Influence of the chemokine CXCL12 on the progression and the signaling in colorectal cancer

Das Chemokin CXCL12 (auch bekannt als SDF-1) ist ein kleines Protein (8-14) KDa, das in sechs Isoformen exprimiert wird (SDF-1α, SDF-1β, SDF-1γ, SDF- 1δ, SDF-1ε und SDF-1θ) von einem einzigen Gen, dass die Leukozyten-Wanderung regelt und variabel in einer Reihe von normalen und Krebsgeweben exprimiert wird.rnCXCL12 spielt verschiedene Rollen in der Tumorpathogenese. Es wurde nachgewiesen, dass CXCL12 das Tumorwachstum und die Malignität fördert, die Tumorangiogenese stärkt, sich an der Metastasierung beteiligt und zu immunsuppressiven Netzwerken innerhalb des Tumormikromilieus beiträgt. Daher liegt es nahe, dass der CXCL12/CXCR4-Signalweg ein wichtiges Ziel ist für die Entwicklung von neuartigen Krebstherapien.rnUm Licht auf die Rolle der Chemokin CXCL12 Splicevarianten in der Entwicklung von Krebs zu werfen und die mögliche physiologische Relevanz und ihre möglichen funktionellen Unterschiede bei Darmkrebs zu verstehen, haben wir alle CXCL12 Splicevarianten (alpha, beta, gamma, delta, epsilon und theta) in die kolorektalen Zelllinie SW480 und die Melanomzellinie D05 transfiziert und exprimiert.rnrnDiese Arbeit wurde erstellt, um die folgenden Ziele zu erreichen. Untersuchung der Rolle von CXCL12 Splicevarianten bei der Vermittlung von Tumorprogression, Adhäsion, Migration, Invasion und Metastasierung von Darmkrebs. Untersuchung, ob die CXCL12 Variantenwege ein wichtiges Ziel für die Entwicklung von Krebstherapien darstellen.rn• Um eine in vivo Mausmodell zu entwickeln, um die Rolle der CXCL12 Varianten im Rahmen des Tumorwachstums zu verstehen.rnrnUnsere Ergebnisse zeigen, dass:Der CXCL12 G801A Polymorphismus ist ein Low-Penetranz Risikofaktor für die Entwicklung von Darmkrebs. Der CXCL12-Gen-Polymorphismus rs1801157 ist mit dem T-Status (Tumor-node-Metastasen) assoziiert. Es gab keine Beziehung zwischen CXCL12-Gen-Polymorphismus rs1801157 und Fernmetastisen oder LN metastasen. Alle sechs CXCL12 Splicevarianten werden im Darmkrebs und in gesunder Kolon mucosa exprimiert. Die höchste Expression wird bei SDF-1alpha, dann SDF-1 beta gefunden. Alle sechs CXCL12 Varianten zeigen erhöhte Tumorzellproliferation in vitro. SDF-1beta, gefolgt von SDF-1alpha zeigte die größte Aktivität im Proliferationsassay.rn• Alle sechs CXCL12 Varianten induzieren die Tumorzelladhäsion.SDF-1beta dann SDF-1alpha zeigte die größte Aktivität im Rahmen des Adhäsionsassay. Alle sechs CXCL12 Varianten erhöhten die Zellmigration und Invasion von Tumorzellen in vitro. SDF-1theta und SDF-1epsilon 1theta zeigten die größte Aktivität, während die schwächste Aktivität mit SDF-1alpha und SDF-1beta beobachtet wurde. Alle sechs CXCL12 Varianten aktivieren Akt und (MAPK) Mitogen- acktivatedierte Protein kinase Wege und damit die Regulierung viele essentieller Prozesse in Tumorzellen, wie Proliferation, Migration, Invasion und Adhäsion. Es ist interessant festzustellen, dass AMD3100 die CXCL12 Splicevarianten inhibriert, die AKT-MEK-1/2-Phosphorylierung induzieren.rnDer Inhibitor AMD3100 unterdrückt stark die CXCL12 Varianten -delta, -epsilon und theta-und unterdrückt schwach CXCL12-gamma. während es keine signifikante Wirkung auf CXCL12-alpha und beta hatte. Es hat möglicherweise Auswirkungen auf mehrere große Signalwage in Bezug auf Proliferation, Migration und Invasions.rn• Es ist wichtig anzumerken, dass die Hemmung von CXCL12-Varianten durch AMD3100 einen der möglichen Ansaätze in der Krebstherapie darstellen kann.Wir schlagen vor, dass weitere Studien erwogen werden, die wir brauchen, um die biologische Aktivität dieser neuen CXCL12 Varianten bei verschiedenen Arten von Krebs klar zu verstehen.

