Isolierung und Charakterisierung allergener Proteine aus der Amerikanischen Schabe (Periplaneta americana)

Allergie gegen Schaben ist eine der Hauptursachen für das Auftreten von allergischem Asthma und allergischer Rhinitis. Verursacht werden diese Krankheiten durch die Schabenallergene. Obwohl bisher zahlreiche Allergene identifiziert wurden, ist bisher nicht bekannt, was ein Protein tatsächlich zu einem Allergen macht. Um die intrinsischen Eigenschaften von Allergenen besser verstehen zu können, wurden in dieser Arbeit Reinigungsprotokolle für die zwei Allergenklassen Per a 3 und Per a 9 aus der Amerikanischen Schabe entwickelt und die Allergene biochemisch und immunologisch charakterisiert. Die Besonderheit der Per a 3-Allergene liegt zum einen darin, dass bisher keine kreuzreagierenden Allergene bekannt sind und zum anderen, dass es sich um -hinsichtlich Temperatur, Harnstoff und Hydrolyse- sehr stabile hexamere Proteine handelt. Zudem sind sie in ihrer nativen hexameren Oligomerisierung stärkere Allergene und in dissoziierter Form könnten sie geeignete Kandidaten für eine Immuntherapie sein. Proteinbiochemisch sind die Per a 3-Allergene als Hexamerine einzustufen. Bei Per a 9 handelt es sich um eine monomere Arginin-Kinase mit allergenem Potential. Aufgrund der weiten Verbreitung der Arginin-Kinasen, den hohen Sequenzidentitäten zu weiteren Invertebraten-Arginin-Kinasen und den bisher bekannten Kreuzreaktionen sind diese Proteine aus Invertebraten wahrscheinlich als Pan-Allergene einzustufen.

Biochemische Charakterisierung der Zyklin-abhängigen Kinase 2,Aktivator-Komplexe des Parasiten Eimeria tenella sowie deren Nutzung in der Wirkstoffforschung

Der Stamm der Apicomplexa ist eine artenreiche Gruppe, der einzellige, meist obligat intrazelluläre Parasiten angehören, darunter auch erstzunehmende Krankheitserreger wie Plasmodium sp. sowie tierpathogene Vertreter wie Eimeria sp. und Theileria sp. Eimeria sp. verursacht die Kokzidiose beim Huhn. Diese Krankheit bedingt weltweite Verluste in der Geflügelindustrie von etwa 3 Milliarden US$ pro Jahr [DALLOUL & LILLEHOJ, 2006; SHIRLEY et al., 2007; LUCIUS & LOOS-FRANK, 2008]. Die Parasiten weisen eine hohe Resistenzbildungsrate gegen vorhandene Wirkstoffe auf. Zudem ist der Einsatz von Vakzinen mit Nebenwirkungen verbunden und für hohe Produktionskosten verantwortlich. Daher ist die Entwicklung von neuen, kostengünstigen und effektiven Kokzidiostatika eine dringend notwendige Herausforderung [KINNAIRD et al., 2004]. rnAuf Grund ihrer essentiellen, regulatorischen Funktion im eukaryotischen Zellzyklus sind Zyklin-abhängige Kinasen (CDKs) validierte Zielproteine [LEHNINGER et al., 2005]. Auch Eimeria tenella CDC2-related kinase 2 (EtCRK2) wurde bereits mittels des bekannten CDK-Inhibitors Flavopiridol als Zielprotein chemisch validiert [ENGELS et al., 2010]. Wie bei allen CDKs ist die Aktivität von EtCRK2 abhängig von der Bindung eines Aktivators, der zur Zyklin-Proteinfamilie gehört. Dieser natürliche EtCRK2-Aktivator war jedoch bislang nicht bekannt. Deshalb war ein Teil dieser Arbeit die Identifizierung des natürlichen EtCRK2-Aktivators. Bioinformatische Analysen identifizierten vier E. tenella Zyklin-ähnliche Proteine (EtCYC1, EtCYC3a, EtCYC3b und EtCYC4), die nah verwandt zu den Plasmodium falciparum-Zyklinen sind [ENGELS et al., 2010; SUÁREZ FERNÁNDEZ et al., bislang unveröffentlichte Daten]. Im Rahmen dieser Arbeit konnten zwei neue Aktivatoren identifiziert und biochemisch charakterisiert werden: der bekannte CDK-Aktivator XlRINGO und das neue E. tenella-Zyklin EtCYC3a. Nachdem der nicht-radioaktive TR-FRET-Assay für die EtCRK2 etabliert und optimiert wurde, konnte die EtCRK2-Aktivität im Komplex mit beiden Aktivatoren und weitere wichtige kinetische Parameter bestimmt werden.rnZusätzlich wurde dieser Assay zum in vitro Screening einer kommerziellen Chemikalienbibliothek auf die EtCRK2 eingesetzt, um potentielle Inhibitoren für EtCRK2 zu identifizieren. Dieses in vitro Screening gefolgt von einer in silico Hit-Anreicherung identifizierte 19 aktive Verbindungen für die durch EtCYC3a und XlRINGO aktivierte EtCRK2. Zudem wurden drei Struktur-Cluster definiert: Naphthoquinone, 8-Hydroxyquinoline und 2-Pyrimidinyl-aminopiperidin-propan-2-ole. rnDie aktivsten Vertreter von jedem Cluster wurden als Leitstrukturen ausgewählt und auf EtCRK2 und HsCDK2 getestet. Aufgrund ihrer inhibierenden Wirkung auf EtCRK2 stellen diese Verbindungen viel versprechende Leitstrukturen für die Entwicklung eines neuen Antikokzidiums dar. Hiermit konnte auch gezeigt werden, dass BES124764, der Vertreter des 2-Pyrimidinyl-aminopiperidin-propan-2-ol-Clusters, in der Lage ist, die EtCRK2 selektiv zu inhibieren. rnDaher wird BES124764 sowie einige Derivate in den Leitstruktur-Optimierungsprozess für die Auffindung eines neuen Arzneimittelkandidaten gegen Kokzidiose eingehen.rn

