Regulation of Nox4 expression by histone deacetylases in human endothelial cells : involvement of epigenetic mechanisms

Nox4 is a member of the NADPH oxidase family, which represents a major source of reactive oxygen species (ROS) in the vascular wall. Nox4-mediated ROS production mainly depends on the expression levels of the enzyme. The aim of my study was to investigate the mechanisms of Nox4 transcription regulation by histone deacetylases (HDAC). Treatment of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) and HUVEC-derived EA.hy926 cells with the pan-HDAC inhibitor scriptaid led to a marked decrease in Nox4 mRNA expression. A similar down-regulation of Nox4 mRNA expression was observed by siRNA-mediated knockdown of HDAC3. HDAC inhibition in endothelial cells was associated with enhanced histone acetylation, increased chromatin accessibility in the human Nox4 promoter region, with no significant changes in DNA methylation. In addition, the present study provided evidence that c-Jun played an important role in controlling Nox4 transcription. Knockdown of c-Jun with siRNA led to a down-regulation of Nox4 mRNA expression. In response to scriptaid treatment, the binding of c-Jun to the Nox4 promoter region was reduced despite the open chromatin structure. In parallel, the binding of RNA polymerase IIa to the Nox4 promoter was significantly inhibited as well, which may explain the reduction in Nox4 transcription. In conclusion, HDAC inhibition decreases Nox4 transcription in human endothelial cells by preventing the binding of transcription factor(s) and polymerase(s) to the Nox4 promoter, most likely because of a hyperacetylation-mediated steric inhibition. In addition, HDAC inhibition-induced Nox4 downregulation may also involves microRNA-mediated mRNA destabilization, because the effect of the scriptaid could be partially blocked by DICER1 knockdown or by transcription inhibition.

Die Rolle der IFN-gamma Signalübertragung und von MyD88 in der Angiotensin-II-induzierten vaskulären Dysfunkion, Inflammation und arteriellen Hypertonie

Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Rolle von myelomonozytären Zellen, IFN-gamma (Interferon gamma), MyD88 (myeloid differentiation factor 88) und zugrundeliegenden Signalwege in der Angiotensin II (ATII)-induzierten vaskulären Inflammation, Dysfunktion und arteriellen Hypertonie untersucht. Wie bereits veröffentlichte Vordaten aus meiner Arbeitsgruppe zeigten, schützt die Depletion von Lysozym M (LysM)+ myelomonozytären Zellen (Diphteriatoxin-vermittelt in Mäusen, die transgen für den humanen Diphtheriatoxin-Rezeptor sind, LysMiDTR Mäuse) vor der ATII-induzierten vaskulären Dysfunktion und arterieller Hypertonie, und kann durch adoptiven Zelltransfer von Wildtyp Monozyten wiederhergestellt werden. In meiner Arbeit konnte ich zeigen, dass die Rekonstitution von Monozyten-depletierten LysMiDTR Mäusen mit Wildtyp Monozyten den Phänotyp der vaskulären Dysfunktion wiederherstellen kann, die Rekonstitution mit gp91phox-/y oder Agtr1-/- Monozyten jedoch nicht. Die Hypertonus-mediierenden Effekte dieser infiltrierenden Monozyten scheinen demnach von der intakten ATII und NADPH Oxidase Signalübertragung in diesen Zellen abhängig zu sein. Vermutlich ebenfalls für die Aktivierung der Monozyten funktionell wichtig sind IFN-gamma, produziert durch NK-Zellen, und der Transkriptionsfaktor T-bet (T-box expressed in T cells), exprimiert von NK-Zellen und Monozyten. IFN-gamma-/- Mäuse waren partiell geschützt vor der ATII-induzierten vaskulären Dysfunktion und charakterisiert durch reduzierte Level an Superoxid im Gefäß im Vergleich zu ATII-infundierten Wildtyp Mäusen. IFN-gamma-/- und T-bet defiziente Tbx21-/- Mäuse zeichneten sich ferner durch eine reduzierte ATII-mediierte Rekrutierung von NK1.1+ NK-Zellen, als ein Hautproduzent von IFN-gamma, sowie CD11b+GR-1low Interleukin-12 (IL-12) kompetenten Monozyten aus. Durch Depletions- und adoptive Transferexperimente konnte ich in dieser Arbeit NK-Zellen als essentielle Mitstreiter in der vaskulären Dysfunktion identifizieren und stellte fest, dass T-bet+LysM+ myelomonozytäre Zellen für die NK-Zellrekrutierung in die Gefäßwand und lokale IFN-gamma Produktion benötigt werden. Damit wurde erstmals NK-Zellen eine essentielle Rolle in der ATII-induzierten vaskulären Dysfunktion zugeschrieben. Außerdem wurde der T-bet-IFN-gamma Signalweg und die gegenseitige Monozyten-NK-Zellaktivierung als ein potentielles therapeutisches Ziel in kardiovaskulären Erkrankungen aufgedeckt. Des Weiteren identifizierte ich in meiner Arbeit MyD88 als ein zentrales Signalmolekül in der ATII-getriebenen Inflammation und vaskulären Gefäßschädigung. MyD88 Defizienz reduzierte den ATII-induzierten Anstieg des systolischen Blutdrucks und die endotheliale und glattmuskuläre vaskuläre Dysfunktion. Zusätzlich waren die vaskuläre Superoxid-Bildung sowie die Expressionslevel der NADPH Oxidase, der wichtigsten Quelle für oxidativem Stress im Gefäß, in ATII-infundierten MyD88-/- Mäusen im Vergleich zum Wildtyp reduziert. Mit Hilfe von durchflusszytometrischen Analysen deckte ich zudem auf, dass die ATII-induzierte Einwanderung von CD45+ Leukozyten, insbesondere CD11b+Ly6G-Ly6Chigh inflammatorischen Monozyten in MyD88-/- Mäusen signifikant abgeschwächt war. Diese Resultate wurden durch immunhistochemische Untersuchung von Aortengewebe auf CD68+, F4/80+ und Nox2+ Makrophagen/Phagozyten sowie Expressionsanalysen von Inflammationsmarkern untermauert. Analysen der mRNA Expression in Aortengewebe zeigten ferner eine in Wildtyp Mäusen nach ATII Infusion tendenziell gesteigerte Expression von inflammatorischen Monozytenmakern sowie eine abnehmende Expression von reparativen Monozytenmarken, während dieser Shift zu einem proinflammatorsichen Phänotyp in MyD88-/- blockiert zu sein schien. Dies zeigt eine Rolle von MyD88 in der terminalen Differenzierung von myelomonozytären Zellen an. Um dies weitergehend zu untersuchen und aufzudecken, ob die MyD88 Effekte abhängig sind von Zellen der hämatopoetischen Linie oder Gewebszellen, wurden Knochenmarktransferexperimente durchgeführt. MyD88 Defizienz in Knochenmark-abstammende Zellen reduzierte die ATII-induzierte vaskuläre Dysfunktion und Infiltration der Gefäßwand mit CD45+ Leukozyten und inflammatorischen myelomonozytären Zellen. Die protektiven Effekte der MyD88 Defizienz in der Angiotensin II-induzierten Inflammation konnten nicht auf Signalwege über die Toll-like Rezeptoren TLR2, -7 oder -9 zurückgeführt werden, wie die Untersuchung der vaskulären Reaktivität entsprechender Knockout Mäuse zeigte. Zusammenfassend konnte ich in meiner Arbeit zeigen, dass die Infiltration der Gefäßwand mit Nox2+AT1R+T-bet+MyD88+ myelomonozytären Zellen und die Wechselwirkung und gegenseitige Aktivierung dieser Zellen mit IFN-gamma produzierenden NK-Zellen eine zentrale Bedeutung in der Pathogenese der Angiotensin II (ATII)-induzierten vaskulären Dysfunktion, Inflammation und arteriellen Hypertonie einnehmen.