Bedeutung der viralen IE4-Region für die Genexpression und Replikation des humanen Cytomegalovirus

Das humane Cytomegalovirus (HCMV) ist ein fakultativ-pathogener Erreger, der bei Patienten mit geschwächter oder unausgereifter Immunabwehr schwerwiegende Erkrankungen hervorrufen kann. Wie alle Herpesviren zeigt das HCMV eine streng koordinierte Expression viraler Gene, die in eine „sehr frühe-“ (IE), „frühe “ (E) und „späte-“ (L) Phase unterteilt werden kann. Die Produkte der IE-Gene IE1 und IE2 sind für die Expression der frühen Gene und somit für die Initiation der viralen DNA-Replikation entscheidend. Sie greifen gleichzeitig in den zellulären Stoffwechsel ein und schaffen damit optimale Vorraussetzungen für die virale Vermehrung. Zu Beginn dieser Arbeit war bekannt, dass HCMV in lytisch infizierten Zellen ein abundantes IE-Transkript von 5 kb (IE4-RNA) exprimierte, dessen Funktion bislang unklar war. Ältere Publikationen deuteten darauf hin, dass die IE4-Genregion an der Transformation eukaryonter Zellen beteiligt sein könnte. Neuere Arbeiten zeigten, dass es sich bei diesem IE4-Transkript um ein metabolisch stabiles Intron handelt. Im Rahmen dieser Arbeit sollte zunächst geklärt werden, ob die IE4-Genregion ein Protein kodiert. In der Folge sollten mit viralen Deletionsmutanten Hinweise auf die biologische Funktion des IE4-Bereichs erarbeitet werden. Durch Northern Blot Analysen und cDNA-Klonierungsexperimente konnte eine Reihe neuer Spleiß-Varianten der IE4-RNA identifiziert werden. Durch Sequenzanalysen wurde gezeigt, dass diese Transkripte keine längeren offenen Leserahmen enthalten. Zusammen mit bereits publizierten Erkenntnissen, kann aus diesen Ergebnissen mit hoher Wahrscheinlichkeit geschlossen werden, dass die IE4 Region nicht für ein Protein kodiert. Zur Analyse der biologischen Funktion der IE4-Region wurde das DNA-Genom des HCMV gezielt mutagenisiert. Eine phänotypische Analyse der entsprechenden Viren mittels Reportergen-Tests und quantitativer RealTime RT-PCR zeigte, dass einige der Mutanten eine verringerte Expression früher Gene aufwiesen, die mit einer Beeinträchtigung ihrer Replikationsfähigkeit in Fibroblastenkulturen korrelierte. Dabei war die Ausbildung eines Phänotyps jedoch von dem genetischen Hintergrund des verwendeten viralen Ausgangsstammes abhängig. Auffällig war, dass phänotypische Veränderungen nur bei solchen Mutanten sichtbar wurden, die auf der Grundlage des Laborstammes Ad169 des HCMV generiert worden waren. Die nachfolgende Analyse der Ausgangsstämme ergab deutliche Unterschiede in der IE-Genexpression. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen somit, dass die IE4-RNA mit hoher Wahrscheinlichkeit nicht für ein Protein kodiert, aber bei limitierender Expression der essentiellen Regulatoren IE1 und IE2 die frühe lytische Genexpression stimuliert. Die Ergebnisse dieser Arbeit stellen die Grundlage für nachfolgende Untersuchungen zur Aufklärung der molekularen Funktion der IE4-RNA im Rahmen der lytischen Infektion des HCMV dar.

Expression der pronozizeptiven Vanilloidrezeptoren TRPV1 und TRPV2 und des antinozizeptiven Cannabinoidrezeptors CB1 in Spinalganglienneuronen der Ratte