Funktionelle Charakterisierung der Casein Kinase 2 in der Etablierung und Aufrechterhaltung peripherer Toleranz durch dendritische Zellen

Dendritische Zellen (DCs) nehmen eine Schlüsselrolle in unserem Immunsystem ein, indem DCs sowohl Immunität, als auch Toleranz induzieren können. Im Falle der Immunität sind DCs in der Lage die Differenzierung der verschiedenen T-Helferzellen, wie Th1-, Th2- und Th17-Zellen zu steuern und tragen so zu der Qualität einer Immunantwort bei. Auf der anderen Seite können DCs in Gegenwart von TGF-β, IDO und Retinsäure die Differenzierung von regulatorischen T-Zellen induzieren und tragen somit zur Aufrechterhaltung der peripheren Toleranz bei. Insbesondere in den Darm-assoziierten lymphatischen Geweben (GALT) müssen DCs unverhältnismäßige Immunantworten gegen harmlose Antigene aus der Nahrung und kommensale Bakterien verhindern, während gegen Pathogene schützende Immunantworten induziert werden müssen. Auf Grund dieser entgegengesetzten Funktionen der DCs wollten wir die molekularen Mechanismen der DCs untersuchen, die der Regulation von Immunität und Toleranz zu Grunde liegen. Insbesondere der Wnt-Signalweg ist für die Aufrechterhaltung der peripheren Toleranz im GALT von Bedeutung. Da die Casein Kinase 2 in diesem Signalweg entscheidend beteiligt ist, haben wir die CK2-Funktion konditionell, unter der Kontrolle des CD11c-Promotors, deletiert. Hierfür haben wir CD11c-cre Mäuse mit Mäusen verpaart, welche ein von loxP-Signalsequenzen flankiertes Ck2β Gen (CK2β-fl/fl) tragen. Die konditionelle Deletion der CK2-Funktion in DCs, führte zu einer verstärkten Expression der kostimulatorischen Moleküle (wie CD40, CD80, CD86) und der Zytokine IL-6 und IL-12 unter „steady-state“ Bedingungen. Detaillierte Untersuchungen der T-Zellen in CD11c-cre x CK2β-fl/fl Mäusen zeigte eine deutlich reduzierte naive T-Zellpopulation, einhergehend mit einer erhöhten Th1- und Th17-Differenzierung. Speziell in den mesenterialen Lymphknoten konnte eine höhere Frequenz von T-bet+ und Rorγt+ CD4+ T-Zellen gefunden werden, welche große Mengen der Zytokine IFN-γ und IL-17 nach ex vivo Stimulation produzierten. Weiterführende in vivo Versuche, hier wurde das Modell der oralen Toleranz gewählt, zeigten das eine CK2-Deletion in DCs die Induktion einer oralen Toleranz verhindert. Unsere Daten zeigen eindeutig, dass die CK2 entscheidend in der Regulation der DC Homöostase und der Aufrechterhaltung der peripheren Toleranz beteiligt ist.

