Expression profiling und rationale Expressionsoptimierung am Beispiel eines prokaryontischen Wirt-,Vektor-Systems

Durch globale Expressionsprofil-Analysen auf Transkriptom-, Proteom- oder Metabolom-Ebene können biotechnologische Produktionsprozesse besser verstanden und die Erkenntnisse für die zielgerichtete, rationale Optimierung von Expressionssystemen genutzt werden. In der vorliegenden Arbeit wurde die Überexpression einer Glukose-Dehydrogenase (EC 1.1.5.2), die von der Roche Diagnostics GmbH für die diagnostische Anwendung optimiert worden war, in Escherichia coli untersucht. Die Enzymvariante unterscheidet sich in sieben ihrer 455 Aminosäuren vom Wildtyp-Enzym und wird im sonst isogenen Wirt-/Vektor-System in signifikant geringeren Mengen (Faktor 5) gebildet. Das prokaryontische Expressionssystem wurde auf Proteom-Ebene charakterisiert. Die 2-dimensionale differenzielle Gelelektrophorese (DIGE) wurde zuvor unter statistischen Aspekten untersucht. Unter Berücksichtigung von technischen und biologischen Variationen, falsch-positiven (α-) und falsch-negativen (β-) Fehlern sowie einem daraus abgeleiteten Versuchsdesign konnten Expressionsunterschiede als signifikant quantifiziert werden, wenn sie um den Faktor ≥ 1,4 differierten. Durch eine Hauptkomponenten-Analyse wurde gezeigt, dass die DIGE-Technologie für die Expressionsprofil-Analyse des Modellsystems geeignet ist. Der Expressionsstamm für die Enzymvariante zeichnete sich durch eine höhere Variabilität an Enzymen für den Zuckerabbau und die Nukleinsäure-Synthese aus. Im Expressionssystem für das Wildtyp-Enzym wurde eine unerwartet erhöhte Plasmidkopienzahl nachgewiesen. Als potenzieller Engpass in der Expression der rekombinanten Glukose-Dehydrogenase wurde die Löslichkeitsvermittlung identifiziert. Im Expressionsstamm für das Wildtyp-Enzym wurden viele Proteine für die Biogenese der äußeren Membran verstärkt exprimiert. Als Folge dessen wurde ein sog. envelope stress ausgelöst und die Zellen gingen in die stationäre Wuchsphase über. Die Ergebnisse der Proteomanalyse wurden weiterführend dazu genutzt, die Produktionsleistung für die Enzymvariante zu verbessern. Durch den Austausch des Replikationsursprungs im Expressionsvektor wurde die Plasmidkopienzahl erhöht und die zelluläre Expressionsleistung für die diagnostisch interessantere Enzymvariante um Faktor 7 - 9 gesteigert. Um die Löslichkeitsvermittlung während der Expression zu verbessern, wurde die Plasmidkopienzahl gesenkt und die Coexpression von Chaperonen initiiert. Die Ausbeuten aktiver Glukose-Dehydrogenase wurden durch die Renaturierung inaktiven Produkts aus dem optimierten Expressionssystem insgesamt um einen Faktor von 4,5 erhöht. Somit führte im Rahmen dieser Arbeit eine proteombasierte Expressionsprofil-Analyse zur zielgerichteten, rationalen Expressionsoptimierung eines prokaryontischen Modellsystems.

1-, 2- and 3-dimensional phenylene-based materials for optoelectronic applications

