgewiesen werden. Das 27 kDa Protein reagierte im Westernblot mit Antikörpern gegen Silicatein aus S. domuncula. Ein weiteres Protein wurde näher charakterisert. Ein positiver Agglutinationsassay wies ein lectinähnliches Molekül innerhalb der Nadeln nach, wie es aus S. domuncula bekannt ist. Nach einer Deglycolysierung der Proteine reduzierte sich das scheinbare Molekulargewicht der 36 kDa Bande auf 30 kDa. Durch molekularbiologische Untersuchungen wurde erstmals in Hexactinelliden die Existenz von Silicatein nachgewiesen. Nach Isolierung der Gesamt-RNA von Crateromorpha meyeri, RT-PCR und Amplifizierung mit silicateinspezifischen Primern wurde eine 549 kBp Nukleotidsequenz gefunden, die auf Aminosäureebene starke Homologien (76% identische Aminosäuren) zu bekannten Silicateinen der Demospongia aufweist. Die Aminosäuren der katalytische Triade des Silicateins, essenziell für die enzymatische Katalyse des Enzyms, sind an den selben Positionen wie bei bekannten Silicateinen vorhanden.

Escherichia coli alpha-Hämolysin: Untersuchungen zur Struktur und Porenbildung

Escherichia coli α-Hämolysin (HlyA) ist ein Prototyp der RTX-Toxine, die zu den α-porenbildenden Toxinen gehören. HlyA bildet Poren in einer Vielzahl eukaryontischer Zielzellen. Das 107 kDa große Protein besteht aus 1024 Aminosäuren, die gemeinsam mit den Proteinen für posttranslationale Modifikation und Sekretion in einem Operon codiert werden. Die N-terminale Hälfte von HlyA besteht aus mehreren amphipathischen α –Helices, die mit der Porenbildung assoziiert werden, gefolgt von der Calcium-bindenden RTX-Domäne in der C-terminalen Hälfte des Moleküls. Über den porenbildenen Mechanismus ist wenig bekannt. Die vorliegende Arbeit fokussierte sich auf die Frage, ob dieser Prozess eine Oligomerisierung mehrerer HlyA-Moleküle beinhaltet, oder ob die membranschädigende Struktur von einem Monomer gebildet wird. Drei unabhängige biochemische Methoden wurden in dem Versuch eingesetzt, HlyA-Oligomere in permeabilisierten Membranen zu detektieren. In allen drei Ansätzen wurden negative Ergebnisse erreicht, was das Konzept bestätigt, dass die Pore von HlyA von einem Monomer gebildet wird. PCR-basierte Cysteinsubstitutionen wurden durchgeführt, um den N-terminus von HlyA zu charakterisieren. Einzelne Cysteinreste wurden an 21 Positionen innerhalb der Aminosäuresequenz 13-55 eingeführt, und mit dem umgebungssensitiven Fluorophor Badan markiert. Spektrofluorimetrische Messungen zeigten, dass alle untersuchten Aminosäuren innerhalb dieser Domäne unabhängig von der porenbildenden Aktivität in die Membran inserieren. Deletionen der Aminosäuren 1-50 hatten keinen Einfluß auf die lytische Aktivität, während die Deletion der Aminosäuren 1-100 in einer fast vollständig inaktiven Toxinmutante resultierte. Die Einführung von Prolinen durch PCR-basierte Mutagenese wurde durchgeführt, um die Beteiligung vorhergesagter α-Helices innerhalb der N-terminalen Hälfte von HlyA an der hämolytischen Aktivität zu untersuchen. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Struktur von mindestens vier vorhergesagten Helices bedeutend für die hämolytische Aktivität ist.

