Etablierung eines Triple-Kultur-Modells der oberen Atemwege unter Einbeziehung immunkompetenter Zellen

Organophosphate können chronische Lungenerkrankungen und Vergiftungen hervorrufen. Bei der Vergiftung erfolgt eine Immunreaktion, welche noch nicht erforscht ist. In dieser Arbeit wurden Toxizitätsstudien an dendritischen Zellen und einem bronchialen Triple-Kultur-Modell durchgeführt. Dendritische Zellen spielen bei der ersten Immunabwehr in der Lunge eine große Rolle. Aus der Zell-Linie THP-1 und primären Monozyten wurden reife dendritische Zellen differenziert und mittels Durchflusszytometrie und Immunfluoreszenz auf spezifische Zellmarker, wie zum Beispiel CD11c, CD83 oder auch CD209, charakterisiert und etabliert. Durch die Vergiftung der Zellen mit Dimethoat und Chlorpyrifos konnte eine Erhöhung des Zelltodes, die Sekretion von proinflammatorischen Mediatoren, Veränderungen in der Morphologie der Zellen und ein Effekt auf den Proteinkinase-Signalweg festgestellt werden. Spezifische dendritische Zellmarker (CD83, CD209) wurden inhibiert und die Dendriten der Dendritischen Zellen kürzer und beschädigt. Die Schädigung von Chlorpyrifos war erheblich größer, als die bei Dimethoat.rnDie weiteren Toxizitätsstudien wurden an einem bronchialen Triple-Kultur-Modell durchgeführt. Hierzu wurden auf Transwell-Filtermembranen bronchiale Epithelzellen, Fibroblastenzellen und Dendritische Zellen verwendet. Die bronchialen Epithelzellen und Fibroblastenzellen waren hier physiologisch voneinander getrennt, konnten aber durch Poren in der Membran miteinander interagieren. Die Etablierung des Triple-Kultur-Modells erfolgte durch die Untersuchung von Entzündungsprozessen, durch Stimulation mit LPS, TNF-alpha und Interferon-gamma. In der Ko-Kultur konnten Zell-Zell-Kontakt Schädigungen und Erhöhung von proinflammatorischen Markern, wie zum Beispiel IL-1ß, IL-6 oder auch IL-8 gemessen werden. Versuche in der Triple-Kultur zeigten den positiven Effekt von Dendritischen Zellen. Bei höheren Konzentrationsbereichen von Dimethoat und Chlorpyrifos konnte ein Wandern der Zellen zu den geschädigten Zell-Zell-Kontakten nachgewiesen werden. Die Ausschüttung der proinflammatorischen Mediatoren wurde inhibiert, vor allem bei IL-10 war eine deutliche Reduktion, um mehr als 70% messbar. Ebenso konnten Veränderungen in dem Apoptose-Signalblick festgestellt werden. Vor allem anti-apoptotische Proteine wurden nach einer Vergiftung der Triple-Kultur induziert. Interventionsstudien mit Vitamin C zeigten allerdings keinen positiven Effekt.

The interaction of Leishmania major parasites with human myeloid cells and its consequence for adaptive immunity

In der vorliegenden Arbeit fokussierten wir uns auf drei verschiedene Aspekte der Leishmanien-Infektion. Wir charakterisierten den Prozess des Zelltods „Apoptose“ bei Parasiten (1), untersuchten die Eignung von Makrophagen und dendritischen Zellen als Wirtszelle für die Entwicklung der Parasiten (2) und analysierten die Konsequenzen der Infektion für die Entstehung einer adaptiven Immunantwort im humanen System. Von zentraler Bedeutung für dieses Projekt war die Hypothese, dass apoptotische Leishmanien den Autophagie-Mechanismus ihrer Wirtszellen ausnutzen, um eine T-Zell-vermittelte Abtötung der Parasiten zu vermindern.rnWir definierten eine apoptotische Leishmanien-Population, welche durch eine rundliche Morphologie und die Expression von Phosphatidylserin auf der Parasitenoberfläche charakterisiert war. Die apoptotischen Parasiten befanden sich zudem in der SubG1-Phase und wiesen weniger und fragmentierte DNA auf, welche durch TUNEL-Assay nachgewiesen werden konnte. Bei der Interaktion der Parasiten mit humanen Makrophagen und dendritischen Zellen zeigte sich, dass die anti-inflammatorischen Makrophagen anfälliger für Infektionen waren als die pro-inflammatorischen Makrophagen oder die dendritischen Zellen. Interessanterweise wurde in den dendritischen Zellen jedoch die effektivste Umwandlung zur krankheitsauslösenden, amastigoten Lebensform beobachtet. Da sowohl Makrophagen als auch dendritische Zellen zu den antigenpräsentierenden Zellen gehören, könnte dies zur Aktivierung der T-Zellen des adaptiven Immunsystems führen. Tatsächlich konnte während der Leishmanien-Infektion die Proliferation von T-Zellen beobachtet werden. Dabei stellten wir fest, dass es sich bei den proliferierenden T-Zellen um CD3+CD4+ T-Zellen handelte, welche sich überraschenderweise als Leishmanien-spezifische CD45RO+ T-Gedächtniszellen herausstellten. Dies war unerwartet, da ein vorheriger Kontakt der Spender mit Leishmanien als unwahrscheinlich gilt. In Gegenwart von apoptotischen Parasiten konnte eine signifikant schwächere T-Zell-Proliferation in Makrophagen, jedoch nicht in dendritischen Zellen beobachtet werden. Da sich die T-Zell-Proliferation negativ auf das Überleben der Parasiten auswirkt, konnten die niedrigsten Überlebensraten in dendritischen Zellen vorgefunden werden. Innerhalb der Zellen befanden sich die Parasiten in beiden Zelltypen im Phagosom, welches allerdings nur in Makrophagen den Autophagie-Marker LC3 aufwies. Chemische Induktion von Autophagie führte, ebenso wie die Anwesenheit von apoptotischen Parasiten, zu einer stark reduzierten T-Zell-Proliferation und dementsprechend zu einem höheren Überleben der Parasiten.rnZusammenfassend lässt sich aus unseren Daten schließen, dass Apoptose in Einzellern vorkommt. Während der Infektion können sowohl Makrophagen, als auch dendritische Zellen mit Leishmanien infiziert und das adaptive Immunsystem aktivert werden. Die eingeleitete T-Zell-Proliferation nach Infektion von Makrophagen ist in Gegenwart von apoptotischen Parasiten reduziert, weshalb sie im Vergleich zu dendritischen Zellen die geeigneteren Wirtszellen für Leishmanien darstellen. Dafür missbrauchen die Parasiten den Autophagie-Mechanismus der Makrophagen als Fluchtstrategie um das adaptive Immunsystem zu umgehen und somit das Überleben der Gesamtpopulation zu sichern. Diese Ergebnisse erklären den Vorteil von Apoptose in Einzellern und verdeutlichen, dass der Autophagie-Mechanismus als potentielles therapeutisches Ziel für die Behandlung von Leishmaniose dienen kann.rn