A series of oligo-phenylene dendronised conjugated polymers was prepared. The divergent synthetic approach adopted allowed for the facile synthesis of a range of dendronised monomers from a common intermediate, e.g. first and second generation fluorene. Only the polymerisation of the first generation and alkylarylamine substituted dendronised fluorene monomers yielded high molecular weight materials, attributed to the low solubility of the remaining dendronised monomers. The alkylarylamine substituted dendronised poly(fluorene) was incorporated into an organic light emitting diode (OLED) and exhibited an increased colour stability in air compared to other poly(fluorenes). The concept of dendronisation was extended to poly(fluorenone), a previously insoluble material. The synthesis of the first soluble poly(fluorenone) was achieved by the incorporation of oligo-phenylene dendrons at the 4-position of fluorenone. The dendronisation of fluorenone allowed for a polymer with an Mn of 4.1 x 104 gmol-1 to be prepared. Cyclic voltammetry of the dendronised poly(fluorenone) showed that the electron affinity of the polymer was high and that the polymer is a promising n-type material. A dimer and trimer of indenofluorene (IF) were prepared from the monobromo IF. These oligomers were investigated by 2-dimensional wide angle x-ray spectroscopy (2D-WAXS), polarised optical microscopy (POM) and dielectric spectroscopy, and found to form highly ordered smetic phases. By attaching perylene dye as the end-capper on the IF oligomers, molecules that exhibited efficient Förster energy transfer were obtained. Indenofluorene monoketone, a potential defect structure for IF based OLED’s, was synthesised. The synthesis of this model defect structure allowed for the long wavelength emission in OLED’s to be identified as ketone defects. The long wavelength emission from the indenofluorene monoketone was found to be concentration dependent, and suggests that aggregate formation is occurring. An IF linked hexa-peri-hexabenzocoronene (HBC) dimer was synthesised. The 2D-WAXS images of this HBC dimer demonstrate that the molecule exhibits intercolumnar organisation perpendicular to the extrusion direction. POM images of mixtures of the HBC dimer mixed with an HBC with a low isotropic temperature demonstrated that the HBC dimer is mixing with the isotropic HBC.

Synthese und Selbstorganisation von Perylendiimid-Oligonucleotid-Konjugaten

Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Methode entwickelt, Perylendiimidfarbstoffe mit Oligonucleotiden in der Lösung zu verknüpfen. Das Ziel der Arbeit war die nicht-kovalente Synthese von Perylendiimid-DNA- und Protein- supramolekularen Strukturen. Dabei werden die molekularen Erkennungseigenschaften von DNA und Proteinen zunutze gemacht. Insgesamt drei Themenbereiche wurden dabei betrachtet: 1. Synthese und Hybridisierung von symmetrischen und asymmetrischen Perylendiimid-bis(oligonucleotid)-konjugaten für die Bildung supramolekularer Strukturen, 2. Erzeugung von Oberflächenstrukturen auf der Basis von Streptavidin-Perylendiimid-Komplexen, 3. Synthese wasserlöslicher Rylenfarbstoffe für Anwendungen in biologischen Systemen. Zur Synthese und Hybridisierung von Perylendiimid-Oligonucleotid-Konjugaten wurde eine neue Idee verfolgt und erfolgreich realisiert. Dabei handelt es sich um die Synthese von Perylendiimid-DNA-Polymeren durch nicht-kovalente Bindungen. Die Basis des entwickelten Konzepts ist die Ausnutzung der Erkennungseigenschaften der DNA, um Perylendiimidmoleküle in eine lineare Makrostruktur zu organisieren, was sonst nur durch komplizierte chemische Polymersynthese zugänglich wäre. Die Selbstorganisation von zwei komplementären Perylendiimid-bis(oligonucleotid)-konjugaten (PODN1 und PODN2), die an der 5`-Position verknüpft sind, führte zu einem linearen Perylendiimid-DNA-Polymer in der Form von …ABABABAB…., das mit Hilfe von Gelelektrophorese charakterisiert wurde. Eindrucksvoll war auch die erfolgreiche Kopplung des hydrophoben Perylendiimids mit zwei unterschiedlichen Oligonucleotidsequenzen in der Lösung, um asymmetrische Perylendiimid-bis(oligonucleotid)-konjugate zu synthetisieren. Mit solchen asymmetrischen Konjugaten konnte die programmierbare Selbstorganisation der Perylendiimid-Oligonucleotide zu einer definierten Polymerstruktur realisiert werden. Die Synthese von PDI-(biotin)2 wurde vorgestellt. Durch die spezifische Erkennungseigenschaft zwischen Biotin und Streptavidin ist es möglich, eine Oberflächenstruktur zu bilden. Die Immobilisierungsexperimente zeigten, dass das PDI (biotin)2 Streptavidin erkennen und binden kann. Dabei konnte eine multischichtige Nanostruktur (5 Doppelschichten) auf einer Goldoberfläche.

