Impact of folate absorption and transport for nutrition and drug targeting

In this thesis, interactions of folic acid with tea and tea components at the level of intestinal absorption have been investigated. Firstly, the interaction between folic acid and tea as well as tea catechins was studied in vitro, using Caco-2 cell monolayers and secondly, a clinical trial was designed and carried out. In addition, targeting of folic acid conjugated nanoparticles to FR expressing Caco-2 cells was studied in order to evaluate the principle of nutrient-receptor-coupled transport for drug targeting. In the first part of this work, it was shown that EGCG and ECG (gallated catechins) inhibit folic acid uptake (IC50 of 34.8 and 30.8 µmol/L) comparable to MTX (methotrexate) under these experimental conditions. Moreover, commercial green and black tea extracts inhibited folic acid uptake with IC50 values of approximately 7.5 and 3.6 mg/mL, respectively. These results clearly indicate an interaction between folic acid and green tea catechins at the level of intestinal uptake. The mechanism responsible for the inhibition process might be the inhibition of the influx transport routes for folates such as via RFC and/or PCFT. For understanding the in vivo relevance of this in vitro interaction, a phase one, open-labeled, randomized, cross-over clinical study in seven healthy volunteers was designed. For the 0.4 mg folic acid dose, the mean Cmax decreased by 39.2% and 38.6% and the mean AUC0 decreased by 26.6% and 17.9% by green tea and black tea, respectively. For the 5 mg folic acid dose, the mean Cmax decreased by 27.4% and mean AUC0 decreased by 39.9% when taken with green tea. The results of the clinical study confirm the interaction between tea and folic acid in vivo leading to lower bioavailabilities of folic acid. In the second part of the thesis, targeting studies using folic acid conjugated nanoparticles were conducted. Folic acid conjugated nanoparticles were shown to be internalized by the cell via FR (folate receptor) mediated endocytosis. DNA block copolymer micelles equipped with 2, 11 and 28 folic acid units respectively were applied on FR expressing Caco-2 cells. There was a direct proportion in the amount of internalized nanoparticle and the number of folic acid units on the periphery of the nanoparticle. To sum up, throughout this thesis, the importance of folic acid for nutrition and nutrient and drug related interactions of folic acid at intestinal level was shown. Furthermore, significance of FRs in targeting for cancer chemotherapy was demonstrated in in vitro cell culture experiments. Folic acid conjugated DNA block copolymer micelles were suggested as efficient nanoparticles for targeted drug delivery.

Electrostatically self-assembled nanoparticles based on biomolecules

In this work, two different systems were investigated to develop fundamental understanding of the self-assembly behavior of polyelectrolytes and small organic counterions with a certain geometry. Complexes formed were characterized by light scattering in solution, as well as UV-Vis spectroscopy, analytical ultracentrifugation, gel electrophoresis, zeta potential and IR spectroscopy. The morphologies of the aggregates were observed by AFM in dried state on surface. The charge ratio, the valence and the structure of the counterion were shown to represent key parameters in the complexation. The influence of polyelectrolyte type and molecular weights was also determined for the structure formed.rnrnOne system was mainly focused on the association of double-strand DNA with non-intercalating divalent and tetravalent organic counterions. The other model system involved linear NaPSS and oligolysines. In addition, various influences on the morphology of the charged self-assembly complexes in AFM studies were discussed. It was shown that electrostatic self-assembly of DNA and non-intercalating counterions as well as of a linear synthetic polyelectrolyte with oligolysine counterions that can build mutual hydrogen bonds can yield supramolecular aggregates of a defined size. Various morphologies (flower-like, rod-like, toroidal and spherical) of the assemblies were obtained for different combinations of polyelectrolyte and counterions. Results presented in this work are of importance for the fundamental understanding of the association behavior of various polyelectrolytes and organic counterions. The selection of biopolymers for the study may give an opportunity to transfer the basic research results into biological applications, such as gene therapy or drug delivery.rn

Stress & structure of thin polymer brush films

Polymer brushes have unique properties with a large variety of possible applications ranging from responsive coatings and drug delivery to lubrication and sensing. For further development a detailed understanding of the properties is needed. Established characterization methods, however, only supply information of the surface. Experimental data about the inner “bulk” structure of polymer brushes is still missing.rnScattering methods under grazing incidence supply structural information of surfaces as well as structures beneath it. Nanomechanical cantilevers supply stress data, which is giving information about the forces acting inside the polymer brush film. In this thesis these two techniques are further developed and used to deepen the understanding of polymer brushes. rnThe experimental work is divided into four chapters. Chapter 2 deals with the preparation of polymer brushes on top of nanomechanical cantilever sensors as well as large area sample by using a “grafting-to” technique. The further development of nanomechanical cantilever readout is subject of chapter 3. In order to simplify cantilever sensing, a method is investigated which allows one to perform multiple bending experiments on top of a single cantilever. To do so, a way to correlate different curvatures is introduced as well as a way to conveniently locate differently coated segments. In chapter 4 the change in structure upon solvent treatment of mixed polymer brushes is investigated by using scattering methods and nanomechanical cantilevers amongst others. This allows one to explain the domain memory effect, which is typically found in such systems. Chapter 5 describes the implementation of a phase shifting interferometer - used for readout of nanomechanical cantilevers - into the µ-focused scattering beamline BW4, allowing simultaneous measurements of stress and structure information. The last experimental chapter 6 deals with the roughness correlation in polymer brushes and its dependence on the chain tethered density.rnIn summary, the thesis deals with utilization of new experimental techniques for the investigation of polymer brushes and further development of the techniques themselves.rn