Regulation von "Silent mating type information regulation 2 homolog Type" 1 (SIRT1) durch die nach DNA-Schaden induzierte Kinase "Homeodomain-interaction kinase" (HIPK2)

"Silent mating type information regulation 2 Type" 1 (SIRT1), das humane Homolog der NAD+-abhängigen Histondeacetylase Sir2 aus Hefe, besitzt Schlüsselfunktionen in der Regulation des Metabolismus, der Zellalterung und Apoptose. Letztere wird vor allem durch die Deacetylierung von p53 an Lys382 und der dadurch verringerten Transkription proapoptotischer Zielgene vermittelt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die SIRT1 Regulation im Zusammenhang mit der DNA-Schadensantwort untersucht.rnIn der Apoptoseregulation übernimmt die Serin/Threonin-Kinase "Homeodomain interacting protein kinase" 2 (HIPK2) eine zentrale Rolle und daher wurde die SIRT1 Modifikation und Regulation durch HIPK2 betrachtet. Durch Phosphorylierung des Tumorsuppressorproteins p53 an Ser46 aktiviert HIPK2 das Zielprotein und induziert die Transkription proapoptotischer Zielgene von p53. Es wurde beschrieben, dass HIPK2 nach DNA-Schädigung über einen bisher unbekannten Mechnismus die Acetylierung von p53 potenzieren kann.rnIn der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass SIRT1 von HIPK2 in vitro und in Zellen an Serin 27 und 682 phosphoryliert wird. Weiterhin ist die Interaktion von SIRT1 mit HIPK2 sowie die SIRT1 Phosphorylierung an Serin 682 durch DNA-schädigende Adriamycinbehandlung erhöht. Es gibt Hinweise, dass HIPK2 die Expression von SIRT1 reguliert, da HIPK2 RNA-Interferenz zur Erniedrigung der SIRT1 Protein- und mRNA-Mengen führt.rnEin weiterer interessanter Aspekt liegt in der Beobachtung, dass Ko-Expression von PML-IV, welches SIRT1 sowie HIPK2 in PML-Kernkörper rekrutiert, die SIRT1 Phosphorylierung an Serin 682 verstärkt. Phosphorylierung von SIRT1 an Serin 682 interferiert wiederum mit der SUMO-1 Modifikation, welche für die Lokalisation in PML-Kernkörpen wichtig ist.rnBemerkenswerterweise reduziert die DNA-schadendsinduzierte SIRT1 Phosphorylierung die Bindung des SIRT1 Ko-Aktivators AROS, beeinflusst aber nicht diejenige des Inhibitors DBC1. Dies führt zur Reduktion der enzymatischen Aktivität von SIRT1 und der darausfolgenden weniger effizienten Deacetylierung des Zielproteins p53.rnDurch die von mir in der vorliegenden Promotionsarbeit erzielten Ergebnisse konnte ein neuer molekularer Mechanismus entschlüsselt werden, welcher die durch HIPK2 modulierte Acetylierung von p53 und die daran anschließende Induktion der Apoptose beschreibt.rnHIPK2-vermittelte SIRT1 Phosphorylierung resultiert in einer verminderten Deacetylasefunktion von SIRT1 und führt so zu einer verstärkten acetylierungsinduzierten Expression proapoptotischer p53 Zielgene.