Strategies to identify and further characterize novel and known genes involved in regulation of skeletogenesis

372 osteochondrodysplasias and genetically determined dysostoses were reported in 2007 [Superti-Furga and Unger, 2007]. For 215 of these conditions, an association with one or more genes can be stated, while the molecular changes for the remaining syndromes remain illusive to date. Thus, the present dissertation aims at the identification of novel genes involved in processes regarding cartilage/ bone formation, growth, differentiation and homeostasis, which may serve as candidate genes for the above mentioned conditions. Two different approaches were undertaken. Firstly, a high throughput EST sequencing project from a human fetal cartilage library was performed to identify novel genes in early skeletal development (20th week of gestation until 2nd year of life) that could be investigated as potential candidate genes. 5000 EST sequences were generated and analyzed representing 1573 individual transcripts, corresponding to known (1400) and to novel, yet uncharacterized genes (173). About 7% of the proteins were already described in cartilage/ bone development or homeostasis, showing that the generated library is tissue specific. The remaining profile of this library was compared to previously published libraries from different time points (8th–12th, 18th–20th week and adult human cartilage) that also showed a similar distribution, reflecting the quality of the presented library analyzed. Furthermore, three potential candidate genes (LRRC59, CRELD2, ZNF577) were further investigated and their potential involvement in skeletogenesis was discussed. Secondly, a disease-orientated approach was undertaken to identify downstream targets of LMX1B, the gene causing Nail-Patella syndrome (NPS), and to investigate similar conditions. Like NPS, Genitopatellar syndrome (GPS) is characterized by aplasia or hypoplasia of the patella and renal anomalies. Therefore, six GPS patients were enrolled in a study to investigate the molecular changes responsible for this relatively rare disease. A 3.07 Mb deletion including LMX1B and NR5A1 (SF1) was found in one female patient that showed features of both NPS and GPS and investigations revealed a 46,XY karyotype and ovotestes indicating true hermaphroditism. The microdeletion was not seen in any of the five other patients with GPS features only, but a potential regulatory element between the two genes cannot be ruled out yet. Since Lmx1b is expressed in the dorsal limb bud and in podocytes, proteomic approaches and expression profiling were performed with murine material of the limbs and the kidneys to identify its downstream targets. After 2D-gel electrophoresis with protein extracts from E13.5 fore limb buds and newborn kidneys of Lmx1b wild type and knock-out mice and mass spectrometry analysis, only two proteins, agrin and carbonic anhydrase 2, remained of interest, but further analysis of the two genes did not show a transcriptional down regulation by Lmx1b. The focus was switched to expression profiles and RNA from newborn Lmx1b wild type and knock-out kidneys was compared by microarray analysis. Potential Lmx1b targets were almost impossible to study, because of the early death of Lmx1b deficient mice, when the glomeruli, containing podocytes, are still immature. Because Lmx1b is also expressed during limb development, RNA from wild type and knock-out Lmx1b E11.5 fore limb buds was investigated by microarray, revealing four potential Lmx1b downstream targets: neuropilin 2, single-stranded DNA binding protein 2, peroxisome proliferative activated receptor, gamma, co-activator 1 alpha, and short stature homeobox 2. Whole mount in situ hybridization strengthened a potential down regulation of neuropilin 2 by Lmx1b, but further investigations including in situ hybridization and protein-protein interaction studies will be needed.