Nozizeptive Spinalganglienneurone detektieren mit einer Vielzahl liganden- und spannungsgesteuerter Ionenkanäle noxische Reize, d.h. Reize, die eine Gewebeschädigung bewirken können, wandeln sie in Aktionspotenzialentladungen um und leiten sie über das Rückenmark zum Gehirn weiter, wo eine Schmerzempfindung ausgelöst wird. Die pronozizeptiven transienten Rezeptor-Potenzial-Kanäle der Vanilloidrezeptorfamilie, TRPV1 und TRPV2, sind die klassischen Transduktionsmoleküle für noxische Hitzereize in den Spinalganglien und werden von Reiztemperaturen über 43°C bzw. 52°C aktiviert. Daneben finden sich auch antinozizeptive Membranproteine, wie z.B. der metabotrope Cannabinoidrezeptor CB1. Er koppelt an spannungsgesteuerte Kaliumkanäle, die neben Natrium- und Kalziumkanälen ebenfalls an der neuronalen Erregbarkeit beteiligt sind. Von den spannungsgesteuerten Kaliumkanälen könnte der Kv1.4, der einen schnell inaktivierenden A-Strom vermittelt, an antinozizeptiven Signalwegen beteiligt sein. Um die molekulare Physiologie der Regulation von Nozizeption und Antinozizeption zu charakterisieren, wurde die Expression bzw. Ko-Expression dieser Membranproteine auf der einen als auch die funktionelle Charakterisierung von TRPV1 auf der anderen Seite im Soma der Spinalganglienneurone und im heterologen Expressionssystem untersucht. TRPV1 wurde in je einem Drittel und TRPV2 in je einem Zehntel aller Spinalganglienneurone nachgewiesen. Das Expressionsmuster veränderte sich nicht zwischen verschiedenen Präparationsmethoden, die zur Aufarbeitung der Zellen für unterschiedliche experimentelle Ansätze notwendig sind. Somit können die aus Expressionsanalysen und funktionellen Untersuchungen gewonnenen Ergebnisse miteinander verglichen werden. Obwohl TRPV1 und TRPV2 in unterschiedlich großen Zellen exprimiert werden, überlappen dennoch ihre Größenverteilungen. Durch Ko-Expressionsanalysen konnten hier erstmalig TRPV1-TRPV2-ko-exprimierende Neurone detektiert werden. Mit dem neu entwickelten N-terminalen Antikörper gegen TRPV1 (3C11) konnte gezeigt werden, dass für TRPV1 verschiedene Splice-Varianten existieren. Neben den bereits bekannten Splice-Varianten wurde hier die neue Variante Vr.3’sv isoliert. Diese besitzt zwischen Exon 15 und 16 eine Insertion aus 104 Basen und exprimiert daher einen veränderten C-Terminus. Trotz dieser Veränderung bildeten sich im heterologen Expressionssystem funktionelle Kanäle aus, die im Gegensatz zu den anderen Varianten immer noch durch Capsaicin aktivierbar waren. Vr.3’sv könnte als Homo- oder Heterotetramer die Eigenschaften TRPV1-positiver Neurone beeinflussen. Bei der Bestimmung der Häufigkeit von TRPV1 in einem Gewebe ist somit die Wahl des Antikörpers von entscheidender Bedeutung. Für TRPV2 dagegen gibt es hier keine Hinweise auf Splice-Varianten. TRPV1 wird durch das Vanilloid Capsaicin aktiviert, wobei diese Substanz neurotoxisch ist und eine Degeneration von Neuronen und epidermalen Nervenfasern bewirkt. Hier wurde nun gezeigt, dass unabhängig von den Splice-Varianten nicht alle TRPV1-positiven Neurone bei langer Inkubationszeit absterben. Funktionelle Untersuchungen belegten, dass auch Capsaicin-sensitive Zellen unter dem Einfluss des Agonisten überleben können. Dieser Schutzmechanismus wird möglicherweise von den verschiedenen Splice-Varianten vermittelt. Ko-Expressionsanalysen zeigten, dass der spannungsgesteuerte Kaliumkanal Kv1.4 in nahezu allen TRPV1- aber nicht TRPV2-positiven Neuronen exprimiert wird. Desweiteren ko-exprimierten nahezu alle TRPV1-positiven Neurone auch den Cannabinoidrezeptor CB1. Diese fast vollständige Ko-Lokalisation von CB1 und Kv1.4 in nozizeptiven Spinalganglienneuronen spricht für eine funktionell synergistische Aktivität. Der Kaliumkanal kann unter der regulativen Kontrolle von CB1 als Vermittler von A-Typ-Kaliumströmen an der Kontrolle der repetitiven Entladungen in der Peripherie und der Transmitterausschüttung zentral beteiligt sein. Es ergeben sich daraus Ansatzpunkte für die Entwicklung neuer Medikamente. Mit Kv1.4-Aktivatoren und/oder peripher wirkenden Cannabinoiden könnten die Nebenwirkungen der Cannabinoide im zentralen Nervensystem umgangen werden.

Funktionelle Analyse der beiden Zinkfinger-Homöodomänentranskriptionsfaktoren Zfh-1 und Zfh-2 während der Entwicklung des Nervensystems von Drosophila melanogaster