Einfluss verschiedener nanopartikulärer Systeme auf die zelluläre Aufnahme und Zytotoxizität

Die vorliegende Dissertation untersucht Nanopartikel und Nanokapseln aus verschiedenen Materialien mit verschiedenen Modifikationen für einen zielgerichteten Medikamententransport (Drug Targeting). Obwohl bisher zahlreiche Nanopartikel und -kapseln synthetisiert wurden, besteht nach wie vor hinsichtlich der zellulären Verträglichkeit, Biokompatibilität und Aufnahme kein allumfassendes Verständnis. Mit Hilfe der in dieser Arbeit vorgestellten Untersuchungen und Ergebnissen soll ein Beitrag zur Schließung dieser Lücke geleistet werden.rnIm Rahmen der vorliegenden Dissertation wurde der Einfluss der Herstellungsmaterialien PS, PLLA, PMMA, Biomakromoleküle (BSA, DNA), ggf. stabilisiert durch HPMA-LMA-Copolymere und neu-synthetisierte Surfmere, der Formmodifikationen Streckung und Kristallisierung, der Oberflächenmodifikationen mittels verschiedener Tenside und PEG auf die zelluläre Aufnahme und Verträglichkeit hin untersucht.rnZusammenfassend lässt sich die Aussage treffen, dass zahlreiche Materialien zur Herstellung von Trägersystemen geeignet sind und sich als biokompatibel und nicht-zytotoxisch erwiesen haben, sich jedoch stark hinsichtlich der Aufnahmeeffizienz in verschiedene Zelllinien unterscheiden. rnIm ersten Abschnitt (Kapitel 5.1) wurden in der ersten und zweiten Untersuchung auf allgemeine Parameter, die die Aufnahme von Nanopartikeln beeinflussen, eingegangen. Hier wurde der Einfluss des Alters von PLLA-Partikeln auf die zelluläre Aufnahme und Toxizität untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass mit zunehmender Materialalterung die zelluläre Aufnahme abnimmt. Eine Zytotoxizität konnte nicht gezeigt werden.rnWeiterhin wurde der Einfluss des FCS-Gehalts des Zell-Mediums auf die zelluläre Aufnahme von PMMA-Partikeln untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass mit einer steigenden FCS-Konzentration eine Abnahme der zellulären Aufnahme von PMMA-Partikeln einhergeht. Die höchste zelluläre Aufnahme konnte bei einem FCS-Gehalt des Zellmediums von 0,05% verzeichnet werden. rnIm zweiten Abschnitt (Kapitel 5.2) wurde die Stabilisierung von Nanopartikeln mittels neusynthetisierter Tenside und deren Einfluss auf die Zelle-Nanopartikel-Interaktionen untersucht. Dazu wurde zum einen die Oberflächenfunktionalisierung von Nanopartikeln mit Hilfe neu-synthetisierter „Surfmere“ und deren Einfluss auf die zelluläre Aufnahme und Toxizität untersucht. Die hergestellten Surfmere bewirken gleichzeitig eine Stabilisierung und Funktionalisierung der Nanopartikeloberfläche mit Phosphonatgruppen. Hier wurden kovalente „Surfmer“ stabilisierte Nanopartikel mit Tensid- (SDP) stabilisierten Nanopartikeln verglichen. Zudem wurden dialysierte Nanopartikel mit nicht-dialysierten verglichen. Bezüglich der zellulären Aufnahme konnte für die mittels Dialyse gereinigten Nanopartikel eine gute Aufnahme ohne Unterschiede zwischen den kovalent und nicht-kovalent Phosphonat-funktionalisierten Partikeln beobachtet werden. Die ungereinigten, SDP-stabilisierte, nicht-kovalent gebundene Nanopartikel zeigten hingegen eine bis zu 30% stärkere Aufnahme in die HeLa-Zellen und hMSCs.rnWeiterhin der Einsatz von mit HPMA-LMA-Copolymeren stabilisierte Polystyrol- und PLLA-Partikel, die den Einsatz von Tensiden während des Miniemulsionsprozesses überflüssig machen, untersucht. Auch hier konnte keine Zytotoxizität nachgewiesen werden. Die Aufnahme in HeLa-Zellen scheint mehr von der Größe der Nanopartikel als vom verwendeten Material und in hMSCs mehr von den Oberflächeneigenschaften der Nanopartikel abzuhängen.rnIm dritten Abschnitt (Kapitel 5.3) wird auf die Möglichkeit der Formmodifikation von Polystyrol-Partikeln und deren Einfluss auf die Nanopartikel-Zelle-Interaktionen eingegangen. Es geht dabei um die Aufnahme und Zytotoxizität von verstreckten (elongierten) Polystyrol-Partikeln im Vergleich zu sphärischen Nanopartikeln, sowie die Aufnahme und Zytotoxizität