Development of a comprehensive on-line multidimensional high performance column liquid chromatography system for protein and peptide mapping with integrated size selective sample fractionation

Aufbau einer kontinuierlichen, mehrdimensionalen Hochleistungs-flüssigchromatographie-Anlage für die Trennung von Proteinen und Peptiden mit integrierter größenselektiver ProbenfraktionierungEs wurde eine mehrdimensionale HPLC-Trennmethode für Proteine und Peptide mit einem Molekulargewicht von <15 kDa entwickelt.Im ersten Schritt werden die Zielanalyte von höhermolekularen sowie nicht ionischen Bestandteilen mit Hilfe von 'Restricted Access Materialien' (RAM) mit Ionenaustauscher-Funktionalität getrennt. Anschließend werden die Proteine auf einer analytischen Ionenaustauscher-Säule sowie auf Reversed-Phase-Säulen getrennt. Zur Vermeidung von Probenverlusten wurde ein kontinuierlich arbeitendes, voll automatisiertes System auf Basis unterschiedlicher Trenngeschwindigkeiten und vier parallelen RP-Säulen aufgebaut.Es werden jeweils zwei RP-Säulen gleichzeitig, jedoch mit zeitlich versetztem Beginn eluiert, um durch flache Gradienten ausreichende Trennleistungen zu erhalten. Während die dritte Säule regeneriert wird, erfolgt das Beladen der vierte Säule durch Anreicherung der Proteine und Peptide am Säulenkopf. Während der Gesamtanalysenzeit von 96 Minuten werden in Intervallen von 4 Minuten Fraktionen aus der 1. Dimension auf die RP-Säulen überführt und innerhalb von 8 Minuten getrennt, wobei 24 RP-Chromatogramme resultieren.Als Testsubstanzen wurden u.a. Standardproteine, Proteine und Peptide aus humanem Hämofiltrat sowie aus Lungenfibroblast-Zellkulturüberständen eingesetzt. Weiterhin wurden Fraktionen gesammelt und mittels MALDI-TOF Massenspektrometrie untersucht. Bei einer Injektion wurden in den 24 RP-Chromatogrammen mehr als 1000 Peaks aufgelöst. Der theoretische Wert der Peakkapazität liegt bei ungefähr 3000.

Das wasserlösliche Chlorophyll-Protein (WSCP): biochemische Charakterisierung und Untersuchungen zur biologischen Funktion

Das WSCP (water-soluble chlorophyll protein) der Brassicaceen ist das einzig bekannte Chlorophyll-bindende Protein, welches keine Carotinoide bindet. Es ist ein wasserlösliches, ca. 80 kDa großes Homotetramer mit 1-4 gebundenen Chlorophyllen. Das Protein ist äußerst stabil und vermag die gebundenen Chlorophylle vor Photooxidation zu schützen. Seine Funktion in der Pflanze ist bis heute ein Rätsel und sollte in dieser Arbeit zusammen mit seinen biochemischen Eigenschaften weiter aufgeklärt werden. Es wurden Versuche durchgeführt mit nativem und rekombinantem WSCP aus Blumenkohl (BoWSCP bzw. BoWSCPhis) und aus Arabidopsis thaliana (AtWSCP bzw. AtWSCPhis). Die Expressionsausbeute von BoWSCPhis konnte verbessert werden und zusätzlich wurde die Rekonstitutionsmethode für das rekombinante WSCP optimiert, sodass das pigmentierte Protein mit hoher Ausbeute und großer Reinheit gewonnen werden konnte. Zudem wurde ein neuer WSCP-Klon hergestellt, mBoWSCPhis, der in seiner Sequenz dem maturen nativen BoWSCP entspricht und weitaus weniger Aggregationsprobleme zeigte als BoWSCPhis. Weiterführende Versuche zur Stabilität und dem Oligomerisierungsgrad von WSCP haben die neue Erkenntnis erbracht, dass die Phytolschwänze der von WSCP gebundenen Chlorophylle zwar essentiell sind für die Stabilität von WSCP-Oligomeren, nicht aber für die Oligomerisierung selbst, wie es in der Literatur bislang postuliert wurde. Zusätzlich zu ihrer außerordentlichen Hitzestabilität erwiesen sich die Chl-WSCP-Komplexe als stabil in einem breiten pH-Spektrum. AtWSCPhis besaß eine vergleichbare Stabilität, und auch das Oligomerisierungsverhalten zeigte Ähnlichkeiten zu BoWSCPhis. Im Rahmen einer Forschungskooperation mit dem Institut für Optik und Atomare Physik der TU Berlin wurden zeitaufgelöste Absorptionsspektren sowie Tieftemperatur-Fluoreszenzspektren an Chl-WSCP-Komplexen gemessen. Die Ergebnisse zeigten deutlich, dass die WSCP-gebundenen Chlorophylle excitonisch gekoppelt sind und wiesen zudem auf unterschiedliche Chl-Bindungsmodi hin. Aufgrund seines einfachen Aufbaus und seines geringen Chlorophyllgehalts hat sich WSCP bei diesen Versuchen als sehr geeignetes Modellsystem erwiesen, um Messungen zur Chlorophyllbindung mit Vorhersagen aus theoretischen Modellen zu vergleichen. Bei den Experimenten zur biologischen Funktion wurden einerseits Arabidopsis thaliana WSCP-„knock-out“-Pflanzen unter verschiedenen Bedingungen charakterisiert, andererseits wurden Experimente mit rekombinantem WSCP durchgeführt, um eine mögliche Interaktion mit anderen Proteinen zu detektieren. Die vegetativen Stadien der Mutante zeigten keinen Phänotyp; das native Arabidopsis-WSCP konnte später bei der Wildtyp-Pflanze ausschließlich in jungen Schoten lokalisiert werden, was eine Erklärung hierfür lieferte. Rekombinantes WSCP konnte Chlorophylle aus nativem LHCII entfernen, eine Interaktion mit Chlorophyllase konnte jedoch nicht nachgewiesen werden; daher konnte auch die Hypothese, WSCP sei ein Chl-Carrier beim Chl-Abbau, nicht untermauert werden. Bei den durchgeführten Enzym-Assays wurde eine geringfügige Inhibition der Cysteinprotease Papain beobachtet, aber keine Inhibition der Serinprotease Trypsin, obwohl Blumenkohl-WSCP N-proximal das Motiv der Künitz-Proteaseinhibitoren besitzt. Die Frage nach der biologischen Funktion von WSCP bleibt also weiterhin offen.