Iodine speciation in atmospheric aerosols in the marine boundary layer

Iodine chemistry plays an important role in the tropospheric ozone depletion and the new particle formation in the Marine Boundary Layer (MBL). The sources, reaction pathways, and the sinks of iodine are investigated using lab experiments and field observations. The aims of this work are, firstly, to develop analytical methods for iodine measurements of marine aerosol samples especially for iodine speciation in the soluble iodine; secondly, to apply the analytical methods in field collected aerosol samples, and to estimate the characteristics of aerosol iodine in the MBL. Inductively Coupled Plasma – Mass Spectrometry (ICP-MS) was the technique used for iodine measurements. Offline methods using water extraction and Tetra-methyl-ammonium-hydroxide (TMAH) extraction were applied to measure total soluble iodine (TSI) and total insoluble iodine (TII) in the marine aerosol samples. External standard calibration and isotope dilution analysis (IDA) were both conducted for iodine quantification and the limits of detection (LODs) were both 0.1 μg L-1 for TSI and TII measurements. Online couplings of Ion Chromatography (IC)-ICP-MS and Gel electrophoresis (GE)-ICP-MS were both developed for soluble iodine speciation. Anion exchange columns were adopted for IC-ICP-MS systems. Iodide, iodate, and unknown signal(s) were observed in these methods. Iodide and iodate were separated successfully and the LODs were 0.1 and 0.5 μg L-1, respectively. Unknown signals were soluble organic iodine species (SOI) and quantified by the calibration curve of iodide, but not clearly identified and quantified yet. These analytical methods were all applied to the iodine measurements of marine aerosol samples from the worldwide filed campaigns. The TSI and TII concentrations (medians) in PM2.5 were found to be 240.87 pmol m-3 and 105.37 pmol m-3 at Mace Head, west coast of Ireland, as well as 119.10 pmol m-3 and 97.88 pmol m-3 in the cruise campaign over the North Atlantic Ocean, during June – July 2006. Inorganic iodine, namely iodide and iodate, was the minor iodine fraction in both campaigns, accounting for 7.3% (median) and 5.8% (median) in PM2.5 iodine at Mace Head and over the North Atlantic Ocean, respectively. Iodide concentrations were higher than iodate in most of the samples. In the contrast, more than 90% of TSI was SOI and the SOI concentration was correlated significantly with the iodide concentration. The correlation coefficients (R2) were both higher than 0.5 at Mace Head and in the first leg of the cruise. Size fractionated aerosol samples collected by 5 stage Berner impactor cascade sampler showed similar proportions of inorganic and organic iodine. Significant correlations were obtained in the particle size ranges of 0.25 – 0.71 μm and 0.71 – 2.0 μm between SOI and iodide, and better correlations were found in sunny days. TSI and iodide existed mainly in fine particle size range (< 2.0 μm) and iodate resided in coarse range (2.0 – 10 μm). Aerosol iodine was suggested to be related to the primary iodine release in the tidal zone. Natural meteorological conditions such as solar radiation, raining etc were observed to have influence on the aerosol iodine. During the ship campaign over the North Atlantic Ocean (January – February 2007), the TSI concentrations (medians) ranged 35.14 – 60.63 pmol m-3 among the 5 stages. Likewise, SOI was found to be the most abundant iodine fraction in TSI with a median of 98.6%. Significant correlation also presented between SOI and iodide in the size range of 2.0 – 5.9 μm. Higher iodate concentration was again found in the higher particle size range, similar to that at Mace Head. Airmass transport from the biogenic bloom region and the Antarctic ice front sector was observed to play an important role in aerosol iodine enhancement. The TSI concentrations observed along the 30,000 km long cruise round trip from East Asia to Antarctica during November 2005 – March 2006 were much lower than in the other campaigns, with a median of 6.51 pmol m-3. Approximately 70% of the TSI was SOI on average. The abundances of inorganic iodine including iodine and iodide were less than 30% of TSI. The median value of iodide was 1.49 pmol m-3, which was more than four fold higher than that of iodate (median, 0.28 pmol m-3). Spatial variation indicated highest aerosol iodine appearing in the tropical area. Iodine level was considerably lower in coastal Antarctica with the TSI median of 3.22 pmol m-3. However, airmass transport from the ice front sector was correlated with the enhance TSI level, suggesting the unrevealed source of iodine in the polar region. In addition, significant correlation between SOI and iodide was also shown in this campaign. A global distribution in aerosol was shown in the field campaigns in this work. SOI was verified globally ubiquitous due to the presence in the different sampling locations and its high proportion in TSI in the marine aerosols. The correlations between SOI and iodide were obtained not only in different locations but also in different seasons, implying the possible mechanism of iodide production through SOI decomposition. Nevertheless, future studies are needed for improving the current understanding of iodine chemistry in the MBL (e.g. SOI identification and quantification as well as the update modeling involving organic matters).