von kristallinen Polystyrol-Partikeln in verschiedene Zelllinien. Bei den verstreckten Partikeln nimmt die Aufnahme-Effizienz in HeLa-Zellen und hMSCs mit zunehmender Verstreckung ab. Eine Zytotoxizität konnte für keinen der erwähnten Nanopartikel nachgewiesen werden. Bei den Polystyrol-Partikeln unterschiedlicher Taktizität zeigen die kristallierten Polystyrol-Partikel eine geringfügig besser Aufnahme-Rate als die nicht-kristallierten Polystyrol-Partikel. Dabei zeigen die nach dem Herstellungsprozess mittels der Lösemittelverdampfungstechnik der wässrigen Phase entnommenen Partikel eine bessere Aufnahme als die nach der Verdampfung des Chloroforms verfügbaren Partikel. Insgesamt konnte jedoch für alle Polystyrol-Partikel trotz der unterschiedlichen Taktizitäten nach der Aufnahme in HeLa-Zellen und hMSCs mittels Durchflusszytometrie hohe Fluoreszenz-Intensitäten verzeichnet werden. Setzt man hohe Fluoreszenz-Intensitäten bei in Zellen aufgenommenen Partikeln mit guten Aufnahmeraten gleich, sind die hier dargestellten Aufnahmeraten als sehr gut zu bezeichnen. rnAuf Nanosysteme mit einer reduzierten zellulären Aufnahme wird im letzten Abschnitt (Kapitel 5.4) eingegangen. Dabei wird zum einen die unterschiedliche Oberflächenmodifikation von Polystyrol-Partikeln mit dem Co-Monomer PEG-MA und den Tensiden SDS und Lutensol AT50 untersucht. Von PEG-MA wurden zudem verschiedene Molekulargewichte (Mn=300 g•mol-1 und Mn=2080 g•mol-1) und verschiedene Konzentrationen (1,5%, 5%, 10%) eingesetzt. Ein Teil der Partikel wurde mit SDS und der andere Teil mit Lutensol AT50 hergestellt. In einem weiteren Schritt wurde das jeweilig gegenteilige Tensid (statt SDS Lutensol AT50 und umgekehrt) eingesetzt, um zu überprüfen, ob sich der zuvor beobachtete Effekt umkehren lässt. Anschließend wurde ein erst mit SDS stabilisierter Nanopartikel (BR01) mit verschiedenen Lutensol AT50-Anteilen (5%, 10%, 25%, 50%, 100%) redispergiert. Die effizienteste Aufnahme zeigte der unmodifizierte, mit SDS stabilisierte Nanopartikel BR01, die niedrigste der ebenfalls unmodifizierte, mit Lutensol AT50 stabilisierte Nanopartikel BR02. Eine steigende Konzentration des PEG-MA Mn=300 g•mol-1 hemmt die Aufnahme von mit SDS stabilisierten Partikeln konstant. Für PEG-MA Mn=2080 g•mol-1 konnte hingegen kein Einfluss nachgewiesen werden. Für die mit Lutensol AT50 stabilisierten Partikel konnte kein Einfluss von PEG-MA nachgewiesen werden. Daraus resultiert, dass der Einsatz von physikalisch adsorbiertem Lutensol AT50 die zelluläre Aufnahme effektiver hemmt als der Einsatz von kovalent gebundenem PEG-MA unterschiedlicher Kettenlänge.rnDer Einsatz von mit Biomakromolekülen hergestellten Nanokapseln, die mit zwei verschiedenen Tensiden (SDS und Lutensol AT50) stabilisiert wurden, wurde im Weiteren näher untersucht. Bei den mit SDS stabilisierten Kapseln erwiesen sich die mit ssDNA hergestellten Kapseln BN-54 und BN-55 als leicht toxisch für die HeLa-Zellen. Dagegen sind alle eingesetzten, mit Lutensol AT50 redispergierten Nanokapseln sowohl für HeLa-Zellen als auch für hMSCs zytotoxisch. Hier ist die toxische Wirkung auf das nicht-ionische Tensid Lutensol AT50 zurückzuführen. Eine zelluläre Aufnahme konnte für keine mit Biomakromolekülen hergestellten Nanokapsel nachgewiesen werden.rnDen Abschluss der Untersuchungen bildet die vergleichende Analyse der in dieser Arbeit mit dem Fluoreszenzfarbstoff PMI versehenen Partikeln hinsichtlich deren Aufnahme in HeLa-Zellen und hMSCs und deren zytotoxische Auswirkungen. In der vergleichenden Analyse werden die zuvor vorgestellten Ergebnisse für PMI-Partikeln nochmal im Kontext betrachtet. Dabei erwies sich sowohl für die HeLa-Zellen als auch für die hMSCs, dass die meisten Partikel eine geringe bis keine zelluläre Aufnahme zeigen. Eine gute Aufnahme konnte nur für wenige Nanopartikel (vor allem für die kristallinen Nanopartikel) verzeichnet werden. Eine Korrelation zwischen der Aufnahmeeffizienz und der Zytotoxizität konnte nicht nachgewiesen werden. rn