Three-dimensional electron microscopy of myriapod hemocyanin, planorbid snail acetylcholine-binding protein and cyanobacterial Vipp1

Three-dimensional electron microscopy (3-D EM) provides a framework for the analysis of large protein quaternary structures. The advantage over the generally higher resolving meth- od of X-ray crystallography is the embedding of the proteins in their physiological environ- ment. However, results of the two methods can be combined to obtain superior structural information. In this work, three different protein types – (i) Myriapod hemocyanin, (ii) vesi- cle-inducing protein in plastids 1 (Vipp1) and (iii) acetylcholine-binding protein (AChBP) – were structurally analyzed by 2-D and 3-D EM and, where possible, functionally interpreted.rnMyriapod hemocyanins have been previously shown to be 6x6-meric assemblies that, in case of Scutigera coleoptrata hemocyanin (ScoHc), show two 3x6-mer planes whith a stag- gering angle of approximately 60°. Here, previously observed structural differences between oxy- and deoxy-ScoHc could be substantiated. A 4° rotation between hexamers of two dif- ferent 3x6-mer planes was measured, which originates at the most central inter-hexamer in- terface. Further information about allosteric behaviour in myriapod hemocyanin was gained by analyzing Polydesmus angustus hemocyanin (PanHc), which shows a stable 3x6-mer and divergent histidine patterns in the inter-hexamer interfaces when compared to ScoHc. Both findings would conclusively explain the very different oxygen binding properties of chilopod and diplopod hemocyanin.rnVipp1 is a protein found in cyanobacteria and higher plants which is essential for thyla- koid membrane function and forms highly variable ring-shaped structures. In the course of this study, the first 3-D analysis of Vipp1 was conducted and yielded reconstructions of six differently sized Vipp1 rings from negatively stained images at resolutions between 20 to 30 Å. Furthermore, mutational analyses identified specific N-terminal amino acids that are essential for ring formation. On the basis of these analyses and previously published results, a hypothetical model of the Vipp1 tertiary and quaternary structure was generated.rnAChBP is a water-soluble protein in the hemolymph of mollusks. It is a structural and functional homologue of the ligand-binding domain of nicotinic acetylcholine receptors. For the freshwater snail Biomphalaria glabrata, we previously described two types of AChBP (BgAChBP1 and BgAChBP2). In this work, a 6 Å 3-D reconstruction of native BgAChBP is presented, which shows a dodecahedral assembly that is unprecedented for an AChBP. Single particle analysis of recombinantely expressed BgAChBP types led to preliminary results show- ing a dodecahedral assembly of BgAChBP1 and a dipentameric assembly of BgAChBP2. This indicates divergent biological functions of the two types.