Untersuchungen über ADAMTS13 in Gerinnungsfaktorpräparaten

Zusammenfassung rnIn der vorliegenden Arbeit wurden sechs VWF/FVIII Gerinnungsfaktorkonzentrate unterschiedlicher Chargen auf ihre ADAMTS13 Aktivität, Antigen und VWF Multimere untersucht. Grund dafür ist die Annahme, dass bei der Aufkonzentrierung des VWFs möglicherweise auch erhöhte Mengen an ADAMTS13 vorhanden sind. Wäre dies nachweisbar, könnten die entsprechenden Konzentrate auch Anwendung bei TTP Patienten finden. Neben den Gerinnungsfaktorkonzentraten wurden ebenfalls die zur Plasmapherese verwendeten Therapeutika FFP und s/d Plasma analysiert. Es soll getestet werden, ob Unterschiede hinsichtlich der Qualität zwischen den Präparaten bestehen und inwiefern die Blutgruppen eine Auswirkung auf die ADAMTS13 Aktivität/Antigen haben. Überdies wurde die Bedeutung von ADAMTS13 als wichtiges diagnostisches Merkmal im Rahmen der Gegenüberstellung von Patienten mit thrombotischen Mikroangiopathien erörtert. Alle angewandten Methoden wurden zudem kritisch miteinander verglichen und auf ihre Eignung für die klinische Diagnostik getestet. Zur Untersuchung der ADAMTS13 Aktivität kamen drei unterschiedliche Methoden zur Anwendung, die BCS-Methode nach Böhm und zwei FRET Kits (Technozym®ADAMTS13/ActifluorTMADAMTS13). Für die Bestimmung des ADAMTS13 Antigen wurde das Technozym®ADAMTS13 Kit verwendete als auch der Imubind®ELISA angewendet. Mittels der SDS-Gelelektrophorese konnten die VWF Multimere dargestellt werden. Die Untersuchungen konnten zeigen, dass nur in Haemate®P, deutlich höhere ADAMTS13 Aktivitäten (12,3% bzw. 470ng/ml) sowie ein physiologische Antigenwerte vorlagen. Die anderen Faktorkonzentrate wiesen entweder nur sehr geringe bzw. keine Aktivitäten auf. Das Antigen lag bei allen Konzentraten im nachweisbaren Bereich. Folglich ist ein Einsatz von Haemate®P bei der Therapie der TTP, insbesondere bei hereditären Formen sowie bei Kindern, die durch eine Plasmapherese stark belastet werden, und bei Schwangeren, könnten, in Erwägung zu ziehen und innerhalb der Klinik zu testen. Die Plasmapräparate FFP und Octaplas® wiesen in allen Untersuchungen ADAMTS13 Aktivitäten und Antigen im mittleren bis hohen physiologischen Bereich auf. Insbesondere bei Blutgruppe 0 ließ sich beiden Präparaten eine höhere ADAMTS13 Aktivität und Antigen gegenüber den drei anderen Blutgruppen darstellen. Insgesamt waren die interindividuellen Schwankungen bei FFP deutlich höher als bei Octaplas®, was sich in der unterschiedlichen Herstellung der Präparate begründen lässt. Octaplas® ist also genauso geeignet zur Plasmapherese bei der TTP wie FFP, kann jedoch aufgrund seiner intensiveren Virusinaktivierung eine größere Sicherheit aufweisen und stellt sich auch in der Klinik als nebenwirkungsärmer dar. Bei der Gegenüberstellung der thrombotischen Mikroangiopathien konnte gezeigt werden, dass eine verminderte ADAMTS13 Aktivität ein wichtiges Unterscheidungsmerkmal ist und auch während der Remission schon diagnostizierbar werden kann. Auf der Grundlage der labordiagnostischen Werte und dem klinischen Erscheinungsbild im akuten Schub und in der Remission konnte ein diagnostischer Algorithmus für den klinischen Alltag erstellt werden. In der Methodenvalidierung erwies sich der ActifluorTMADAMTS13 Kit als der beste Kit, da er innerhalb kürzester Zeit zuverlässige Werte in Standardeinheiten liefert. Nach neuesten Erkenntnissen, bei der eine Unterscheidung von ADAMTS13 Aktivitäten über und unter 5 % von großer prognostischer Bedeutung sind, ist die BCS-Methode nach Böhm mit einer unteren Nachweisgrenze von 6,2% zu ungenau und auch hinsichtlich ihres Zeitaufwandes eher ungünstig.rn