Development of a system measuring adhesion forces in powder collectives

Fine powders commonly have poor flowability and dispersibility due to interparticle adhesion that leads to formation of agglomerates. Knowing about adhesion in particle collectives is indispensable to gain a deeper fundamental understanding of particle behavior in powders. Especially in pharmaceutical industry a control of adhesion forces in powders is mandatory to improve the performance of inhalation products. Typically the size of inhalable particles is in the range of 1 - 5 µm. In this thesis, a new method was developed to measure adhesion forces of particles as an alternative to the established colloidal probe and centrifuge technique, which are both experimentally demanding, time consuming and of limited practical applicability. The new method is based on detachment of individual particles from a surface due to their inertia. The required acceleration in the order of 500 000 g is provided by a Hopkinson bar shock excitation system and measured via laser vibrometry. Particle detachment events are detected on-line by optical video microscopy. Subsequent automated data evaluation allows obtaining a statistical distribution of particle adhesion forces. To validate the new method, adhesion forces for ensembles of single polystyrene and silica microspheres on a polystyrene coated steel surface were measured under ambient conditions. It was possible to investigate more than 150 individual particles in one experiment and obtain adhesion values of particles in a diameter range of 3 - 13 µm. This enables a statistical evaluation while measuring effort and time are considerably lower compared to the established techniques. Measured adhesion forces of smaller particles agreed well with values from colloidal probe measurements and theoretical predictions. However, for the larger particles a stronger increase of adhesion with diameter was observed. This discrepancy might be induced by surface roughness and heterogeneity that influence small and large particles differently. By measuring adhesion forces of corrugated dextran particles with sizes down to 2 µm it was demonstrated that the Hopkinson bar method can be used to characterize more complex sample systems as well. Thus, the new device will be applicable to study a broad variety of different particle-surface combinations on a routine basis, including strongly cohesive powders like pharmaceutical drugs for inhalation.

Evaluation of polymeric nanocarriers for RNA delivery

Therapeutic RNAs, especially siRNAs, are a promising approach for treating diseases like cancer, neurodegenerative disorders and viral infections. Their application, however, is limited due to a lack of safe and efficient delivery systems. Nanosized carriers with the ability to either complex or entrap RNA species are a promising option. rn rn rnSuch a carrier has to meet a lot of requirements, some of which are even partly contradictive. Understanding and controlling the interplay between the different demands would advance a strategic design at an early stage of therapeutic development. rn rn This work is centered around a systematic evaluation of polyplexes, such carriers that are able to complex siRNA due to electrostatic interactions. Six structurally and chemically diverse candidates, poly-L-lysine brushes, block copolymers, cationic peptides, cationic lipids, nanohydrogels, and manganese oxide particles, were tested in a simultaneous fashion. The assays, mostly based on fluorescently labeled siRNA, ranged from the evaluation of polyplex formation and stability to in vitro parameters like cellular uptake and knockdown capability. The analysis from several perspectives offered insight into the interplay between the specifications of one polyplex. Assessing the different carriers under exactly the same experimental conditions also allowed conclusions about favourable traits and starting points for further optimization. This comparative approach also revealed weaknesses of some of the conventional protocols, which were therefore contrasted with alternative methods. In addition, in vitro knockdown assays were optimized and the impact of fluorescently labeled siRNA on knockdown efficiency was assessed. rn rn rn A second class of carriers, which share the ability to entrap siRNA inside their matrix, are briefly addressed. Nanocapsules, dextran particles and liposomes were assessed for basic features like siRNA encapsulation and knockdown capability. rn rn rn rn In an approach towards targeted delivery of RNA, liposomes were endowed with mitochondriotropic tags. Despite successful functionalization, no colocalization between the liposomal cargo and mitochondria was so far observed, which makes further optimization necessary.