Analyse der Wirkung des Naturstoffes Oxacyclododecindion in einem chronisch-inflammatorischen Krankheitsmodell

Die medikamentöse Standardtherapie entzündlich-rheumatischer Erkrankungen wie der rheumatoider Arthritis (RA) und des systemischen Lupus erythematodes (SLE) sind oft unzureichend und erlauben keine nebenwirkungsarme beziehungsweise -freie Behandlung. Daher ist es von großem Interesse für diese Indikationsgebiete, wirkungsvolle Substanzen zu entwickeln, die für eine Langzeittherapie geeignet sind. Naturstoffe wie Oxacyclododecindion (Oxa) können dabei als mögliche Leitstruktur dienen. Oxa wurde bereits in in-vitro Untersuchungen als ein potenter Inhibitor der Expression von proinflammatorischen und profibrotischen Genen identifiziert. rnZiel dieser Arbeit war es in in-vivo Modellen der RA und des SLEs das therapeutische Potential des Naturstoffes Oxa aufzuklären. Da eine Etablierung der Kollagen-induzierten Arthritis im untersuchten murinen RA-Modell, dem HLA-DR4.AE° Stamm, nicht möglich war, wurden die Untersuchungen ausschließlich im MRL Faslpr Mausstamm, einem anerkannten SLE-Modell durchgeführt. MRL Faslpr Mäuse entwickeln wie SLE-Patienten unter anderem eine schwerwiegende Glomerulonephritis. rnIn den Nieren weiblicher MRL Faslpr Mäuse konnte die Oxa-Behandlung die Expression zahlreicher proinflammatorischer Mediatoren beeinflussen, die in Zusammenhang mit der Pathogenese des humanen SLE gebracht werden. So reduziert der Naturstoff die Expression von Zytokinen wie TNFα, IFNγ und IL6 als auch Chemokinen wie CCL2, CSF-1 und RANTES auf mRNA- und Proteinebene. Dabei war die Wirkung von Oxa in den in-vivo Analysen ähnlich gut wie die des potenten Glukokortikoids Dexamethason. Die Reduktion chemotaktischer Moleküle durch die Oxa-Behandlung führte nachweislich zu einer reduzierten Akkumulation von Immunzellen. Die anti-inflammatorischen und immunmodulatorischen Effekte von Oxa waren so ausgeprägt, dass klinisch-pathologische Marker der Glomerulonephritis, wie die Ablagerung von Immunkomplexen, die vermehrte Bildung von Kollagenfasern und die Ausscheidung von Proteinen im Urin gemildert wurden. Weiterführende Untersuchungen im SLE Modell konnten neue Zielmoleküle von Oxa identifizieren, wie KIM1 und zahlreiche SLE-assoziierte microRNAs (miR 19a, 29c und 369). Diese Befunde legen nahe, dass Oxa eine vielversprechende anti-entzündliche und -fibrotische Verbindung darstellt. rnDie Entschlüsselung des Wirkmechanismus von Oxa steht erst am Anfang. Die Analysen im Rahmen dieser Arbeit zeigten jedoch, dass Oxa einen Einfluss auf die Phosphorylierung und somit Aktivierung der p38 MAPK sowie auf die mRNA-Stabilität von proinflammatorischen Zytokinen wie TNFα zu haben scheint.rn