Diese Arbeit charakterisiert die Funktion und das Expressionmuster der beiden Zinkfinger-Homöodomänentranskriptionsfaktoren zfh1 und zfh2 von Drosophila melanogaster. Das zfh2 Gen wurde hierbei vor allem molekular charakterisiert. Es wurden eine Vielzahl möglicher Spleißformen identifiziert, welche das regulatorische Potential von Zfh2 enorm erweitern. Für Überexpressionsexperimente wurde zudem erstmalig die cDNA des längsten zfh2-Transkriptes kloniert. Durch Analysen an zfh1 Mutanten konnte gezeigt werden, dass zfh1 sowohl notwendig ist für die embryonale Entwicklung von Motoneuronen, als auch das larvale Wachstum motoneuronaler Endplatten reguliert. Wegen weit reichender pleiotroper Effekte, die zfh1 Funktionsverlustmutanten haben, war es notwendig, neben dem Einsatz hypomorpher Allele auf die Analyse genetischer Mosaike auszuweichen. Die als MARCM-Technik (Lee und Luo, 1999) bezeichnete Methode zur Erzeugung genetischer Mosaike wurde modifiziert um in dieser Arbeit erstmals für die Analyse mutanter larvaler Motoneurone eingesetzt werden zu können. Weitergehend konnte gezeigt werden, dass Zfh1 notwendig ist für die larvale Expression des Neuropeptides FMRFamid. Anhand von Sequenzvergleichen und durch Verwendung eines fmrfamid-Promoterkonstruktes (Benveniste et al., 1998) konnten Hinweise dafür gesammelt werden, dass die Zfh1-abhängige Regulation sehr wahrscheinlich direkter Natur ist. Bei fmrfamid handelt es sich somit um das erste identifizierte neurale Zielgen von Zfh1, an dem sich zudem modellhaft der molekulare Wirkmechanismus von Zfh1 erforschen lässt.

Microstructure of epitaxial thin films of the ferromagnetic shape memory alloy Ni 2 MnGa

Gegenstand dieser Arbeit ist die Präparation und die ausführliche Charakterisierung epitaktischer Dünnschicht-Proben der Heusler Verbindung Ni2MnGa. Diese intermetallische Verbindung zeigt einen magnetischen Formgedächtnis-Effekt (MFG), der sowohl im Bezug auf mögliche Anwendungen, als auch im Kontext der Grundlagenforschung äußerst interessant ist. In Einkristallen nahe der Stöchiometrie Ni2MnGa wurden riesige magnetfeldinduzierte Dehnungen von bis zu 10 % nachgewiesen. Der zugrundeliegende Mechanismus basiert auf einer Umverteilung von kristallographischen Zwillings-Varianten, die eine tetragonale oder orthorhombische Symmetrie besitzen. Unter dem Einfluss des Magnetfeldes bewegen sich die Zwillingsgrenzen durch den Kristall, was eine makroskopische Formänderung mit sich bringt. Die somit erzeugten reversiblen Längenänderungen können mit hoher Frequenz geschaltet werden, was Ni2MnGa zu einem vielversprechenden Aktuatorwerkstoff macht. rnDa der Effekt auf einem intrinsischen Prozess beruht, eignen sich Bauteile aus MFG Legierungen zur Integration in Mikrosystemen (z.B. im Bereich der Mikrofluidik). rnrnBislang konnten große magnetfeldinduzierte Dehnungen nur für Einkristalle und Polykristalle mit hoher Porosität („foams") nachgewiesen werden. Um den Effekt für Anwendungen nutzbar zu machen, werden allerdings Konzepte zur Miniaturisierung benötigt. Eine Möglichkeit bieten epitaktische dünne Filme, die im Rahmen dieser Arbeit hergestellt und untersucht werden sollen. Im Fokus stehen dabei die Optimierung der Herstellungsparameter, sowie die Präparation von freitragenden Schichten. Zudem werden verschiedene Konzepte zur Herstellung freistehender Mikrostrukturen erprobt. Mittels Röntgendiffraktometrie konnte die komplizierte Kristallstruktur für verschiedene Wachstumsrichtungen verstanden und die genaue Verteilung der Zwillingsvarianten aufgedeckt werden. In Verbindung mit Mikroskopie-Methoden konnte so die Zwillingsstruktur auf verschiedenen Längenskalen geklärt werden. Die Ergebnisse erklären das Ausbleiben des MFG Effekts in den Proben mit (100) Orientierung. Andererseits wurde für Schichten mit (110) Wachstum eine vielversprechende Mikrostruktur entdeckt, die einen guten Ausgangspunkt für weitere Untersuchungen bietet.rnDurch die spezielle Geometrie der Proben war es möglich, Spektroskopie-Experimente in Transmission durchzuführen. Die Ergebnisse stellen den ersten experimentellen Nachweis der Änderungen in der elektronischen Struktur einer metallischen Verbindung während des martensitischen Phasenübergangs dar. Durch Messen des magnetischen Zirkulardichroismus in der Röntgenabsorption konnten quantitative Aussagen über die magnetischen Momente von Ni und Mn getroffen werden. Die Methode erlaubt überdies die Beiträge von Spin- und Bahn-Moment separat zu bestimmen. Durch winkelabhängige Messungen gelang es, die mikroskopische Ursache der magnetischen Anisotropie aufzuklären. Diese Ergebnisse tragen wesentlich zum Verständnis der komplexen magnetischen und strukturellen Eigenschaften von Ni2MnGa bei.rn